葉子豐 戎寬 張信成 匡建軍 萬明明 許輝*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006

3.湖南省岳陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 岳陽 414000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是由于骨小梁微結(jié)構(gòu)發(fā)生退變，數(shù)量變少，厚度降低導(dǎo)致的骨密度與骨質(zhì)量降低并骨折發(fā)生率升高的骨代謝疾病[1-3]。絕經(jīng)后婦女由于雌激素水平逐漸降低，導(dǎo)致成骨細(xì)胞受到抑制，破骨細(xì)胞活躍，加速了骨溶解吸收打破原有的骨代謝平衡，誘發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[4-6]?，F(xiàn)代研究證明，PMOP的發(fā)病與骨偶聯(lián)及核因子-κB受體的活化因子RANK配體(RANKL)/骨保護(hù)蛋白軸的關(guān)系最為密切[7]。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)作為可溶性分泌分泌性糖蛋白，具有抑制骨吸收的作用，RANK則是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟的重要細(xì)胞因子，在破骨細(xì)胞與前體細(xì)胞表面可與RANKL相結(jié)合強(qiáng)刺激破骨細(xì)胞的分化、成熟并且抑制破骨細(xì)胞的凋亡[8]。PMOP在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬于“骨痿”范疇，傳統(tǒng)醫(yī)家認(rèn)為腎虛是其發(fā)病的根本病機(jī)[9]?，F(xiàn)代研究也已證明腎虛在多個(gè)途徑對骨代謝的發(fā)生產(chǎn)生影響[10-11],因此臨床中治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松應(yīng)以補(bǔ)腎為法。益腎健骨方為全國名老中醫(yī)仇湘中教授經(jīng)驗(yàn)方，既往臨床試驗(yàn)證明該方在PMOP防治中療效確切[12-13]，但尚未明確其具體作用機(jī)制，OPG/RANKL信號通路是絕經(jīng)后婦女發(fā)生發(fā)展骨質(zhì)疏松的重要途徑，為探究益腎健骨方是否調(diào)控OPG/RANKL信號通路抑制破骨細(xì)胞分化從而防治PMOP，本實(shí)驗(yàn)通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察破骨細(xì)胞的形態(tài)；Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL mRNA及蛋白含量的表達(dá)水平，研究其對OPG/RANKL/RANK信號通路作用機(jī)制，為臨床治療PMOP提供新靶點(diǎn)與新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：40只雌性未孕3月齡SD大鼠(SPF級)，體重(220±20)g。由湖南省中醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)中心采購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司(動物許可證號：SCXK(湘)2019-0004；營業(yè)執(zhí)照號碼：914301006735928721)。本次實(shí)驗(yàn)動物編號：1107272011006323。實(shí)驗(yàn)大鼠均飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院動物房開放式動物飼養(yǎng)室，室溫保持在20 ℃～25 ℃，濕度控制在50%～60%，明暗周期12 h/12 h，予標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)顆粒進(jìn)行飼料并自由飲水。

1.1.2藥物：益腎健骨方，功效為補(bǔ)肝益腎，活血健骨，藥物組成：生黃芪 15 g、活血藤 15 g、補(bǔ)骨脂 10 g、杜仲 10 g、丹參 15 g、熟地黃 25 g、川續(xù)斷 10 g、當(dāng)歸 15 g、白芍 15 g、三七 6 g、海蛤殼 10 g。上述中藥為湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑(生產(chǎn)批號：20200805；制劑批號為：湘藥制字Z20080783)。阿侖膦酸鈉片(北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司，國字標(biāo)準(zhǔn)號：H20059029 成人用量每日1次，每次1粒；規(guī)格10 mg/粒)。

1.1.3試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)基(Sigma，貨號：D5796-500 ML)；青霉素-鏈霉素溶液、胰酶細(xì)胞消化液(碧云天生物技術(shù)公司，批號分別為：C0222、C0205)；胎牛血清(GIBICO公司，批號：04-001-1ACS)；PBS緩沖液(Hyclone，批號：SH30 256.01)；M-CSF(abcam，批號：ab269198)；RANKL抑制劑(Peprotech，批號：400-30-2)；OPG、RANKL試劑盒(武漢華美生物工程有限公司；批號：P05031576、P05031576)；蘇木素、伊紅染液(上海威奧生物科技有限公司，批號：C200501、C200702)。

1.1.4主要儀器：流式細(xì)胞儀(FACSVE RSE，美國BD)；酶標(biāo)儀(山東恒美電子科技有限公司)；BA210 T型顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；TS-1型搖床(上海浦矛工業(yè)科技有限公司)；總蛋白測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號：121135)；Transwell小室(Corning,美國)。

1.2 方法

1.2.1動物模型的制備：40只SD大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為去卵巢組(n=30)與假手術(shù)組(n=10)。切除30只去卵巢組大鼠雙側(cè)卵巢，建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，其余10只假手術(shù)組大鼠做同樣的切口，但僅切除少量脂肪。手術(shù)后大鼠均肌肉注射青霉素20×104U，1天1次，并予傷口換藥，連續(xù)3 d，避免感染。術(shù)后8周后結(jié)合骨密度與觀察大鼠行為學(xué)驗(yàn)證造模成骨。

1.2.2給藥方法：8周驗(yàn)證造模成骨后。采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只去卵巢大鼠分為3組：實(shí)驗(yàn)組(10只)、模型組(10只)、陽性藥物對照組(10只)。計(jì)算動物灌胃給藥量，參照不同動物等效劑量折算系數(shù)，計(jì)算得出實(shí)驗(yàn)組大鼠益腎健骨方等效灌胃劑量為0.36 g/(200 g·d)，即1.8 g/(kg·d)，配置濃度為0.72 g/mL，1 mL/(200 g·d)。陽性對照組予阿侖膦酸鈉灌胃，濃度為1.26 mg/mL，1 mL/(200 g·d)。假手術(shù)組與模型組均予同體積蒸餾水灌胃1 mL/(200 g·d)。連續(xù)給藥3周，末次給藥結(jié)束后，監(jiān)測大鼠L4-L5、雙側(cè)股骨骨密度。

1.2.3實(shí)驗(yàn)大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定：(1)BMSCs分離、培養(yǎng)：①采用托頸法處死各組SD大鼠后保持低溫環(huán)境，取SD大鼠雙側(cè)脛骨、股骨后清除表面軟組織與筋膜使骨髓腔暴露。②使用培養(yǎng)基反復(fù)沖洗暴露的骨髓腔，收集沖洗液后離心并收集沉淀的細(xì)胞，將其接種與培養(yǎng)基皿內(nèi)。③細(xì)胞增殖至90%融合時(shí)，以1∶3的比例融合并繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞再次增殖至90%融合時(shí)再進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(2)BMSCs的鑒定：①骨髓BMSCc細(xì)胞消化后，取P3代BMSCs離心處理并收集細(xì)胞。②制作細(xì)胞懸液，加入0.3 μL CD44-PE抗體與 0.5 μL CD45-FITC抗體并設(shè)置不染抗體管，放置于37 ℃避光環(huán)境中孵育30 min；1 000 r/min，37 ℃，離心5 min，無菌液沖洗兩遍后，制成500 μL單細(xì)胞混懸液。③采用流式細(xì)胞儀檢測CD44、CD45表達(dá)情況。采用倒置相差顯微鏡觀測其細(xì)胞形態(tài)與生長趨勢。

1.2.4建立實(shí)驗(yàn)大鼠BMSCs與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系：采用分離骨髓單核細(xì)胞的方法獲得破骨細(xì)胞前體細(xì)胞。使用水合氯醛麻醉2周齡大鼠，摘取其體內(nèi)的脛骨與股骨后處死，暴露其骨髓腔后，使用MEMα反復(fù)沖洗收集洗液，保留細(xì)胞沉淀；之后加入大鼠淋巴細(xì)胞分離液，并在其上加已經(jīng)使用的4 mL MEMα重懸細(xì)胞沉淀，離心后吸取處于中間的白膜層細(xì)胞，使用PBS稀釋，再次離心保留其細(xì)胞沉淀，使用破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基重選細(xì)胞沉淀，將其接種于共培養(yǎng)小室的下室，并使用破骨細(xì)胞培養(yǎng)劑進(jìn)行培養(yǎng)。最后將75%～85%細(xì)胞融合的間充質(zhì)干細(xì)胞制備為細(xì)胞懸液，培養(yǎng)與Transwell上室。下室隔日換液，于第9天時(shí)使用大鼠破骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，之后每3 d換藥1次；上室則使用BMSCs培養(yǎng)液同時(shí)換液。完全培養(yǎng)劑觀察破骨細(xì)胞形態(tài)。BMSCs與破骨細(xì)胞培養(yǎng)完成后再進(jìn)行共培養(yǎng)，分為：實(shí)驗(yàn)+OC組、模型+OC組、陽性對照+OC組、假手術(shù)+OC組。

1.2.5觀察指標(biāo)與方法：(1)破骨細(xì)胞觀察。在共培養(yǎng)3、7、12、16 d后倒置于相差顯微鏡下，觀察其中的下室細(xì)胞形態(tài)。在共培養(yǎng)第12天對下室細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色(依據(jù)TRAP染色試劑盒說明進(jìn)行染色并觀察拍照)。(2)RT-PCR法檢測共培養(yǎng)體系Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG mRNA表達(dá)。細(xì)胞共培養(yǎng)2周，收集BMSCs，提取出總RNA，通過核酸分析儀檢測各樣本含量中的RNA濃度(g/L)與A260/280值。依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，提取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照要求，反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。之后將1 μL cDNA作為模板擴(kuò)增Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG和β-actin。擴(kuò)增需要條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。將β-actin作為內(nèi)參照基因，計(jì)算各目基因的2-ΔΔCt。最終比較并分析各目基因mRNA的表達(dá)水平。引物序列見表1。(3)Western blot法檢測共培養(yǎng)體系中Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG蛋白表達(dá)。細(xì)胞共培養(yǎng)2周，收集BMSCs，提取出各組總蛋白，使用BCA法測定出蛋白濃度之后，按每孔30 μg上樣，SDS-PAGE凝膠電泳；使用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，在室溫中封閉1 h后；一抗孵育(Wnt10b，1∶1 000；β-catenin，1∶1 000；RANKL，1∶1 000；OPG，1∶1000；β-actin，1∶2 000)，放置于4 ℃環(huán)境中孵育過夜；第二天分別使用抗小鼠抗體或羊抗兔室溫孵育1 h；最后參照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中說明書步驟凝膠成像儀下顯影并拍照。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠L4-L5、雙側(cè)股骨骨密度檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，其余三組骨密度結(jié)果明顯減少，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組L4-L5骨密度、雙側(cè)股骨骨密度明顯升高(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組比較，L4-L5骨密度、雙側(cè)股骨骨密度比較無明顯改變(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠骨密度結(jié)果Table 2 Bone mineral density results of each group g/cm2)

2.2 各組破骨細(xì)胞鑒定、形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)

采用TRAP染色鑒定破骨細(xì)胞是否形成，如圖1，染色成紅色，則為破骨細(xì)胞，顯微鏡下提示，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間越長，細(xì)胞逐漸融合，可觀察到偽足，多核細(xì)胞，并且在培養(yǎng)一周后出現(xiàn)極值。各組比較，模型+OC組最早出現(xiàn)多核細(xì)胞且數(shù)量最多，凋亡時(shí)間越晚；其次是陽性對照組+OC組，再者為實(shí)驗(yàn)+OC組，最后為假手術(shù)+OC組。見表3，圖2、3。

圖1 Trap染色結(jié)果Fig.1 The Trap staining results

圖2 各組破骨細(xì)胞形態(tài)A：模型組，B：假手術(shù)組，C：實(shí)驗(yàn)組，D：陽性對照組Fig.2 Osteoclast morphologyA： Model group, B： Sham operation group, C： Experimental group, D： Positive control group

表3 破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 3 Osteoclast counting

2.3 各組共培養(yǎng)體系中Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG mRNA表達(dá)情況

3 各組破骨細(xì)胞數(shù)目A：模型組，B：假手術(shù)組，C：實(shí)驗(yàn)組，D：陽性對照組Fig.3 Osteoclast numberA： Model group, B： Sham operation group, C： Experimental group, D： Positive control group

與假手術(shù)+OC組相比，模型+OC組Wnt10、

β-catenin、OPG mRNA表達(dá)顯著降低，RANKL mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型+OC組相比，陽性對照+OC組、實(shí)驗(yàn)+OC組Wnt10、β-catenin、OPG mRNA表達(dá)水平均升高，RANKL mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示經(jīng)兩組藥物治療后，破骨細(xì)胞增殖分化受到抑制。陽性對照+OC組與實(shí)驗(yàn)+OC組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組Wnt10b/β-catenin、OPG/RANKL mRNA的表達(dá)情況Fig.4 Expressions of Wnt10b/β-Catenin and OPG/RANKL mRNA in each group注：與模型+OC組比較，#P<0.05；與陽性對照+OC組比較，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)+OC組比較，&P>0.05；與假手術(shù)+OC組比較，^P<0.05。

2.4 各組共培養(yǎng)體系中Wnt10b/β-catenin、OPG/RANKL蛋白的表達(dá)情況

與假手術(shù)+OC組相比，模型+OC組Wnt10、β-catenin、OPG蛋白表達(dá)顯著降低，RANKL蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型+OC組相比，陽性對照+OC組、實(shí)驗(yàn)+OC組Wnt10、β-catenin、OPG蛋白表達(dá)水平均升高，RANKL蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示經(jīng)兩組藥物治療后，破骨細(xì)胞增殖分化受到抑制。陽性對照+OC組與實(shí)驗(yàn)+OC組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、6。

圖5 各組Wnt10b/β-catenin、OPG/RANKL蛋白表達(dá)Fig.5 Expressions of Wnt10b /β-Catenin and OPG / RANKL proteins in each group注：與模型+OC組比較，#P<0.05；與陽性對照+OC組比較，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)+OC組比較，&P>0.05；與假手術(shù)+OC組比較，^P<0.05。

圖6 各組Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG蛋白電泳圖Fig.6 Wnt10b, β-catenin, RANKL, and OPG L protein electrophoresis

3 討論

我國是人口老齡化大國，隨著老齡化的逐年攀升，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也逐年上漲，其中又以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松最為常見，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為PMOP屬骨痿范疇，并認(rèn)為其為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛多涉及腎、脾、肝；標(biāo)識則為血瘀。益腎健骨方為全國名老中醫(yī)仇湘中教授抗骨痿經(jīng)驗(yàn)方。方中杜仲、熟地黃為君，杜仲入肝腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨的作用，熟地黃，性微溫，能填精益髓，養(yǎng)血滋陰。杜仲、熟地共用，共起陰陽同補(bǔ)，填精益髓之效。補(bǔ)骨脂溫腎助陽，續(xù)斷補(bǔ)益肝腎為臣藥，黃芪、丹參益氣補(bǔ)血，血為氣之帥，氣血生化有源則氣血通暢，脈道流利共為臣藥；活血藤活血通絡(luò)、海蛤殼軟堅(jiān)散結(jié)；當(dāng)歸活血補(bǔ)血、白芍柔肝養(yǎng)血均為佐藥；三七散瘀止痛，為佐使，共湊補(bǔ)益肝腎，活血健骨的作用。

在正常的生理周期中，骨代謝周期中的骨吸收與骨形成保持動態(tài)的平衡，若出現(xiàn)某種因素使原本處于正常動態(tài)平衡的骨代謝被打破，則出現(xiàn)骨吸收大于骨形成的病理狀態(tài)，造成骨量的流失[14-15]。近年來國內(nèi)外研究提示OPG/RANKL信號軸是絕經(jīng)后婦女發(fā)生、發(fā)展骨質(zhì)疏松的重要路徑之一，若OPG/RANKL信號調(diào)控因子表達(dá)正常，則骨代謝保持平衡。OPG是具有抑制骨吸收，增加骨皮質(zhì)、骨松質(zhì)面積、密度和骨強(qiáng)度的重要細(xì)胞因子，并且可競爭性地與RANKL結(jié)合調(diào)節(jié)骨代謝信號通路達(dá)到抑制骨吸收，維持骨代謝動態(tài)平衡的作用[16]。RANKL是激活破骨細(xì)胞的重要細(xì)胞因子，當(dāng)與破骨細(xì)胞表面的RANK相結(jié)合會促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化與凋亡。Wnt信號通路在調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用[16]。其中β-cetenin在細(xì)胞發(fā)育階段的骨穩(wěn)態(tài)即產(chǎn)生影響；Wnt10b可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化而維持骨穩(wěn)態(tài)，是骨形成的內(nèi)緣調(diào)節(jié)劑[17-18]?，F(xiàn)代研究證明，Wnt信號通路不僅可促進(jìn)BMSCs細(xì)胞的分化發(fā)育，并且還可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，通過上調(diào)OPG/RANKL的比例影響破骨細(xì)胞的功能[19]。權(quán)禎等[20]研究認(rèn)為可從“肝主筋，腎主骨”理論闡述OPG/RANKL信號通路，提出肝腎同補(bǔ)則可強(qiáng)化筋骨力學(xué)，穩(wěn)定其機(jī)械性能，從而增加OPG/RANKL信號通路的內(nèi)緣穩(wěn)定性，產(chǎn)生骨保護(hù)作用；宋昕等[21]研究發(fā)現(xiàn)OPG/RANKL信號通路與腸道菌群密切相關(guān)，當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，OPG/RANKL信號通路將被激活，使PMOP患者骨代謝出現(xiàn)異常，炎性指標(biāo)升高；張峻瑋等[22]通過骨碎補(bǔ)對BMSCs與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論骨碎補(bǔ)可調(diào)節(jié)BMSCs細(xì)胞中的OPG、RANKL表達(dá)激活OPG/RANKL信號通路抑制破骨細(xì)胞分化與成熟，證明BMSCs與OPG/RANKL信號通路密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過BMSCs細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)的方式探討益腎健骨方防治PMOP的作用機(jī)制，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞共培養(yǎng)是更為合適的細(xì)胞培養(yǎng)方式，可最大程度地模擬細(xì)胞生長時(shí)的微環(huán)境，進(jìn)而更好地評價(jià)細(xì)胞的生物學(xué)行為[23]，當(dāng)BMSCs在無或低濃度破骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子情況下，BMSCs與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的共培養(yǎng)可加速破骨細(xì)胞的形成[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，益腎健骨方可通過調(diào)節(jié)BMSCs抑制破骨細(xì)胞的形成，同時(shí)通過升高OPG、Wnt10b、β-catenin蛋白及mRNA，降低RANKL蛋白及mRNA的表達(dá)，激活OPG/RANKL與Wnt/β-catenin信號通路，預(yù)防破骨細(xì)胞的分化與成熟，影響骨代謝從而防治PMOP。

綜上所述，益腎健骨方可抑制破骨細(xì)胞的形成，提升骨質(zhì)量，調(diào)節(jié)骨吸收與骨形成的動態(tài)平衡從而防治PMOP，其作用機(jī)制可能與干預(yù)了Wnt信號通路與OPG/RANKL系統(tǒng)密切相關(guān)，但實(shí)驗(yàn)過程中的OPG、RANKL在發(fā)生變化時(shí)是否由其他機(jī)制協(xié)同作用尚未明確，其中具體的分子機(jī)制也尚未完全明確，有待進(jìn)一步深入研究。