謝鈺珍 覃鴻妮 吳凡 胡楊曉然 薛高旭 趙雪 張勇

摘要：以控制質(zhì)?？截悢?shù)的pcnB基因與鏈霉素耐藥性rpsL基因?yàn)榘袠?biāo)基因，研究CA-NHEJ系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌的基因編輯效率，及rpsL相關(guān)基因與鏈霉素耐藥性的關(guān)系。通過CA-NHEJ系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌MG1655的pcnB和rpsL基因編輯，其中，pcnB基因編輯效率達(dá)100%，rpsL基因僅有1個(gè)克隆缺失第22～24位3個(gè)氨基酸，其他4個(gè)克隆未編輯成功但具有鏈霉素抗性；進(jìn)一步利用CA-HR系統(tǒng)敲除大腸桿菌MG1655的rpsL基因CCTGCGCTG序列（第22～24位氨基酸），編輯效率達(dá)100%，驗(yàn)證了CA-HR的高效性，抗性鑒定表明，該序列是影響鏈霉素抗性的關(guān)鍵序列，是一個(gè)未曾報(bào)道的新突變；對(duì)于未編輯成功但具有鏈霉素抗性的4個(gè)克隆進(jìn)行基因測(cè)序及比對(duì)，找出了rhsC和gadB等6個(gè)可能與鏈霉素抗性相關(guān)的其他基因。

關(guān)鍵詞：CA-NHEJ系統(tǒng)；CA-HR系統(tǒng)；rpsL基因；耐藥性

中圖分類號(hào)：S188? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）23-0017-05

CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其具有精確識(shí)別及特異剪切DNA序列的功能而被開發(fā)成為一種高效的基因編輯技術(shù)［1-2］。CRISPER系統(tǒng)中的Cas9核酸酶可由sgRNA根據(jù)堿基配對(duì)定向到任何靶基因組位點(diǎn)，并刺激位點(diǎn)特異性雙鏈DNA斷裂（DBS），斷裂的DNA鏈可通過非同源末端連接（NHEJ）和同源性末端連接（HR）2種機(jī)制進(jìn)行修復(fù)［3］。其中，NHEJ不僅不依賴于同源臂的設(shè)計(jì)與合成，而且能實(shí)現(xiàn)外源DNA片段隨機(jī)整合到不同的染色體位點(diǎn)，在基因編輯中顯示出顯著的優(yōu)勢(shì)［4-6］。在真核生物中普遍存在非同源末端連接系統(tǒng)，而大部分的原核生物（如大腸桿菌）缺乏NHEJ修復(fù)［7］，僅能通過同源重組（HR）和外源引入的人工設(shè)計(jì)供體DNA來實(shí)現(xiàn)基因敲除，編輯不同基因除了構(gòu)建CRISPR位點(diǎn)外，還需要構(gòu)建相應(yīng)的DNA修復(fù)模板，操作繁瑣，極大限制了該技術(shù)應(yīng)用于基因組規(guī)模的基因編輯?，F(xiàn)有學(xué)者借鑒真核CRISPR-Cas9基因編輯策略，將CRISPR-Cas9介導(dǎo)的DSB與NHEJ引發(fā)的易錯(cuò)DSB修復(fù)結(jié)合起來，在大腸桿菌中開發(fā)了一種新型的不依賴于DNA修復(fù)模板的基因突變技術(shù)CA-NHEJ（CRISPR-Cas9 assisted Non-Homologous? End Joining），該技術(shù)的應(yīng)用還在進(jìn)一步探索當(dāng)中［8］。

本研究以控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的基因pcnB和鏈霉素耐藥性相關(guān)基因rpsL為靶標(biāo)，研究 CA-NHEJ系統(tǒng)對(duì)2個(gè)基因的編輯效率。同時(shí)，采用CA-HR系統(tǒng)編輯rpsL基因，并對(duì)編輯后菌株的鏈霉素耐藥性進(jìn)行研究，以期為CA-NHEJ系統(tǒng)在大腸桿菌中的應(yīng)用提供參考，同時(shí)為細(xì)菌耐藥性研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與地點(diǎn)

MG1655菌株購(gòu)于ATCC公司，所有質(zhì)粒由蘇州金唯智生物科技有限公司構(gòu)建；試驗(yàn)用到的抗性平板、緩沖液、測(cè)序引物、TaqDNA聚合酶、大腸感受態(tài)等均由蘇州金唯智生物科技有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)于2021年在蘇州金唯智生物科技有限公司開展。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 sgRNA設(shè)計(jì)

利用http：//www.rgenome.net/網(wǎng)站設(shè)計(jì)sgRNA引物，“PAM Type”使用默認(rèn)選項(xiàng)“spCas9 from Streptococcus pyogenes：5′-NGG-3′”，“Target Genome”選擇“Others”，“Genomes”選擇“Escherichia coli（K-12，MG1655）”，“Target Sequence”下文本框中輸入DNA序列，“crRNA length”默認(rèn)“20”，設(shè)計(jì)結(jié)果出來后，選擇“Out-of-frame-Score”，得出分值最高的sgRNA序列（表1）。

1.2.2 質(zhì)粒制備

本研究采用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的DSB與NHEJ引發(fā)的易錯(cuò)DSB修復(fù)結(jié)合（CA-NHEJ）的系統(tǒng)對(duì)pcnB、rpsL基因進(jìn)行基因編輯。構(gòu)建表達(dá)載體pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD質(zhì)粒（kan抗性）和靶向目的基因載體sgRNA-NHEJ質(zhì)粒（Spe抗性），后續(xù)采用CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)合CA-HR系統(tǒng)對(duì)rpsL基因進(jìn)行基因編輯，構(gòu)建表達(dá)載體pCas9-Red質(zhì)粒（Kan抗性）和靶向目的基因載體pTarget質(zhì)粒（Spe抗性）。4個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)（圖1）均交由蘇州金唯智生物科技有限公司構(gòu)建，將酶切測(cè)序驗(yàn)證正確的目的質(zhì)粒菌液取回制備質(zhì)粒。

1.2.3 CA-NHEJ系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌基因編輯

將pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞MG1655中，復(fù)蘇1 h后將菌液離心全涂布至Kan抗性的LB平板，將平板放置烘箱30 ℃培養(yǎng)24 h；挑單克隆并制備相應(yīng)的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞pMG1655；將sgRNA-NHEJ質(zhì)粒電轉(zhuǎn)置感受態(tài)細(xì)胞pMG1655中，復(fù)蘇1 h后將菌液離心涂布至含Kan+Spe抗性的LB平板，30 ℃培養(yǎng)24 h；從Kan+Spe抗性的LB平板上挑取8～24個(gè)單克隆至含200 μL LB的96孔深孔板，將96孔深孔板置于30 ℃搖床培養(yǎng)16 h；通過菌落PCR及Sanger測(cè)序鑒定基因編輯情況。

1.2.4 CA-HR系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌基因編輯

將pCas9-Red質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞MG1655中，復(fù)蘇1 h后將菌液離心全涂布至Kan抗性的LB平板，將平板放置烘箱30 ℃培養(yǎng)24 h；將pTarget質(zhì)粒電轉(zhuǎn)置感受態(tài)細(xì)胞pMG1655中，復(fù)蘇 1 h 后將菌液離心涂布至含Kan+Spe抗性的LB平板，30 ℃培養(yǎng)24 h；從Kan+Spe抗性的LB平板上挑取8～24個(gè)單克隆至含200 μL LB 96孔深孔板，于30 ℃培養(yǎng)16～24 h；通過菌落PCR及Sanger測(cè)序鑒定基因編輯情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 CA-NHEJ系統(tǒng)對(duì)pcnB基因的編輯

使用pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD和sgRNA-pcnB-NHEJ質(zhì)粒，通過CA-NHEJ系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌pcnB基因進(jìn)行基因編輯，電轉(zhuǎn)涂布含Kan、Sep抗性平板。從生長(zhǎng)良好的平板上挑取16個(gè)單克隆，以pcnB-F和pcnB-R為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定結(jié)果，由圖2可知，所有克隆均顯示條帶，條帶大小不一表明基因序列缺失的大小具有隨機(jī)性。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示所有克隆的pcnB均發(fā)生基因編輯，其中，15個(gè)克隆在Cas9切割位點(diǎn)附近發(fā)生不同長(zhǎng)度的序列缺失，1個(gè)克隆（clone-3）在切割位點(diǎn)附近發(fā)生序列缺失，同時(shí)插入27 bp序列（ACTGGAAAATGTGCAGCCAAACTCGGC），基因編輯效率達(dá)100%，表明CA-NHEJ系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌pcnB基因編輯效率高。

2.2 CA-NHEJ系統(tǒng)對(duì)rpsL基因的編輯

使用pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD和sgRNA-rpsL-NHEJ質(zhì)粒，通過CA-NHEJ系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌rpsL基因進(jìn)行基因編輯，電轉(zhuǎn)化后涂布含卡那霉素、壯觀霉素、鏈霉素LB平板，烘箱過夜培養(yǎng)最終平板形成5個(gè)單克隆。從平板挑取這5個(gè)單克隆，以rpsL-F和rpsL-R為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，由圖3可知，所有克隆皆顯示大小一致的條帶，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示僅有1個(gè)克隆的rpsL基因成功編輯，在Cas9切割位點(diǎn)附近發(fā)生 9 bp 序列（CCTGCGCTG）缺失導(dǎo)致rpsL蛋白缺失第22～24位氨基酸，即Pro（脯氨酸）、Ala（丙氨酸）、Leu（亮氨酸）3個(gè)氨基酸，但序列缺失未引起基因的移碼突變；另外4個(gè)克隆的rpsL基因未發(fā)生編輯，為何沒未被編輯的4個(gè)克隆具有抗性，后續(xù)進(jìn)一步做測(cè)序分析（見“2.4”節(jié)）。這里的編輯效率低可能是一種假象，因?yàn)閞psL基因?yàn)榇竽c桿菌必需基因，基因編輯導(dǎo)致缺失的片段具有隨機(jī)性，編輯成功的克隆大部分致死。

2.3 CA-HR系統(tǒng)敲除MG1655大腸桿菌rpsL后的抗性分析

使用pCas9-Red和pTarget-rpsL質(zhì)粒，通過CA-HR系統(tǒng)敲除MG1655大腸桿菌rpsL基因CCTGCGCTG序列（第22～24位氨基酸），涂布卡那霉素、壯觀霉素LB平板，平板克隆形態(tài)正常。從平板挑取24個(gè)單克隆，以rpsL-F和rpsL-R為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，由圖4可知，所有克隆均顯示大小一致的條帶，進(jìn)一步將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示所有克隆rpsL的第22～24位氨基酸序列發(fā)生缺失，驗(yàn)證了CA-HR系統(tǒng)的編輯效率高，而且由于編輯位置固定，不致死。

將rpsL基因編輯成功的菌液及野生型MG1655菌液分別涂布含鏈霉素抗性平板，于37 ℃培養(yǎng) 18 h，次日檢查，由圖5可知，涂布rpsL基因編輯菌液的平板正常形成菌落，涂布野生型MG1655菌液的平板沒有形成菌落，表明大腸桿菌rpsL缺失第 22～24位3個(gè)氨基酸會(huì)產(chǎn)生鏈霉素抗性。

2.4 rpsL未編輯的克隆全基因組測(cè)序分析

為探究4個(gè)rpsL基因未編輯的克隆耐受鏈霉素抗性的原因，通過二代（Hiseq）和三代（Pacbio）高通量測(cè)序平臺(tái)，將1個(gè)編輯成功的克隆和4個(gè)未編輯成功的克隆及野生型MG1655大腸桿菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的MG1655基因組序列進(jìn)行比對(duì)，分析序列差異，考慮到轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)元件基因和鏈霉素抗性關(guān)聯(lián)度較低，部分RNA基因有序列缺失，但是缺失序列較短，本研究?jī)?yōu)先探究編碼蛋白基因和鏈霉素抗性的相關(guān)性，由測(cè)序結(jié)果（表2）可知，與NCBI公布的MG1655參考序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，野生型MG1655部分編碼蛋白基因（folD等）發(fā)生突變，由于野生型MG1655菌株沒有鏈霉素抗性，因此推測(cè)這些基因和鏈霉素抗性關(guān)聯(lián)性極低；MG1655（rpsLΔ22～24）大腸桿菌rpsL基因有 9 bp 序列缺失，與Sanger測(cè)序結(jié)果一致；rhsC、gadB、ydfK、pinQ、tfaQ、gadA基因在野生型MG1655菌株均未發(fā)生突變，但它們中的1個(gè)或多個(gè)基因在其他有鏈霉素康抗性的菌株中發(fā)生了突變，推測(cè)這些基因中可能存在與鏈霉素抗性有關(guān)的基因。

3 討論

鏈霉素是一種廣譜氨基糖苷類抗生素，通過提高核糖體和非同源tRNA親和力、干擾核糖體矯正功能，導(dǎo)致細(xì)菌蛋白翻譯錯(cuò)誤率水平提升［9］，細(xì)菌有缺陷的突變蛋白的積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌死亡，達(dá)到殺菌效果［10］。此外，鏈霉素還會(huì)引起氨酰-tRNA從核糖體解離，影響蛋白翻譯。rpsL基因編碼核糖體蛋白S12，該蛋白對(duì)維持翻譯水平的精確性有著極為重要的作用，已經(jīng)有報(bào)道表明rpsL基因第43位氨基酸或第88位氨基酸發(fā)生突變會(huì)產(chǎn)生鏈霉素抗性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)rpsL更多的突變位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致鏈霉素抗性，這些突變分散在2個(gè)區(qū)域：第40～43位氨基酸和第87～93位氨基酸［11-13］。本研究使用 pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD和sgRNA-rpsL-NHEJ質(zhì)粒，通過CA-NHEJ系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌rpsL基因進(jìn)行基因編輯，發(fā)現(xiàn)1個(gè)未有報(bào)道的新突變，rpsL缺失CCTGCGCTG（第21～23位氨基酸），即Pro（脯氨酸）、Ala（丙氨酸）、Leu（亮氨酸）3個(gè)氨基酸，該突變類型能夠產(chǎn)生鏈霉素抗性。同時(shí)，通過對(duì)rpsL未編輯但有抗性的4個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)可能與鏈霉素抗性相關(guān)的其他基因（rhsC、gadB、ydfK、pinQ、tfaQ、gadA），其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過CA-NHEJ系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌MG1655的pcnB和rpsL的基因編輯，其中，pcnB基因編輯效率達(dá)100%，rpsL基因僅有1個(gè)克隆rpsL缺失第22～24位3 個(gè)氨基酸，其他4個(gè)克隆未編輯成功但具有鏈霉素抗性，編輯效率低可能是因?yàn)閞psL基因?yàn)楸匦杌?，隨機(jī)缺失導(dǎo)致大部分編輯成功的克隆致死；進(jìn)一步利用CA-HR系統(tǒng)敲除大腸桿菌MG1655的rpsL基因CCTGCGCTG序列（第 22～24位氨基酸），編輯效率達(dá)100%，驗(yàn)證了CA-HR的高效性，抗性鑒定結(jié)果表明該序列是影響鏈霉素抗性的關(guān)鍵序列；對(duì)于未編輯成功但具有鏈霉素抗性的4個(gè)克隆進(jìn)行基因測(cè)序及比對(duì)，找出了rhsC和gadB等6個(gè)可能與鏈霉素抗性相關(guān)的其他基因，本研究對(duì)鏈霉素抗性機(jī)理，核糖體參與的蛋白翻譯機(jī)制提供新的研究思路。

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