薛東明 慧芳 孫天霞 姜英男 趙雨

長春中醫(yī)藥大學人參科學研究院，吉林 長春130117

胸腺素是一種淋巴生成因子，由Goldstein等[1]在1966年從小牛胸腺組織中分離提取出來。它廣泛存在于各個組織器官中，根據(jù)其等電點的不同分為3種[2-3](α、β和γ)。其中Tβ4是由43個氨基酸組成，分子質(zhì)量為4921Da的β族胸腺素。Tβ4的主要功能是通過與G-actin結合調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合和解聚[4-8]，在維持細胞骨架的動態(tài)平衡中起重要作用。以這個功能為基礎，Tβ4在生物體中行使各種生物學功能，如促進血管生長、修復受損心肌細胞和創(chuàng)面、抗纖維化和神經(jīng)保護作用等。

研究顯示，Tβ4具有促進骨再生及骨生成的作用。將Tβ4應用于大鼠拔牙創(chuàng)面后，一些成骨相關細胞因子的表達增高，可觀察到骨小梁增多[9]。除此之外，Tβ4可以通過上調(diào)成骨相關細胞因子的表達來修復大鼠顱骨缺損，促進骨折端骨痂的形成與礦化[10-11]。在鼠齒上皮細胞敲除Tβ4后發(fā)現(xiàn)，Tβ4可通過激活Smad與PI3K/Akt通路激活Runx2的上游啟動子，增加Runx2的表達量，促進牙齒發(fā)育[12]；另一方面，Tβ4可通過促進新生血管形成來調(diào)控骨再生和骨生成[13-14]。

根據(jù)前期實驗對梅花鹿鹿茸初生期、快速生長期和骨化期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的分析結果，發(fā)現(xiàn)Tβ4基因在3個時期高度表達，根據(jù)該基因表達情況和鹿茸的快速生長特性，推測Tβ4基因?qū)趋赖纳L也有著影響作用。

本研究為了系統(tǒng)評價梅花鹿胸腺素Tβ4在骨發(fā)育中的作用，體外合成梅花鹿胸腺素Tβ4蛋白。使用梅花鹿胸腺素Tβ4蛋白處理小鼠成骨細胞(MC3T3細胞)后進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出骨發(fā)育相關基因和通路，為闡明梅花鹿胸腺素Tβ4蛋白對成骨細胞活性的影響及其機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(武漢博士德生物，AR1160-500)，MC3T3小鼠成骨細胞(由本實驗室保存)，梅花鹿源胸腺素Tβ4蛋白(生工生物公司合成)，Trizol試劑盒(北京全式金生物，ER501-01)，DMEM培養(yǎng)基(上海Vivacell公司，01-052-1ACS)，牛血清(上海Vivacell公司，04-001-1ACS)，雙抗(上海Vivacell公司，03-031-1BCS)，酶標儀(Infnite 200 PRO plate reader，Life Sciences，USA)。

1.2 方法

1.2.1梅花鹿胸腺素β4蛋白的合成及鑒定：本研究采用Fmoc固相合成法合成梅花鹿胸腺素β4蛋白，首先將肽鏈的C-端氨基酸的羥基通過共價鍵與Wang樹脂相連，再進行脫氨基保護基反應，接長肽鏈。經(jīng)過“縮合-洗滌-去保護-中和和洗滌-下一輪縮合”等步驟的重復，將肽鏈延伸至目標長度。最后，從Wang樹脂上將目標肽鏈裂解下來，對純化后得到的目的多肽進行鑒定。

1.2.2細胞活性檢測：取對數(shù)生長期的MC3T3細胞，調(diào)整細胞懸液的濃度為5×104個/mL，將100 μL細胞懸液加入到96孔板中。培養(yǎng)4 h后，加入稀釋好的Tβ4藥液，對照組加入不含藥物的等體積培養(yǎng)基。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。棄培養(yǎng)基，加入90 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK8試劑，反應25 min。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算細胞存活率。

1.2.3mRNA文庫構建：以8 μg total RNA起始量建庫。利用mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫構建試劑盒(Hieff NGSTMMaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina?)中分離磁珠分離mRNA，并合成雙鏈cDNA、末端補平、3’端加A、連接index接頭。根據(jù)測得的片段大小，使用分選磁珠純化文庫擴增產(chǎn)物。對檢測合格的文庫利用Illumina平臺進行高通量測序。

1.2.4基因表達分析及差異基因的篩選與富集：一個基因的表達水平反映了該基因轉(zhuǎn)錄本的豐度情況，本研究使用Salmon[15]計算基因的表達量。使用DESeq2(V1.6.3)[16]軟件進行基因的差異分析，將獲得的所有差異基因比對到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，通過超幾何檢驗進行GO和KEGG功能富集分析。

1.2.5實時熒光定量PCR分析：對提取的細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄后，隨機選擇4個基因進行qRT-PCR以檢驗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性，根據(jù)2-ΔΔCT法進行相對定量分析，引物序列見表1。

1.2.6蛋白互作網(wǎng)絡(PPI)構建及Hub基因篩選和富集：使用 STRING 數(shù)據(jù)庫(https：//cn.string-db.org/)預測差異基因的PPI網(wǎng)絡，分析蛋白質(zhì)之間的功能性相互作用有助于闡明梅花鹿Tβ4促成骨細胞增殖的機制。導出 STRING 數(shù)據(jù)庫構建的差異基因PPI網(wǎng)絡至Cytoscape軟件，使用cytohubba和BiNGO插件篩選中樞基因(hubgene，Hub)并對其進行GO富集分析。Hub基因的KEGG富集分析使用了在線軟件DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)。

2 結果

2.1 合成多肽的質(zhì)譜鑒定分析

本研究采用LC-MS對多肽進行質(zhì)譜分析，結果見圖1。可以看出合成多肽的分子量為4 964.40，與梅花鹿胸腺素β4的理論分子量4 963.426一致，證明合成多肽即為目的產(chǎn)物。

圖1 合成Tβ4蛋白質(zhì)譜鑒定圖Fig.1 Synthetic Tβ4 protein mass spectrum identification diagram

2.2 細胞活性檢測

使用不同濃度Tβ4蛋白處理成骨細胞后48 h，檢測各組細胞的活性。如圖2所示，Tβ4蛋白處理后的成骨細胞存活率明顯高于對照組細胞，且差異具有統(tǒng)計學意義。在使用濃度為150 μg/mL的Tβ4蛋白處理細胞時，促進細胞生長的效果最明顯(P<0.001)。說明Tβ4蛋白處理成骨細胞后顯著促進了細胞的增殖活性(表2)。

表2 不同濃度Tβ4蛋白處理成骨細胞48 h后細胞吸光度Table 2 Cell absorbance of osteoblasts treated with different concentrations of Tβ4 liquid for 48 h

圖2 不同濃度Tβ4藥液對成骨細胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Tβ4 liquid on the survival rate of osteoblasts

2.3 qRT-PCR驗證

為檢驗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是否準確、可信，隨機選取4個差異基因進行qRT-PCR檢測。結果表明qPCR測定結果與轉(zhuǎn)錄組測序結果得到的差異基因表達變化趨勢一致(圖3)，表明本研究中轉(zhuǎn)錄組測序得到的數(shù)據(jù)是可信的。

圖3 轉(zhuǎn)錄組測序結果的qRT-PCR驗證Fig.3 qRT-PCR verification of transcriptome sequencing results

2.4 樣本間相關性及差異基因富集分析

為了后續(xù)的差異基因分析對各組進行了相關性分析，根據(jù)圖4可以看到組內(nèi)及組間樣品的相關性，兩組樣本的組內(nèi)皮爾森系數(shù)較高，組內(nèi)重復性好。兩組樣品的組間皮爾森相關系數(shù)為0.932 1～0.889 1，表明兩組樣品間存在差異，可以用于后續(xù)差異基因的分析。

圖4 樣本間相關性分析熱圖Fig.4 The heat map of inter-sample correlation analysis

本研究以P<0.05且|Log2FC|≥2為篩選條件，以差異基因的P值及Log2FC值為輸入數(shù)據(jù)，繪制火山圖，Tβ4處理組和對照組的差異基因篩選結果如圖5，相對于對照組，Tβ4處理組共獲得差異基因6 106個，其中1 979個基因為上調(diào)，4 127個基因為下調(diào)。

圖5 差異基因火山圖Fig.5 Volcano map of differential genes

對差異基因的GO和KEGG富集分析結果以校正后的P<0.05作為閾值，滿足此條件的GO條目及KEGG通路存在顯著富集的情況，選擇富集程度最高的前30個GO條目及KEGG通路進行繪圖。富集結果如圖6，可以看出富集程度較大的GO功能包括細胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、肽基-酪氨酸磷酸化的正調(diào)控和蛋白酪氨酸激酶活性的正調(diào)控等。

圖6 差異基因GO及KEGG功能富集散點圖Fig.6 Scatter plot of functional enrichment of differential genes go and KEGG注：縱軸為功能名稱，橫軸為Rich Factor，Rich factor的值越大，則富集的程度越大，圖中點的大小則表示富集到的差異基因個數(shù)，點越大，富集到的差異基因越多。

差異基因的KEGG富集中富集程度較大的信號通路包括甾體生物合成、核黃素代謝和萜類骨架生物合成等。

2.5 促成骨細胞增殖候選基因及通路的篩選

將差異基因篩選條件設置為|Log2FC|≥2，Q值<0.001且表達量>5，繼續(xù)篩選促進成骨細胞增殖候選基因，共獲得60個差異基因，其中39個基因顯著上調(diào)，21個基因顯著下調(diào)。

利用STRING數(shù)據(jù)庫構建60個差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡，節(jié)點數(shù)為59，邊數(shù)為414；平均節(jié)點度為14，平均局部聚類系數(shù)為0.709。

使用Cytoscape軟件中的cytohubba插件進一步篩選Hub基因，差異基因中前10位的Hub基因包括CDK1、PLK1、CDC20、BUB1B、BUB1、RRM2、MAD2L1、NCAPG、NCAPH、FEN1(表3)。

表3 Hub基因表達量Table 3 The expression level of Hub gene

采用Cytoscape軟件中的BINGO插件對篩選到的Hub基因進行GO富集，構建GO富集的生物學過程有向無環(huán)圖。結果顯示，富集程度較高的GO條目為：細胞周期的正調(diào)控、有絲分裂細胞周期的調(diào)節(jié)、細胞分解代謝過程的正向調(diào)節(jié)、細胞周期過程的調(diào)節(jié)和細胞周期過程的正調(diào)控等。

通過在線軟件DAVID對Hub 基因進行KEGG通路分析，結果發(fā)現(xiàn)有7個候選基因富集到了細胞周期和p53信號通路中(表4)。分別為CDC20(細胞分裂周期分子20)、PLK1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)、CDK1(細胞周期蛋白依賴性激酶1)、BUB1B(有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BUB1β)、BUB1(有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BUB1)、MAD2L1(有絲分裂紡錘體組裝檢查點蛋白MAD2A)、RRM2(核糖核苷二磷酸還原酶亞基M2)。

表4 Hub基因KEGG富集分析Table 4 KEGG enrichment analysis of Hub genes

3 討論

細胞可以通過完成細胞周期來產(chǎn)生新的細胞，實現(xiàn)細胞增殖[17-18]。細胞周期是一系列嚴格調(diào)控的分子事件，控制DNA復制和有絲分裂，對調(diào)控細胞增殖和生長具有重要作用。

為了研究梅花鹿胸腺素Tβ4對骨發(fā)育的作用，本研究使用體外合成的梅花鹿Tβ4蛋白處理MC3T3細胞后進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出7個促進成骨細胞增殖的候選基因。其中，CDK1、BUB1B、BUB1和PLK1都是細胞周期檢查點的重要調(diào)控基因[19]，可促進細胞增殖。研究表明，CDK1通過結合周期蛋白A/B形成A/B-CDK1來促進通過G2進入M期[20]。BUB1和BUBR1是紡錘體組裝有絲分裂檢查點(SAC)的核心組成部分[21]，同時也是PLK1的受體。PLK1在真核細胞內(nèi)表達，在有絲分裂、細胞的增殖和細胞周期的調(diào)控過程中有重要作用[22-23]，與CDK1功能相似，可促進BUB1和BUB1B磷酸化[24]，并與之結合，發(fā)揮SAC的功能[25]。PLK1的敲除會使細胞周期滯留在G2/M期[26]，因此PLK1在SAC中是不可或缺的基因。RRM2可以調(diào)控核糖核苷酸還原酶的活性，在細胞增殖及DNA合成和修復過程中起到重要作用[27]。

除促增殖作用外，CDK1還可與細胞周期調(diào)節(jié)因子 B1(cyclin B1)結合來調(diào)節(jié)線粒體p53的抗凋亡作用[28]。以上信息說明梅花鹿胸腺素Tβ4可能通過這些基因調(diào)控細胞周期信號通路和p53信號通路來促進成骨細胞增殖。

目前，對于梅花鹿胸腺素Tβ4研究較少，因此本研究以高通量測序結果為基本，基于生物信息學的預測，篩選出了促成骨細胞增殖的候選基因。根據(jù)結果預測胸腺素Tβ4有抗凋亡以及加速細胞周期促進增殖的作用，為研究成骨細胞增殖機制提供了方向。在后續(xù)工作中，需要對候選基因進行功能驗證及分析，為今后研究胸腺素對骨發(fā)育的影響提供理論和實驗基礎。