余自層 郭楊 馬勇, 潘婭嵐 韓秋革 肖吉日木圖 劉孟敏

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023

3.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合護(hù)理研究所，江蘇 南京 210023

4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

蒙醫(yī)藥作為祖國(guó)醫(yī)藥的一部分，在防治骨質(zhì)疏松方面有其特有的經(jīng)驗(yàn)及療效。蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松癥歸屬“骨赫依病、骨枯癥”范疇。原因在于三根“赫依、希拉、巴達(dá)干”失衡，七素“食物精華、血、肌肉、脂肪、骨骼、骨髓、精”清濁代謝紊亂，從而導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降，形成骨枯癥[1]。蒙藥那仁滿都拉又名升陽十一味丸，出自《至高要方》，是內(nèi)蒙地區(qū)常用復(fù)方之一，由石榴、肉桂、益智仁、蓽茇、紅花、小蜀季、玉竹、黃精、天門冬、蒺藜、天花粉組成，現(xiàn)已收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-蒙藥分冊(cè)》。其具有增強(qiáng)胃火、促消化、補(bǔ)腎壯陽、促進(jìn)清濁代謝、抑制骨枯、赫依病等功效[2]，常用于痞病、水腫、遺精、腰痛、寒瀉、骨痛等寒性病癥。長(zhǎng)期臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)那仁滿都拉可緩解骨質(zhì)疏松引起的疼痛，增加骨量，但其作用機(jī)制尚不完全清楚[3]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展受多種通路影響，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路是骨生長(zhǎng)、發(fā)育中的經(jīng)典通路[4]；Wnt通路可促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，抑制破骨細(xì)胞的分化，在平衡骨生成與骨代謝中至關(guān)重要[5]。Wnt蛋白與其受體結(jié)合通過增加β-catenin蛋白的表達(dá)，減緩成熟成骨細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而緩解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展[6]?；诖?，本研究構(gòu)建去卵巢大鼠和成骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察蒙藥那仁滿都拉對(duì)大鼠骨密度，骨病理切片、骨骼力學(xué)及Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響；通過體外實(shí)驗(yàn)觀察蒙藥那仁滿都拉含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞ALP分泌、礦化及Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響。探索那仁滿都拉防治骨質(zhì)疏松癥的作用及機(jī)制，為后續(xù)蒙醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物：2月齡SPF級(jí)SD雌鼠共30只，體重為(250±15)g，動(dòng)物合格證書：SCXK(浙) 1019-0002(南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)：A200904)；1日齡SPF級(jí)SD雌鼠共5只，體重為(10±5)g，動(dòng)物合格證書：SCXK(滬)2018-0004，由南京江寧區(qū)青龍山動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2試劑：蒙藥那仁滿都拉丸(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z15020446)；堿性磷酸酶顯色試劑盒、礦化染色試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司)；兔抗大鼠Wnt單克隆抗體(貨號(hào)：AF5315)購(gòu)于美國(guó)Affinity公司、兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體(貨號(hào)：51067-2-AP)購(gòu)于中國(guó)Proteintech公司、山羊抗兔IgG(貨號(hào)：GB23303)購(gòu)于中國(guó)賽維爾生物科技有限公司；切片石蠟、HE染液、脫鈣液、二甲苯、多聚甲醛購(gòu)于中源葉生物有限公司。

1.1.3儀器：倒置熒光顯微鏡DMI3000B型(德國(guó)Leica)；生物力學(xué)測(cè)試系統(tǒng)Acumen3型(美國(guó) MTS)；小動(dòng)物Micro-CT成像系統(tǒng)Quantum GX型(美國(guó)PerkinElmer)；全自動(dòng)硬組織切片機(jī)RM2265型(德國(guó) Leica)；全自動(dòng)組織染色機(jī)YD-700型(金華益迪)；全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)Trans-Blot Turbo(美國(guó) Bio-Rad)。

1.2 動(dòng)物模型制備及取材

所有大鼠隨機(jī)分為5組(假手術(shù)組、模型組、蒙藥低劑量組、蒙藥中劑量組、蒙藥高劑量組)，選用異氟烷吸入式麻醉后，模型組與用藥組于脊柱兩側(cè)旁開約1 cm處行2 cm左右的切口，逐層剪開后找出卵巢，行卵巢切除手術(shù)，逐層縫合。假手術(shù)組行切開皮膚縫合手術(shù)。術(shù)后3 d傷口涂抹青霉素軟膏預(yù)防傷口感染。8周后檢測(cè)骨密度相關(guān)指標(biāo)驗(yàn)證造模成功與否。

分組及取材：假手術(shù)組與模型組用生理鹽水灌胃，每天2 mL；蒙藥低劑量組按照0.2 g/(kg·d)，每天2 mL；蒙藥中劑量組按照0.4 g/(kg·d)，每天2 mL；蒙藥高劑量組按照0.8 g/(kg·d)，每天2 mL。連續(xù)12周后，麻醉后取雙側(cè)股骨液氮中保存。

1.3 Micro-CT、骨骼力學(xué)檢測(cè)

采用Micro-CT技術(shù)觀察大鼠骨結(jié)構(gòu)和礦物質(zhì)變化。應(yīng)用微CT成像系統(tǒng)(Analyze12)進(jìn)行CT掃描和小梁形態(tài)分析?？臻g分辨率為9 μm (X射線源80 kv，384 μA；用1 mm濾鏡)掃描右側(cè)股骨標(biāo)本。然后分別用內(nèi)置軟件CT-vox和CTAn重建CT圖像。將左側(cè)股骨標(biāo)本提前從生理鹽水取出，使用鑷子將標(biāo)本放置在生物力學(xué)測(cè)試儀上，調(diào)整跨距與加載速度分別為1.5 cm、0.01 mm/s，直至股骨最終斷裂為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。儀器所記載的載荷-位移曲線，計(jì)算出最大負(fù)荷、最大撓度和剛度[7]。

1.4 HE染色

右側(cè)股骨4%多聚甲醛固定48 h后，生理鹽水沖洗4次，每次15 min，放入EDTA脫鈣液中，置于室溫中脫鈣6周，直至1 mL注射針頭能刺穿股骨后停止脫鈣。隨后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、儀器切片等步驟，按HE染色步驟染色后，顯微鏡下觀察骨形態(tài)變化[8-9]。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

各組細(xì)胞及組織Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)差異，第3代細(xì)胞以2×106/mL接種于6孔板，含藥血清干預(yù)培養(yǎng)2 d，提取細(xì)胞總蛋白，以BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定樣本蛋白濃度，加入上樣緩沖液定量分裝，95 ℃煮沸10 min使蛋白變性，預(yù)制膠電泳后PVDF轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉15 min，TBST清洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)的一抗(Wnt、β-catenin)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次。加入兔抗大鼠二抗孵育1.5 h，TBST洗膜4次，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)不同樣品相應(yīng)蛋白表達(dá)情況。

1.6 成骨細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

將乳鼠浸泡于75%乙醇5 min，無菌條件下取出顱骨，置于3%雙抗的PBS溶液中剔除筋膜組織，剪碎骨片，0.25%的胰酶培養(yǎng)箱中消化30 min，全陪終止消化，離心(1 000 r/5 min)后去上清加入0.1%一型膠原酶，恒溫震蕩箱(37 ℃，80 r/h)4 h，70 μm濾網(wǎng)去除骨碎片后離心(1 000 r/5 min)去上清，PBS沖洗一遍，全培接種于T25培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞匯合度到90%左右時(shí)，0.25%胰酶消化1.5 min后全陪終止消化，離心(1 000 r/5 min)，去上清加入全陪傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 含藥血清的制備

蒙藥那仁滿都拉丸(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z15020446)蒙藥低劑量組按照0.2 mg/(kg·d)，每天2 mL。蒙藥中劑量組按照0.4 mg/(kg·d)，每天2 mL；蒙藥高劑量組按照0.8 mg/(kg·d)，每天2 mL?？瞻捉M灌胃生理鹽水2 mL。共4組每組3只，連續(xù)給藥3 d，末次灌胃2 h后用2.5%的戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4度靜置2 h后離心(3 500 r/min，10 min)，取上層血清，0.22 μm濾膜除菌，放-80 ℃保存。

1.8 堿性磷酸酶染色、茜素紅染色

第3代細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于兩塊6孔板中貼壁后分別將10%的含藥血清加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50 μg/mL維生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+10-8mol/L地塞米松，配制誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo))，干預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞14 d，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗1 次，4%中性多聚甲醛固定15 min，其中一塊加入堿性磷酸酶染色液于室溫下避光孵育30 min，生理鹽水清洗3遍，烘箱60 ℃烘干，另一塊加入茜素紅染色液均勻覆蓋細(xì)胞，室溫染色30 min后蒸餾水充分洗滌。倒置顯微鏡下觀察并拍照。觀察各組細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)差異與礦化結(jié)節(jié)差異。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 那仁滿都拉對(duì)骨小梁及骨骼力學(xué)性能的影響

用Micro-CT結(jié)果顯示那仁滿都拉可明顯提高大鼠骨小梁密度，同時(shí)改善骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)，其中中、高劑量組效果優(yōu)于低劑量組(見圖1)；那仁滿都拉可提高骨骼力學(xué)的載荷與剛度(P<0.01，P<0.05)，但其最大位移差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

圖1 各組Micro-CT矢狀面與冠狀面二維掃描圖Fig.1 Micro-CT sagittal and coronal two-dimensional scans

表1 蒙藥那仁滿都拉對(duì)各組大鼠骨骼力學(xué)的影響Table 1 Effects of Mongolian medicine Narenmandura on the skeletal mechanics of rat groups

2.2 那仁滿都拉對(duì)骨組織病理學(xué)形態(tài)的影響

骨組織病理染色結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠骨小梁排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，空腔較??；模型組骨小梁斷裂明顯，結(jié)構(gòu)錯(cuò)亂，空腔密集；那仁滿都拉用藥組中、高劑量組可明顯改善骨小梁病理變化，與模型組相比骨小梁斷裂較少，排列較為緊密，空腔減少(見圖2)。

圖2 各組大鼠股骨組織病理染色結(jié)果(100×)Fig.2 Results of pathological staining of femoral tissues in each group (100×)

2.3 那仁滿都拉對(duì)骨組織Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot法檢測(cè)各組股骨組織中Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，模型組中Wnt、β-catenin蛋白水平較假手術(shù)組顯著減低(P<0.000 1)，而那仁滿都拉用藥組可改善這一狀況，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)(見表2、圖3)。

表2 各組大鼠Wnt及β-catenin蛋白水平檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of Wnt and β-catenin protein levels in each group

圖3 各組大鼠Wnt及β-catenin蛋白水平檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Wnt and β-catenin protein levels results in the rats

2.4 那仁滿都拉含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶及礦化的影響

各組細(xì)胞ALP染色結(jié)果顯示，正常組與含藥血清組細(xì)胞均呈紫色深染；其中高劑量含藥血清組細(xì)胞深染面積最大，陽性率明顯高于空白血清組；低、中劑量含藥血清組深染面積較空白組略有提高。說明含藥血清組均可促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP的分泌，高劑量組更明顯(見圖4A)。各組細(xì)胞在連續(xù)干預(yù)14 d后進(jìn)行礦化染色發(fā)現(xiàn)，4組細(xì)胞均有被染為橘紅色的礦化結(jié)節(jié)形成，其中那仁滿都拉含藥血清高劑量組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量較多，體積增大，提示那仁滿都拉含藥血清可以促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化(見圖4B)。

圖4 那仁滿都拉含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶分泌及礦化的影響A：堿性磷酸酶染色；B：礦化結(jié)節(jié)染色Fig.4 Effect of Narenmandula-containing serum on alkaline phosphatase secretion and mineralization of osteoblastsA： Alkaline phosphatase staining; B： Staining of mineralized nodules

2.5 那仁滿都拉含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響

比較各組含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響，因此采用Western blot法對(duì)各組進(jìn)行檢測(cè)，4組成骨細(xì)胞的Wnt、β-catenin的水平差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中含藥血清中、高劑量組Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)明顯高于空白組(P<0.000 1)(見表3、圖5)。

表3 各組成骨細(xì)胞Wnt及β-catenin蛋白水平檢測(cè)結(jié)果Table 3 The results of Wnt and β-catenin protein levels

圖5 各組成骨細(xì)胞Wnt及β-catenin蛋白水平檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Wnt and β-catenin protein levels osteoblasts

3 討論

蒙藥那仁滿都拉共有11味草藥，以石榴為君藥，肉桂、玉竹共為臣藥，三藥配伍，具有增強(qiáng)胃火，分解精微和糟粕，補(bǔ)腎健脾。佐以蓽茇、紅花、益智仁、蒺藜、黃精、天門冬、小蜀季、天花粉，以治其標(biāo)。現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蒙藥那仁滿都拉對(duì)小鼠血清中的氧自由基及脂質(zhì)過氧化物均有較強(qiáng)的清除作用，并能調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)和機(jī)體能量代謝發(fā)揮抗疲勞作用[10]。田宏等[11]發(fā)現(xiàn)蒙藥那仁滿都拉可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用治療寒盛型腎小球腎炎。復(fù)方中包含糅質(zhì)、生物堿、揮發(fā)油、多糖、黃酮類、甾類成分，均具有臨床效應(yīng)。石榴籽油及其活性化合物通過抑制破骨細(xì)胞分化和促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮骨保護(hù)作用[12-13]。從天門冬中分離出來的麥冬素，通過減少體內(nèi)的活性氧發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[14]。同時(shí)，黃精、玉竹通過調(diào)節(jié)ERK/GSK-3β/β-Catenin等信號(hào)通路，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化[15]。綜上，此復(fù)方中的各種草藥中都含有抗骨質(zhì)疏松癥的活性成分，然而復(fù)方草藥配伍比單一用藥更有效地治療骨質(zhì)疏松癥。

在本研究中，Micro-CT檢測(cè)骨小梁的結(jié)果并進(jìn)行矢狀面與冠狀面二維結(jié)構(gòu)展示，模型組的骨小梁密度遠(yuǎn)低于假手術(shù)組，表明大鼠去卵巢手術(shù)可導(dǎo)致大鼠骨小梁減少、骨質(zhì)流失，而蒙藥組均改善這一現(xiàn)象。HE染色與骨骼力學(xué)檢測(cè)也進(jìn)一步驗(yàn)證了以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示蒙藥那仁滿都拉可以顯著改善去卵巢大鼠的骨微結(jié)構(gòu)，增加骨小梁豐度，提高骨骼力學(xué)性能。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蒙藥含藥血清可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、增加ALP分泌和誘導(dǎo)鈣化結(jié)節(jié)的形成，這提示那仁滿都拉抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)可能與提高成骨細(xì)胞成熟、分化能力有關(guān)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)生物體的許多發(fā)育過程，維持組織中內(nèi)環(huán)境的平衡。有研究者發(fā)現(xiàn)，Wnt的缺失會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥假膠質(zhì)瘤，這是一種以骨量低、骨形成率低為特征的疾病，這表明Wnt蛋白在骨形成中也起著關(guān)鍵作用[16-17]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[18]。當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，β-catenin與核轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖[19]。Jin等[20]在敲除β-catenin基因的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，骨組織中I型膠原、骨鈣素的表達(dá)顯著降低，Mirco-CT顯示骨小梁減少、骨質(zhì)流失，并導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。ALP是成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志物，可以促進(jìn)骨形成和骨礦化[21-22]。ALP通過促進(jìn)成骨細(xì)胞合成新的膠原基質(zhì)，并釋放膜結(jié)合的基質(zhì)小泡來調(diào)節(jié)基質(zhì)的礦化，成骨細(xì)胞被基質(zhì)包圍后成為骨細(xì)胞[23]。實(shí)驗(yàn)研究觀察到，該方能改善骨質(zhì)疏松模型大鼠骨小梁形態(tài)，提高骨生物力學(xué)及骨密度，改善骨微環(huán)境，促進(jìn)Wnt、β-catenin蛋白的表達(dá)，具有防治骨質(zhì)疏松的作用。此外，還可促進(jìn)成骨細(xì)胞活性，增加ALP表達(dá)，促進(jìn)其礦化，提高成骨細(xì)胞Wnt、β-catenin蛋白的表達(dá)水平。因此，本研究認(rèn)為蒙藥那仁滿都拉可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松作用。

綜上所述，蒙藥那仁滿都拉在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中均具有良好的藥效，也進(jìn)一步揭示了那仁滿都拉作為一種安全有效的抗骨質(zhì)疏松藥物的潛能；同時(shí)驗(yàn)證了蒙醫(yī)“三根七素”理論指導(dǎo)下形成的那仁滿都拉，其顯著的抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)與促進(jìn)骨形成、骨再生有關(guān)，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。隨著國(guó)家對(duì)民族醫(yī)藥事業(yè)支持力度的不斷提高，以及對(duì)骨質(zhì)疏松癥的逐步重視，蒙藥的運(yùn)用與開發(fā)愈發(fā)被重視，為蒙藥那仁滿都拉的發(fā)展提供了良好的機(jī)遇。在蒙醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，針對(duì)蒙藥特性開展藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。通過結(jié)合中醫(yī)藥現(xiàn)代化的模式，探索蒙醫(yī)藥現(xiàn)代化的共性技術(shù)，開展蛋白質(zhì)組學(xué)篩選靶點(diǎn)及作用通路，為蒙藥那仁滿都拉防治骨質(zhì)疏松提供新依據(jù)。