劉嬌妍 朱嘉慧 肖浩揚(yáng) 麥?zhǔn)缣? 李琳 王麗敏 唐輝武

摘要：一個(gè)未知功能的水稻（Oryza sativa L.）MYB轉(zhuǎn)錄因子Os01g0853700被克隆，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析和表達(dá)分析。結(jié)果表明，Os01g0853700與單子葉植物Os01g0853700同源蛋白具有更近的親緣關(guān)系，與雙子葉植物Os01g0853700同源蛋白具有相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。組織表達(dá)分析結(jié)果表明，Os01g0853700在水稻根、莖、葉和幼穗中均有表達(dá)，在葉片中表達(dá)水平最高。激素處理響應(yīng)表達(dá)分析結(jié)果表明，Os01g0853700對(duì)脫落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellicacid，GA）、生長(zhǎng)素（indoleaceticacid，IAA）、多效唑（paclobutrazol，PAC）等激素處理的響應(yīng)表達(dá)均達(dá)到顯著差異水平。脅迫處理響應(yīng)表達(dá)分析結(jié)果表明，Os01g0853700對(duì)低溫（4 ℃）、高溫（42 ℃）、鹽脅迫及干旱處理的響應(yīng)表達(dá)均達(dá)到顯著差異水平。由此推測(cè)，Os01g0853700可能參與水稻激素和逆境脅迫響應(yīng)。本研究結(jié)果可為后續(xù)Os01g0853700轉(zhuǎn)錄因子的功能研究提供參考。

關(guān)鍵詞：水稻；MYB轉(zhuǎn)錄因子；表達(dá)分析；植物激素；非生物脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S511.01；Q786? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）23-0028-07

MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中普遍存在，并且在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控中起著重要的作用，如細(xì)胞形態(tài)建成、次級(jí)代謝調(diào)控以及生物和非生物脅迫的應(yīng)答等。MYB轉(zhuǎn)錄因子的N端存在一類(lèi)高度保守的結(jié)構(gòu)域——R結(jié)構(gòu)域，它是一種由約50個(gè)氨基酸組成的折疊蛋白，其中包含了一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。在與DNA的結(jié)合過(guò)程中，氨基酸殘基以螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）的形式參與其中。間隔序列在每隔18個(gè)氨基酸的位置上形成1個(gè)疏水核心，對(duì)HTH構(gòu)型的維持至關(guān)重要［1-2］。MYB轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其所含的R結(jié)構(gòu)域數(shù)量分為4個(gè)亞類(lèi)。其一是含有單一R結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白，也稱(chēng)為1R-MYB/MYB-related，屬于端粒結(jié)合蛋白，對(duì)于維持染色體穩(wěn)定性具有重要作用［2］。其二是含有2個(gè)R結(jié)構(gòu)域的MYB轉(zhuǎn)錄因子亞類(lèi)，被稱(chēng)為R2R3-MYB蛋白。在植物中，這是最常見(jiàn)的一類(lèi)蛋白，在細(xì)胞分化、激素應(yīng)答、次生代謝等方面具有重要作用，此外還參與環(huán)境脅迫以及抵抗病蟲(chóng)侵害的響應(yīng)［3］。其三是含有3個(gè)R結(jié)構(gòu)域的MYB轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，該轉(zhuǎn)錄因子與真菌中的3R-MYB蛋白存在較近的同源關(guān)系，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞分化過(guò)程，參與植物對(duì)逆境的耐受性調(diào)節(jié)［4］。其四是含有4個(gè)R結(jié)構(gòu)域的MYB轉(zhuǎn)錄因子，這些蛋白擁有4個(gè)與R1/R2結(jié)構(gòu)相似的重復(fù)，因此被稱(chēng)為 4R-MYB 蛋白［5-6］。然而，這個(gè)亞類(lèi)只在諸如擬南芥、葡萄和楊樹(shù)等植物中發(fā)現(xiàn)了少數(shù)基因。目前對(duì)于這個(gè)結(jié)構(gòu)的研究還很有限，其功能尚不十分清晰［7］?？傊?，MYB轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)具有不同R結(jié)構(gòu)域數(shù)量的蛋白，它們?cè)谡{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化、激素應(yīng)答、次生代謝以及逆境響應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。每個(gè)亞類(lèi)的蛋白在功能和調(diào)節(jié)機(jī)制上都有所不同，但它們共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜而多樣化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。MYB轉(zhuǎn)錄因子參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控和調(diào)節(jié)植物對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答［8-9］。目前對(duì)水稻MYB家族基因的功能有了一定的研究，MYB轉(zhuǎn)錄因子OsPHR1、OsPHR2和OsPHR3調(diào)控水稻根的生長(zhǎng)，任何一個(gè)功能缺失均會(huì)減弱主根根毛生長(zhǎng)，而過(guò)表達(dá)任何一個(gè)則會(huì)導(dǎo)致莖部磷（P）積累［10］。OsMYB36a、OsMYB36b和OsMYB36c協(xié)同調(diào)控水稻根內(nèi)皮層木質(zhì)素沉積、凱氏帶的形成，并在根的養(yǎng)分選擇性吸收中扮演著重要角色［11］。水稻MYB家族的CTMyb1能通過(guò)結(jié)合蛋白酶基因（Rep1）啟動(dòng)子的CARE元件，參與調(diào)控赤霉素誘導(dǎo)的Rep1的表達(dá)［12］。此外，MYB轉(zhuǎn)錄因子在葉綠素降解調(diào)控和鹽脅迫響應(yīng)方面也有重要作用，OsRL3在黑暗誘導(dǎo)衰老以及鹽脅迫條件下顯著表達(dá)。同時(shí)，OsRL3的表達(dá)受脫落酸的誘導(dǎo)，且突變體osrl3對(duì)外源ABA的敏感性低于野生型。說(shuō)明MYB轉(zhuǎn)錄因子OsRL3可通過(guò)ABA信號(hào)途徑調(diào)控葉片衰老和鹽脅迫響應(yīng)［13］。OsMYB30在水稻耐冷性方面有重要作用，敲除OsMYB30基因，突變體耐冷性增強(qiáng)；過(guò)表達(dá)OsMYB30基因，突變體耐冷性減弱［14］，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)OsMYB30增強(qiáng)了稻瘟病抗性，而敲減OsMYB30會(huì)降低稻瘟病抗性，表明OsMYB30正調(diào)控免疫反應(yīng)［15］。OsMYB30還能激活木質(zhì)素和肉桂酸合成，增強(qiáng)水稻的免疫反應(yīng)，包括對(duì)真菌和細(xì)菌的抗性［16］。OsMYB22是茉莉酸信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，能直接與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因OsCEBiP的啟動(dòng)子結(jié)合，并與OsMYC2互作，協(xié)同激活OsCEBiP的表達(dá)，參與調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病菌的基礎(chǔ)抗性［17］。

盡管水稻中已有若干MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能被報(bào)道，但是該基因家族成員眾多，還有很多基因的功能依然未知。本研究鑒定到一個(gè)新的編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因Os01g0853700。通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，分析該基因的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同條件下Os01g0853700的表達(dá)模式，旨在探討Os01g0853700的蛋白結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系、Os01g0853700在正常條件以及激素和非生物脅迫條件下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究該基因的功能提供理論支持和研究方向。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

本試驗(yàn)以粳稻（Oryza sativa ssp. japonica）中花11（Zhonghua 11，ZH11）為供試材料。試驗(yàn)時(shí)間為2022年3—5月，試驗(yàn)地點(diǎn)為廣東省廣州市。

1.2 試驗(yàn)處理和取樣

1.2.1 Os01g0853700的表達(dá)模式分析取樣

水稻幼苗在自然條件下使用木村B營(yíng)養(yǎng)液［18］進(jìn)行培養(yǎng)，在水稻幼苗生長(zhǎng)至3～4葉期時(shí)，收集水稻的根組織樣品，用于Os01g0853700基因的組織表達(dá)分析。孕穗期分別取大田自然生長(zhǎng)條件下的莖、葉和幼穗（2～3 cm）組織樣品，用于Os01g0853700基因的組織表達(dá)分析。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 植物激素處理、非生物脅迫處理及取樣

1.2.2.1 植物激素處理

將在光照培養(yǎng)箱中（光照和黑暗時(shí)間均為12 h，光照時(shí)溫度28 ℃，黑暗時(shí)溫度25 ℃）培養(yǎng)至3～4葉期的水稻幼苗分別移至含有各種植物激素的木村B營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行處理。PAC、GA、IAA和ABA等激素的處理濃度為 0.01 mmol/L，除營(yíng)養(yǎng)液中加入相應(yīng)的激素外，處理時(shí)其他培養(yǎng)條件與之前的培養(yǎng)條件均一致，分別于處理后 0、1、2、8、24 h收取水稻葉片。

1.2.2.2 非生物脅迫處理

將在光照培養(yǎng)箱中（光照和黑暗時(shí)間均為12 h，光照時(shí)溫度28 ℃，黑暗時(shí)溫度25 ℃）培養(yǎng)至3～4葉期的水稻幼苗分別轉(zhuǎn)移到含有0.2 mol/L NaCl、20% PEG-6000的水培營(yíng)養(yǎng)液中，并在42 ℃和4 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，處理0、1、2、8、24 h時(shí)進(jìn)行取樣。處理時(shí)其他培養(yǎng)條件與之前的培養(yǎng)條件均一致。

1.3 RNA提取和qRT-PCR擴(kuò)增

1.3.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈合成

利用TRIzol試劑將細(xì)胞或組織破碎，并與RNA結(jié)合形成復(fù)合物，然后通過(guò)乙醇沉淀將RNA分離出來(lái)，再根據(jù)南京諾唯贊生物科技公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，R312-01）說(shuō)明書(shū)的操作步驟，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈。

1.3.2 qRT-PCR分析

根據(jù)Os01g0853700的CDS序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR特異引物MYB-F/MYB-R（表1），以水稻Actin1作為內(nèi)參基因。采用ABI PRISM 7500HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)Os01g0853700的表達(dá)量，根據(jù)南京諾唯贊生物科技公司的qRT-PCR試劑盒（Vazyme，Q711-02）說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCT計(jì)算Os01g0853700的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取Os01g0853700的編碼區(qū)和氨基酸序列。利用MEGA 7.0的ClustalW軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)，再使用近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。同時(shí)，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析工具對(duì)Os01g0853700的啟動(dòng)子序列（起始密碼子ATG上游2 000 bp的基因組序列）進(jìn)行順式作用元件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Os01g0853700基因及蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)NCBI網(wǎng)站比對(duì)分析顯示，Os01g0853700基因包含2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)全長(zhǎng)900 bp，共編碼299個(gè)氨基酸。Os01g0853700包含2個(gè)高度保守的SANT結(jié)構(gòu)域（圖1），屬于含有2個(gè)R結(jié)構(gòu)域的MYB轉(zhuǎn)錄因子亞類(lèi)、R2R3-MYB蛋白。

2.2 Os01g0853700同源蛋白序列比對(duì)及進(jìn)化分析

將Os01g0853700與其他植物的同源蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示，Os01g0853700與其他同源蛋白在47～259位之間的氨基酸高度相似（圖2）。構(gòu)建的Os01g0853700及其同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，Os01g0853700與沼生菰（Zizania palustris）的同源蛋白聚為一支，與小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、谷子（Setaria italica）和稷（Panicum miliaceum）的同源蛋白的親緣關(guān)系相對(duì)較近；與毛地黃（Digitaria exilis）、黃桐（Endospermum chinense）、大麥草（Hordeum secalinum）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）的同源蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖3）。

2.3 Os01g0853700基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分析

將Os01g0853700起始密碼子ATG上游 2 000 bp 的基因組序列設(shè)置為該基因的啟動(dòng)子序列，然后利用PlantCARE在線分析軟件對(duì)Os01g0853700的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析。結(jié)果表明，Os01g0853700的啟動(dòng)子區(qū)域存在23個(gè)脫水響應(yīng)元件、11個(gè)光響應(yīng)元件、3個(gè)低溫響應(yīng)元件、1個(gè)水楊酸響應(yīng)元件、3個(gè)熱激響應(yīng)元件、3個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的相關(guān)元件和1個(gè)脫落酸響應(yīng)元件（表2）。

2.4 Os01g0853700的表達(dá)分析

2.4.1 Os01g0853700表達(dá)模式分析

為了分析Os01g0853700的表達(dá)模式，本研究提取了ZH11苗期的根以及孕穗期的莖、葉和幼穗的總RNA，并利用qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，Os01g0853700在水稻根、莖、葉和幼穗中均有表達(dá)，但在葉片中的表達(dá)水平相對(duì)較高。

2.4.2 外源激素處理對(duì)Os01g0853700的表達(dá)影響分析

為了研究Os01g0853700對(duì)激素的響應(yīng)特征，本試驗(yàn)分別檢測(cè)不同激素處理下水稻葉片中Os01g0853700的表達(dá)水平。結(jié)果表明，脫落酸（ABA）處理后，Os01g0853700的表達(dá)水平呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)；處理24 h時(shí)，Os01g0853700的表達(dá)水平達(dá)到最低（圖5-A）。赤霉素（GA）處理2 h時(shí)，Os01g0853700的表達(dá)水平呈現(xiàn)最高狀態(tài)，隨后有所下降（圖5-B）。生長(zhǎng)素（IAA）處理后，Os01g0853700的表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；處理2 h時(shí)，Os01g0853700的表達(dá)水平達(dá)到峰值（圖5-C）。多效唑（PAC）處理后，Os01g0853700的表達(dá)量總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；在處理24 h時(shí)表達(dá)水平相對(duì)最高（圖5-D）。說(shuō)明Os01g0853700受以上4種激素誘導(dǎo)表達(dá)。

2.4.3 逆境脅迫處理對(duì)Os01g0853700基因的表達(dá)影響分析

啟動(dòng)子順式作用元件分析表明，Os01g0853700啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，推測(cè)Os01g0853700基因可能參與水稻逆境脅迫響應(yīng)。因此，對(duì)水稻幼苗進(jìn)行低溫、干旱、鹽害和高溫脅迫處理，并檢測(cè)Os01g0853700的表達(dá)變化。結(jié)果表明，低溫處理后，水稻葉片中Os01g0853700的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢(shì)，處理24 h時(shí)的表達(dá)水平達(dá)到最高（圖6-A）。

PEG-6000處理24 h時(shí)，水稻葉片中Os01g0853700的表達(dá)量達(dá)到最大值（圖6-B）。NaCl處理后，Os01g0853700的表達(dá)水平呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢(shì)，處理8 h時(shí)，Os01g0853700的表達(dá)量達(dá)到最高（圖6-C）。高溫處理后，Os01g0853700的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)，在處理24 h時(shí)表達(dá)水平最高（圖6-D）。說(shuō)明Os01g0853700的表達(dá)受低溫、高溫、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)。

3 結(jié)論與討論

MYB蛋白在多種生物中呈現(xiàn)出多種多樣的細(xì)胞功能［19-20］。本研究克隆了1個(gè)新的水稻MYB基因家族成員Os01g0853700，其編碼的氨基酸序列包含2個(gè)MYB蛋白家族典型的結(jié)構(gòu)域（圖1），具有MYB蛋白家族成員的典型基序。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，Os01g0853700轉(zhuǎn)錄因子與單子葉植物物種中MYB102同源蛋白具有更近的親緣進(jìn)化關(guān)系，與雙子葉物種中MYB102同源蛋白具有相對(duì)較遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系（圖3），形成了有明顯差異的亞類(lèi)分枝，推測(cè)MYB102蛋白在物種進(jìn)化過(guò)程中被選擇。Os01g0853700[JP+1]啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)與水稻生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件（表2），說(shuō)明Os01g0853700可能參與水稻相關(guān)細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控。

研究表明，植物的激素和非生物脅迫對(duì)MYB基因家族的調(diào)控起著重要作用［21］。以鹽脅迫為例，研究發(fā)現(xiàn)，OsMYB2基因的表達(dá)在鹽脅迫下上調(diào)，這表明OsMYB2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)鹽脅迫具有響應(yīng)能力。此外，研究還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)OsMYB2基因的水稻品種種子在ABA的誘導(dǎo)下表現(xiàn)出更高的萌發(fā)敏感性，這進(jìn)一步說(shuō)明ABA參與了水稻OsMYB2基因?qū)}脅迫的響應(yīng)機(jī)制［22］。有研究表明，編碼水稻MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的基因OsMPS也受到鹽脅迫和ABA的誘導(dǎo)，但其表達(dá)受到赤霉素和生長(zhǎng)素的抑制［23］。本研究中的植物激素響應(yīng)表達(dá)分析結(jié)果顯示，在不同激素處理（ABA、GA3、IAA、PAC）下，葉片中Os01g0853700的表達(dá)量均與對(duì)照達(dá)到顯著差異水平，這說(shuō)明Os01g0853700可能參與多種激素調(diào)控響應(yīng)（圖5）。同時(shí)，Os01g0853700的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)（圖6-C），說(shuō)明Os01g0853700可能通過(guò)上述激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與鹽脅迫響應(yīng)。MYB轉(zhuǎn)錄因子中OsMYB4、OsMYB3R-2、OsMYBS3參與水稻冷脅迫響應(yīng)［24-26］。OsMYBR1、OsMYB6參與水稻干旱脅迫響應(yīng)［27-28］。Os01g0853700的表達(dá)在低溫、高溫和干旱脅迫中出現(xiàn)顯著變化，推測(cè)Os01g0853700可能參與水稻逆境脅迫響應(yīng)（圖6）。

MYB轉(zhuǎn)錄因子在各物種細(xì)胞活動(dòng)中必不可少，本研究克隆了水稻MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因Os01g0853700，并了解其蛋白的演化關(guān)系、蛋白結(jié)構(gòu)域和保守基序、基因啟動(dòng)子順式作用元件等，鑒定了Os01g0853700的組織表達(dá)模式、激素和脅迫處理的響應(yīng)表達(dá)模式，為后續(xù)通過(guò)其他方式驗(yàn)證Os01g0853700及其同源基因的功能提供了研究方向和科學(xué)依據(jù)。

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