郭子一,王偉偉,宋 杰,王慧利*

基于Illumina RNA-Seq分析的三種內(nèi)分泌干擾物對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)毒性效應(yīng)與機(jī)制

郭子一1,王偉偉2,宋 杰1,王慧利1*

(1.蘇州科技大學(xué),江蘇 蘇州 215009；2.溫州醫(yī)科大學(xué),浙江 溫州 325035)

三氯生、三氯卡班和雙酚A均具內(nèi)分泌干擾作用,但從轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面上揭示其靶分子及神經(jīng)毒性機(jī)制鮮有報(bào)道,因此,本文借助RNA-Seq測(cè)序獲得它們暴露斑馬魚(yú)幼魚(yú)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),基于生物信息分析證明:三種藥物暴毒組差異表達(dá)基因(DEGs)的GO功能和KEGG代謝途徑富集在生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能上,富集的DEGs數(shù)量和功能均不同,在神經(jīng)相關(guān)途徑上均有富集,但具體信號(hào)通路和途徑不同.PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)度計(jì)算發(fā)現(xiàn):富集在神經(jīng)通路的Hub基因也不同,且與神經(jīng)標(biāo)志功能基因之間存在豐富間接的互作網(wǎng)絡(luò).將DEGs與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GBM突變基因整合,證實(shí)其環(huán)境暴露均有誘發(fā)GBM風(fēng)險(xiǎn),但發(fā)生途徑和調(diào)控信號(hào)通路不同,故從分子水平上解析了三種污染物誘導(dǎo)神經(jīng)毒性機(jī)制的根源.

內(nèi)分泌干擾物；斑馬魚(yú)；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；神經(jīng)毒性；神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是一類(lèi)廣泛存在于環(huán)境中,可干預(yù)生物體內(nèi)源激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解過(guò)程,對(duì)生物體的生殖、免疫、內(nèi)分泌和神經(jīng)各大系統(tǒng)造成傷害的化學(xué)物質(zhì)[1],其污染問(wèn)題已經(jīng)受全球重點(diǎn)關(guān)注.EDCs主要來(lái)自醫(yī)藥或農(nóng)藥中,也用于塑料、洗滌劑、涂料及化妝品等.自然環(huán)境中EDCs含量較低,多數(shù)以10-12濃度或者10-15濃度為主,然而由于目前工業(yè)生產(chǎn)廢氣、生產(chǎn)生活廢水、農(nóng)藥的殘留沉降、垃圾填埋物等污染,自然環(huán)境中EDCs含量逐漸增多[2].近期的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)研究表明,EDCs暴露增加了精神退行性疾病、肥胖、代謝綜合征和2-型糖尿病的發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3].2022年5月,國(guó)務(wù)院辦公廳印發(fā)的《新污染物治理行動(dòng)方案》中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物被列入需加強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)管理的新污染物范疇.這類(lèi)化學(xué)物質(zhì)污染的毒性效應(yīng)已成為新的公共衛(wèi)生問(wèn)題,引起全世界高度關(guān)注.

三氯生(Triclosan, TCS)和三氯卡班(Triclocarban, TCC)均為高效廣譜性殺菌劑,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、精細(xì)化工等領(lǐng)域[1].其大量頻繁使用產(chǎn)生的“二次污染”對(duì)生態(tài)環(huán)境隱患已成不爭(zhēng)的事實(shí)[2-3].盡管2016～2017年美國(guó)FDA禁止二者在手皂和沐浴露中使用,2019年在臨床護(hù)理、洗手液和牙膏產(chǎn)品中禁用,但是,其仍被添加到各種家庭和工作場(chǎng)所的領(lǐng)先品牌產(chǎn)品中,在世界范圍內(nèi)銷(xiāo)售.目前,全球TCS和TCC的年產(chǎn)量分別約為1.05×105t,7.5× 105t.TCC在中國(guó)的年產(chǎn)量超過(guò)6000t[3],經(jīng)污水處理廠處理后的出水有3%以上的TCC殘留,其已被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局列入最常見(jiàn)的十大水污染物之一[4].由于TCS (logow=5.46) 和TCC(logow=4.9)的親脂性比較強(qiáng),故有較強(qiáng)的生物蓄積、生物放大作用.研究者在水藻、魚(yú)蝦,甚至80%婦女的乳汁和臍帶血中均檢出二者的存在[5].TCS和TCC的化學(xué)結(jié)構(gòu)近似于非固醇類(lèi)激素,與典型的內(nèi)源激素干擾物雙酚A(BPA)、多氯聯(lián)苯和多溴聯(lián)苯醚等結(jié)構(gòu)的相似性可預(yù)測(cè)其潛在的(抗)雄或雌激素效應(yīng).越來(lái)越多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了它們作用于免疫、生殖、神經(jīng)三大系統(tǒng)并會(huì)干擾人和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng).雖然目前致代謝紊亂、免疫和生殖毒性研究已比較成熟,但對(duì)神經(jīng)毒性效應(yīng)及機(jī)制研究尚欠缺充足數(shù)據(jù).

由于不同污染物作用受體、靶分子和致毒機(jī)制不同,給環(huán)境健康帶來(lái)不同的風(fēng)險(xiǎn),尤其是誘發(fā)神經(jīng)相關(guān)疾病和機(jī)制還不明了.斑馬魚(yú)作為繼小鼠之后的第二大脊椎模式動(dòng)物,以其與人類(lèi)基因超高相似度(87%)而被用于環(huán)境污染物的毒性研究模型[5].有研究表明,低劑量BPA暴露就會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)畸形率升高[6],神經(jīng)元數(shù)量增多,導(dǎo)致斑馬魚(yú)過(guò)度活躍而出現(xiàn)多動(dòng)癥[7].而TCS會(huì)干擾魚(yú)類(lèi)的甲狀腺,其對(duì)神經(jīng)發(fā)育有重要作用[8].TCC除了改變胚胎神經(jīng)元細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài),還會(huì)導(dǎo)致早期發(fā)育階段腦神經(jīng)元自噬[9-11].但大多數(shù)研究依舊局限于個(gè)體、組織器官或功能評(píng)判層面,故本研究選擇斑馬魚(yú)為模式生物,以BPA、TCS、TCC為研究對(duì)象,利用轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序獲取了三者急性暴露斑馬魚(yú)幼魚(yú)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),借助生物信息學(xué)分析,將其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)整合分析,從分子層面上評(píng)判三種內(nèi)分泌干擾物對(duì)水生生物的神經(jīng)毒性效應(yīng),分析比較其作用靶標(biāo)、作用途徑、致毒機(jī)理及可能誘發(fā)神經(jīng)相關(guān)疾病的異同,評(píng)判其誘發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn).為從分子水平上評(píng)判環(huán)境污染物健康風(fēng)險(xiǎn)與預(yù)警提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 LC50的計(jì)算

在ChemDraw軟件中分別繪制三種內(nèi)分泌干擾物的結(jié)構(gòu)式,以mol格式導(dǎo)出至Ecosar Applcation 軟件,點(diǎn)擊Submit進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得出BPA、TCS、TCC三種內(nèi)分泌干擾物的LC50預(yù)測(cè)值.再根據(jù)軟件預(yù)測(cè)的LC50,選擇濃度對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行梯度濃度暴露.胚胎從6hpf開(kāi)始在培養(yǎng)皿中進(jìn)行暴毒處理,每組50顆胚胎,每24h更換藥液一次,其中BPA的梯度濃度分別為0, 5.5, 6.5, 7.0, 8.0, 9.0mg/L,TCS的梯度濃度分別為0, 0.20, 0.25, 0.30, 0.40, 0.50mg/L.TCC的梯度濃度分別為0, 100, 300, 350, 400, 500μg/L,分別統(tǒng)計(jì)在120hpf各暴露濃度對(duì)應(yīng)的斑馬魚(yú)死亡率,獲得劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線,50%死亡率的對(duì)應(yīng)暴露濃度即為L(zhǎng)C50.

1.2 斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)與暴露

使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為野生型斑馬魚(yú)AB品系,根據(jù)斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖指南,雌雄母魚(yú)分開(kāi)飼養(yǎng)在專(zhuān)用養(yǎng)殖系統(tǒng)中.調(diào)節(jié)水溫為(28.5±0.5)℃,pH值為6.8～7.5;設(shè)置為14h光照:10h黑暗循環(huán)周期,每d 08:00和18:00喂食兩次新鮮豐年蝦.

對(duì)照組、BPA組、TCS組、TCC組四組胚胎從6hpf開(kāi)始在培養(yǎng)皿中進(jìn)行暴毒處理,暴露濃度均為225μg/L每24h更換暴露藥液1次,持續(xù)暴露至實(shí)驗(yàn)所需.

1.3 Illumina RNA-Seq測(cè)序

選取連續(xù)暴露在三種藥物5d的斑馬魚(yú)幼魚(yú)(5dpf),分別提取RNA,建立測(cè)序文庫(kù),采用Illumina Hiseq4000進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序讀長(zhǎng)為雙端2*150bp.測(cè)序原始數(shù)據(jù)(Raw data)進(jìn)行過(guò)濾去雜和質(zhì)控分析,獲得合格測(cè)序數(shù)據(jù),測(cè)序數(shù)據(jù)以FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads),即指在每百萬(wàn)測(cè)序堿基中每千個(gè)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序堿基中所包含的測(cè)序片斷數(shù),表示基因在不同處理組中的表達(dá)豐度.將表達(dá)豐度不同的序列通過(guò)比對(duì)到Ensembl上最新的Zv9.0斑馬魚(yú)序列(ftp://ftp. ensembl.org/pub/release-66/fasta/danio rerio/dna/),獲得全面轉(zhuǎn)錄本信息,并進(jìn)行基因表達(dá)定量,按∣log2 (fold change)∣31,-value <0.05的閾值選取所有陽(yáng)性差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行后續(xù)分析.

1.4 差異基因的GO功能分類(lèi)和KEGG Pathway富集分析

將篩選出的DEGs及其差異變化倍數(shù)導(dǎo)入微生信在線分析網(wǎng)(https://www.bioinformatics.com.cn),根據(jù)基因標(biāo)識(shí)以生物過(guò)程(Biological Process)、細(xì)胞組成(Cell Component)和分子功能(Molecular Function)進(jìn)行GO功能分類(lèi)及KEGG富集分析,GO功能分析作用是將篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能條目富集,判斷其顯著相關(guān)的生物學(xué)功能,涉及生物過(guò)程(Biolo-gical Process)、細(xì)胞組成(Cell Component)和分子功能(Molecular Function)三方面.KEGG信號(hào)通路分析是對(duì)各處理組差異基因的代謝通路Pathway分析,尋找不同藥物暴露下的差異基因可能與哪些細(xì)胞通路的改變有關(guān).最終確定差異基因主要參與的GO Term及信號(hào)通路.

1.5 差異表達(dá)基因的蛋白互作分析

將篩選出來(lái)的DEGs導(dǎo)入STRING 11.0 (http: //www.string-db.org/),在線進(jìn)行候選DEGs能夠互作的蛋白分析,構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction, PPI),將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行可視化分析,使用Cytohub插件對(duì)DGEs進(jìn)行模塊化分析,從DGEs中篩選出與蛋白互作積分較高的Hub基因以備其功能評(píng)判.

1.6 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤突變基因篩選與分析

cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)是一個(gè)開(kāi)源平臺(tái),用于探索、可視化和分析多維癌癥基因組學(xué)和臨床數(shù)據(jù).cBioPortal包含200多項(xiàng)癌癥基因組學(xué)研究[12],包括來(lái)自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA) 的所有數(shù)據(jù).通過(guò)cBioPortal平臺(tái)下載膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma, GBM)的突變基因數(shù)據(jù),共有14972個(gè)突變基因,篩選出其中976個(gè)致癌基因?qū)⑵渑c三種藥物處理的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中候選DEGs在STRING轉(zhuǎn)化后進(jìn)行比較分析,篩選出污染暴露差異基因與TCGA致癌基因的交集基因,評(píng)判污染物暴露誘發(fā)GBM的風(fēng)險(xiǎn).

2 結(jié)果與分析

2.1 三種污染物對(duì)不同水生生物的LC50預(yù)測(cè)與對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的LC50實(shí)驗(yàn)值測(cè)定

經(jīng)過(guò)Ecosar Applcation軟件分析得出BPA、TCS和TCC對(duì)不同生物的半致死濃度(表1),由表1可知三種污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)、水蚤和綠藻的毒性大小排序均為T(mén)CC>TCS>BPA.表明TCC對(duì)水生動(dòng)物的毒性最高.盡管三種環(huán)境雌激素結(jié)構(gòu)相似(圖1),但對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)卻不同.

表1 三種典型環(huán)境雌激素污染物的LC50預(yù)測(cè)

圖1 三種污染物化學(xué)結(jié)構(gòu)式及其對(duì)120hpf斑馬魚(yú)幼魚(yú)LC50模擬

參考三種污染物魚(yú)類(lèi)對(duì)應(yīng)的LC50預(yù)測(cè)值,分別在其上下各設(shè)定2～3個(gè)濃度梯度暴露處理6hpf的斑馬魚(yú)胚胎(hpf為受精幾小時(shí)后的縮寫(xiě)),放置6孔板中持續(xù)暴毒至120hpf,模擬出BPA、TCS、TCC對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)(120hpf)LC50分別為9.06,0.51和0.46mg/L.擬合回歸曲線2值分別為0.91,0.99和0.99,BPA,TCS和TCC劑量-效應(yīng)回歸方程的2值均超過(guò)90%(圖1).因此,后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)選取半致死劑量的約1/2作為亞致死處理劑量(225μg/L).

2.2 污染物暴露斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異表達(dá)基因篩選和功能分析

為了分析比較三種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的毒性效應(yīng)的分子靶標(biāo),以225μg/L相同濃度的三種不同污染物暴露斑馬魚(yú)胚胎,暴露第5天時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.對(duì)表達(dá)豐度不同的測(cè)序進(jìn)行差異分析,設(shè)定顯著差異的閾值標(biāo)準(zhǔn)為|log2fold change|31且<0.05,篩選出三種污染物處理組與對(duì)照組之間的差異基因,繪制如圖2(A)的火山圖,由圖可見(jiàn)TCC處理組發(fā)生顯著變化的基因明顯多于BPA和TCS暴露組,且TCC處理組的差異基因變化幅度明顯高于其它兩個(gè)藥物暴露組.由圖2(B)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,BPA、TCS、TCC、分別產(chǎn)生99、581、740個(gè)DEGs,其中BPA處理組有37個(gè)上調(diào)和62個(gè)下調(diào)DEGs. TCS處理組約272個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào)和309個(gè)表達(dá)下調(diào),TCC處理組存在174個(gè)上調(diào)基因和564個(gè)下調(diào)基因.圖2(C)顯示三種污染物處理組中存在9個(gè)重疊的顯著差異基因,說(shuō)明這3種環(huán)境污染物致斑馬魚(yú)幼魚(yú)差異變化的基因大多數(shù)不同,預(yù)示其作用靶分子或毒性效應(yīng)機(jī)制不同.

圖2 各處理組差異基因火山圖(A)、統(tǒng)計(jì)圖(B)、韋恩圖(C)

2.3 三種污染物差異表達(dá)基因GO富集分類(lèi)

為了進(jìn)一步分析比較三種內(nèi)分泌干擾物差異表達(dá)基因的分布功能以及作用途徑,我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析,以了解三種EDCs暴露組中所有差異表達(dá)基因所富集的生物學(xué)功能和涉及的代謝調(diào)控Pathway,以深入闡明EDCs暴露作用的相關(guān)分子機(jī)制.圖3展示了各處理組所富集到的排名前10的GOterms(<0.05),氣泡圖的左側(cè)為相應(yīng)的基因富集的生物過(guò)程、通路、部位等名稱(chēng),氣泡的大小代表所富集到的DEGs的數(shù)量.

GO分析顯示,TCS處理組在生物過(guò)程(Biological Process)方面,有大部分差異基因富集在“對(duì)外來(lái)刺激的反應(yīng)(Response to xenobiotic stimulus)”、“藥物反應(yīng)(Response to drug)”以及“藥物代謝過(guò)程(Drug metabolic process)”等生物過(guò)程.而在細(xì)胞組成(Cell Component)方面,差異基因主要富集在“質(zhì)膜區(qū)(Plasma membrane region )”部位.在分子功能(Molecular Function)方面,大部分差異基因富集在“鐵離子絡(luò)合(Iron ion binding)”和“氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)”.GO分析表明TCS主要生物影響藥物代謝過(guò)程以及氧化還原功能.TCC處理組差異基因在生物過(guò)程方面主要富集到 “細(xì)胞外基質(zhì)組織(Extracellular matrix organization)”和“補(bǔ)體激活(Complement activation)”.而在細(xì)胞組成方面,差異基因大部分富集在“細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix)”組成.TCC處理組在分子功能上所富集到的最顯著的是“內(nèi)肽酶活性(Endopeptidase activity)”功能.GO分析顯示與TCS相比TCC主要影響細(xì)胞外基質(zhì)形成的過(guò)程以及補(bǔ)體和內(nèi)肽酶活性.

BPA處理組的差異基因在生物過(guò)程(Biological Process)方面大部分富集在“物種間相互作用(Interspecies interaction between organisms)”以及“對(duì)激素的反應(yīng)(Response to hormone)”等兩個(gè)生物過(guò)程.在細(xì)胞組成(Cell Component)方面,差異基因主要富集在“突觸后密集區(qū)(Supramolecular fiber)”、“神經(jīng)元間突觸(Neuron to neuron synapse)”以及“不對(duì)稱(chēng)突觸(Asymmetric synapse)”.在分子功能(Molecular Function)方面,BPA處理組差異基因富集到分子功能項(xiàng)與TCS相似,分別是“鐵離子結(jié)合(Iron ion binding)”和“氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)”等相關(guān)功能 (圖3).GO分析顯示與TCC不同BPA主要影響生物間的相互作用以及生物氧化還原的分子功能.

由此可知,三種污染物差異基因的GO功能富集存在一定的差異,尤其是TCC的GO功能與BPA和TCS差異較大.

圖3 不同EDCs干擾物處理下差異表達(dá)基因(DEGs)GO功能分析

2.4 三種污染物差異表達(dá)基因KEGG Pathway富集分析

各處理組差異基因的KEGG途徑富集如圖4A所示,TCS處理組主要富集的KEGG代謝途徑 (<0.05),主要包括“細(xì)胞色素P450對(duì)外源性物質(zhì)的代謝(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)”、“輔助因子的生物合成(Biosynthesis of cofactors)”、“藥物代謝-細(xì)胞色素P450(Drug metabolism cytochrome P450)”三個(gè)通路.TCC處理組顯著富集的KEGG途徑 (<0.05)包括 “附著斑(Focal adhesion)”、“肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)(Regulation of actin cytoskeleton)”以及“光轉(zhuǎn)導(dǎo)(Phototransduction)”等通路.而B(niǎo)PA處理組主要富集的KEGG途徑 (<0.05),分別是“精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)”與“甘油脂代謝(Glycerolipid metabolism)”通路.由此可知,三種污染物盡管均具有內(nèi)分泌干擾作用或雌激素作用,但是他們靶向的差異基因富集在不同的代謝途徑,表明由不同的信號(hào)通路介導(dǎo).

圖4 不同EDCs處理下差異表達(dá)基因(DEGs)KEGG功能分析

將各自富集出的前20個(gè)通路及其基因?qū)隒ytoscape v3.9.1軟件進(jìn)行可視化展示,分析其基因的表達(dá)模式聚類(lèi)(圖4B).棱形代表KEGG信號(hào)通路,藍(lán)色小球代表下調(diào)的DEGs,紅色小球代表上調(diào)的DEGs.TCS顯著富集的通路大致可以劃分為三大類(lèi):藥物相關(guān)代謝途徑(紅色圈內(nèi)),包括細(xì)胞色素P450對(duì)異生素的代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、藥物代謝-其他酶類(lèi)、輔因子的生物合成;糖類(lèi)和脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑(黃色圈內(nèi)),包括類(lèi)固醇激素生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、脂肪酸代謝等途徑;神經(jīng)發(fā)育相關(guān)途徑(紫色圈內(nèi)),包括谷胱甘肽代謝、視黃醇代謝、抗壞血酸和醛糖代謝.TCC顯著富集的通路大致可以劃分為免疫相關(guān)途徑(紅色圈內(nèi)),包括胰島素信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、粘著斑等途徑;神經(jīng)發(fā)育相關(guān)途徑(紫色圈內(nèi)),包括光轉(zhuǎn)導(dǎo)、葉酸生物合成、葉酸的一個(gè)碳庫(kù)、ErbB信號(hào)通路;其他途徑例如PPAR信號(hào)通路等(綠色圈內(nèi)).

BPA顯著富集的四條通路劃分為精氨酸和脯氨酸代謝途徑(紅色圈內(nèi)),包括精氨酸生物合成、各種類(lèi)型的N-聚糖生物合成等途徑;免疫相關(guān)途徑(黃色圈內(nèi)),包括鐵死亡、RIG-I樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等途徑;神經(jīng)相關(guān)途徑(紫色圈內(nèi)),包括Notch信號(hào)通路、Apelin信號(hào)通路;其他途徑例如甘油脂代謝等途徑(綠色圈內(nèi)).上述分析表明,三種污染物差異表達(dá)基因的KEGG通路在神經(jīng)相關(guān)途徑均有富集,但是,作用于神經(jīng)通路是不同的.TCS富集的神經(jīng)作用途徑主要是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)分化相關(guān)的通路,TCC富集的神經(jīng)作用途徑主要是葉酸合成和ErbB信號(hào)通路;而B(niǎo)PA的神經(jīng)富集途徑關(guān)于Notch信號(hào)通路、Apelin信號(hào)通路.從富集的基因數(shù)量來(lái)看,TCS和TCC富集的差異基因比較多,然而而TCS主要是上調(diào)的基因參與神經(jīng)相關(guān)通路,TCC主要是下調(diào)的差異基因參與(圖4B).

Cytohubba軟件可對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)度進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算出PPI網(wǎng)絡(luò)中最密集的區(qū)域,篩選出基因組合中的關(guān)鍵基因(Hub基因).為比較和探索三種污染物對(duì)神經(jīng)毒性的機(jī)制,選取富集在神經(jīng)發(fā)育相關(guān)途徑的基因進(jìn)行Hub基因的篩選.如圖4C,TCS組中前10的Hub基因?yàn)?、、、、、、、、?其中有研究報(bào)道癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后大鼠海馬體中GPx1蛋白時(shí)空分布表達(dá)發(fā)生了改變[13],并表明谷胱甘肽介導(dǎo)GPx1的調(diào)節(jié)可能影響SE誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡和自噬性星形膠質(zhì)細(xì)胞變性.TCC處理組中前10Hub基因?yàn)椤?、、、、、、、?其中Rho家族GTP酶是小G蛋白,充當(dāng)在活性和非活性形式之間穿梭的分子開(kāi)關(guān)[13].Rho GTPases調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程,例如生長(zhǎng)、遷移、粘附和分化[14].Rho GTPases也在調(diào)節(jié)神經(jīng)元形態(tài)和功能方面發(fā)揮著重要作用[15].劉曉楠等[16]發(fā)現(xiàn)了Gstp可以通過(guò)JNK信號(hào)調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突形成,表明了Gstp蛋白在皮質(zhì)發(fā)育過(guò)程中在神經(jīng)突起始中的新功能.BPA組中的前6個(gè)Hub基因?yàn)椤?、、、?其中在維持果蠅幼蟲(chóng)大腦中的神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)和神經(jīng)節(jié)母細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用.Elena Butturini等[17]已證明氧化應(yīng)激誘導(dǎo)STAT1的S-谷胱甘肽化并過(guò)度激活其在小膠質(zhì)細(xì)胞BV2中的信號(hào)傳導(dǎo),并指出這種轉(zhuǎn)錄因子在神經(jīng)炎癥中的重要性.

為證明上述篩選的Hub基因與神經(jīng)標(biāo)志功能基因蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)及Hub基因調(diào)控神經(jīng)毒性的作用模式,即為比較三種污染物的神經(jīng)毒性效應(yīng)機(jī)制.如圖4D所示,BPA組篩選出的Hub基因與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之間存在相互作用;TCS組篩選的Hub基因與神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿酯酶ache具有互作關(guān)系;TCC組篩選的Hub基因中與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4有相互作用,Hub基因、和與配對(duì)盒蛋白、Elav樣蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白有相互作用.綜上所述,TCS、TCC、BPA均能直接靶向于神經(jīng)相關(guān)的Hub基因誘導(dǎo)不同的神經(jīng)毒性,也可通過(guò)Hub基因間接地與神經(jīng)標(biāo)志基因的互作而誘導(dǎo)神經(jīng)毒性.就像BPA在神經(jīng)毒性通路上富集KEGG pathway和Hub基因較少,但是Hub基因與神經(jīng)標(biāo)志功能基因之間存在豐富而間接的蛋白互作網(wǎng)絡(luò).這些發(fā)現(xiàn)使我們?cè)诜肿铀缴狭私饬巳N污染物誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)育毒性效應(yīng)不同、作用的分子機(jī)制與途徑不同.

2.5 三種污染物差異基因與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤突變癌基因的比較分析

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是成人最常見(jiàn)、最具侵襲性的原發(fā)腦腫瘤,占原發(fā)惡性腦腫瘤的45.6%[18].膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的年發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng)而增加,從兒童的0.15/10萬(wàn)增加到75～84歲患者的峰值15.03/10萬(wàn)[19].一些環(huán)境的致癌因素也可影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生.與神經(jīng)外器官的腫瘤相比,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和原發(fā)腦腫瘤的發(fā)生率普遍較低,可能是由于血腦屏障的對(duì)大腦的保護(hù),血腦屏障的三磷酸腺苷結(jié)合盒(ABC)家族轉(zhuǎn)運(yùn)體限制化學(xué)誘變劑向大腦擴(kuò)散,使其免受毒性應(yīng)激的影響.有研究表明妊娠期暴露于EDCs可能會(huì)干擾兒童正常大腦發(fā)育,并容易導(dǎo)致以后行為功能障礙[20],且由于這三種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物都是脂溶性物質(zhì),都具有神經(jīng)毒性相關(guān)的報(bào)道.因此我們進(jìn)行了這些藥物暴露誘發(fā)腦膠質(zhì)瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn)的分析,通過(guò)cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)下載了TCGA中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的突變基因數(shù)據(jù),共有14972個(gè)突變基因,其中有976個(gè)致癌基因與三種藥物處理的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中候選DEGs在STRING轉(zhuǎn)化后進(jìn)行比較分析.如圖5所示,BPA暴露組差異表達(dá)基因在轉(zhuǎn)化后與976個(gè)癌基因共有2個(gè)交集基因,為NOTCH3、ARAF;TCS暴露組與其有10個(gè)交集基因,為T(mén)ET3、NOTCH3、SOCS2、AFF4、PMAIP1、ARID1B、ARID3A、ARNT、PTPRT、PIK3R2;TCC暴露組與其有27個(gè)交集基因,為DDX6、FAT4、ARAF、AXIN1、EML4、MIB1、ZNF750、HDAC7、IRF8、PRSS1、STAT3、CDKN1A、ABL2、PALB2、MST1、CBL、STAT4、DUSP4、S1PR2、SAMHD1、SCG5、ROS1、REL、SHOC2、TP63、RPTOR、PPARG.

BPA暴露組的交集基因中,NOTCH3是一個(gè)高度保守的基因,是一種跨膜的發(fā)育信號(hào)受體,它在細(xì)胞發(fā)育模式、細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞存活和增殖的調(diào)節(jié)中起許多關(guān)鍵作用[21].最近的研究已經(jīng)發(fā)型了NOTCH3在神經(jīng)元干細(xì)胞和神經(jīng)元分化中有重要作用,NOTCH3能調(diào)節(jié)室管膜下區(qū)的靜止干細(xì)胞群[22-23].穆罕默德·艾爾庫(kù)達(dá)等[24]發(fā)現(xiàn)NOTCH3基因是17%的膠質(zhì)瘤組織活檢中最顯著的擴(kuò)增之一, NOTCH3在許多惡性腫瘤中經(jīng)常被異常調(diào)控,可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生中起主要作用.ARAF是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶Raf家族的成員.在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路中,Raf激酶被認(rèn)為是Ras和MEK之間的重要節(jié)點(diǎn)[25].在典型的受體酪氨酸激酶(RTK)-Ras-Raf-MEK-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中,Raf在RTK刺激下直接與GTP結(jié)合的RAS轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜,然后Raf通過(guò)磷酸化激活雙特異性激酶MEK1和MEK2,進(jìn)而激活ERK2,從而構(gòu)成經(jīng)典的三級(jí)MAPK激酶級(jí)聯(lián).Ras-Raf-MEK-MAPK通路的異常激活常見(jiàn)于各種類(lèi)型的癌癥[26,27].BPA暴露可能會(huì)通過(guò)影響NOTCH3的表達(dá)以及Raf信號(hào)通路導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生癌變繼而引起神經(jīng)膠質(zhì)瘤.

圖5 不同EDCs處理下差異表達(dá)基因(DEGs)與GBM突變基因的交集

TCS暴露組中,細(xì)胞因子信號(hào)(SOCS)蛋白抑制劑是細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)的調(diào)節(jié)劑,其異常調(diào)節(jié)與多種炎癥和腫瘤疾病有關(guān)[28].細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子(SOCS)家族成員最為人知的是JAK/STAT途徑的信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)因子.該家族的一些成員,尤其是SOCS2,在神經(jīng)系統(tǒng)中具有促進(jìn)神經(jīng)元分化和軸突生長(zhǎng)等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的作用[29-30].SOCS2還可影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)對(duì)甲基環(huán)己氯乙亞硝脲化療敏感性的核心基因.磷酸肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞基2(PIK3R2)是一種腫瘤驅(qū)動(dòng)因子.有研究表明XLOC可以募集特異性蛋白1(Sp1)轉(zhuǎn)錄因子,并促進(jìn)Sp1與PIK3R2啟動(dòng)子的結(jié)合[31],從而提高PIK3R2在mRNA和蛋白水平的表達(dá).PIK3R2介導(dǎo)的PI3K/ AKT信號(hào)通路的激活促進(jìn)了替莫唑胺(TMZ)耐藥和膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[32].由此分析可知,TCS暴露可能會(huì)通過(guò)影響SOCS2的表達(dá)以及PIK3/AKT信號(hào)通路影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生及其預(yù)后.

TCC暴露組與GBM突變基因交集中,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的7個(gè)STAT家族成員之一.研究表明[33],膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STAT3及其下游基因,如細(xì)胞周期蛋白D1(cyc-linD1)、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xl和VEGF等,常顯示異常表達(dá)或活性增強(qiáng),從而使細(xì)胞生長(zhǎng)失控,抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤血管生成,參與腫瘤免疫逃逸.PPARG系統(tǒng)可以快速感知細(xì)胞壓力,并以多種抗炎和神經(jīng)保護(hù)方式在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用.有研究說(shuō)明了PPARG的異常表達(dá)可能與GBM患者的存活時(shí)間有關(guān)[34].CDKN1A是一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,其能降低細(xì)胞生長(zhǎng)速度,且CDKN1A與腫瘤發(fā)生有關(guān),有研究發(fā)現(xiàn)CDKN1A參與AKT介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的TMZ抗性[35].此外,CDKN1A可能參與GBM中的補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路[36].TCC暴露可能會(huì)通過(guò)影響STAT3、PPARG、CDKN1A等癌基因的表達(dá)導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生.

綜上所述,BPA、TCS、TCC三種內(nèi)分泌干擾物環(huán)境暴露均在一定程度上有誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),但三者誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的途徑和介導(dǎo)的信號(hào)通路不同,其中TCC的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)大于另外兩種污染物.

3 結(jié)語(yǔ)

基于多數(shù)內(nèi)分泌干擾物對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)毒性效應(yīng)與機(jī)制的研究依舊局限于個(gè)體、組織器官或功能評(píng)判層面,故本研究從分子層面上評(píng)判三種EDCs對(duì)水生生物的神經(jīng)毒性效應(yīng),分析比較其作用靶標(biāo)、作用途徑、致毒機(jī)理及可能誘發(fā)神經(jīng)相關(guān)疾病的異同,評(píng)判其誘發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn).

1)基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)的系統(tǒng)分析,揭示了BPA、TCS、TCC差異基因的GO功能富集存在差異.此外,盡管三種污染物差異表達(dá)基因的KEGG通路在神經(jīng)發(fā)育相關(guān)途徑均有富集,但是其作用于神經(jīng)通路是不同的.

TCS富集的神經(jīng)發(fā)育相關(guān)途徑主要是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)分化相關(guān)的通路, 例如視黃醇代謝、抗壞血酸代謝.抗壞血酸已被證明在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng) (PNS) 中具有重要功能.抗壞血酸可以通過(guò)形成含有膠原蛋白和層粘連蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)在體外促進(jìn)髓鞘形成[37].視黃酸可以促進(jìn)分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和外周感覺(jué)神經(jīng)元的軸突再生.在發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源性視黃酸能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元分化以及體外實(shí)驗(yàn)中視黃酸可以促進(jìn)分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和外周感覺(jué)神經(jīng)元的軸突再生[38].

TCC富集的神經(jīng)發(fā)育作用途徑主要是葉酸合成和ErbB信號(hào)通路,髓磷脂對(duì)于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中軸突快速準(zhǔn)確地傳導(dǎo)電脈沖至關(guān)重要.PNS中的髓鞘發(fā)育依賴(lài)于Nrg1/ErbB受體提供的軸突信號(hào).有證據(jù)表明,大腦中有一個(gè)最佳的NRG/ ERBB信號(hào)水平,偏離它會(huì)損害大腦功能[39]. NRGs/ERBBs和下游信號(hào)通路可能為特定的神經(jīng)精神癥狀提供治療靶點(diǎn).葉酸可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)中不同細(xì)胞的行為包括對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生趨化反應(yīng),誘導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子釋放,以及刺激細(xì)胞系統(tǒng)的神經(jīng)元分化.

BPA富集于Notch信號(hào)通路、Apelin信號(hào)通路.Notch信號(hào)通路是多細(xì)胞生物進(jìn)化上保守的信號(hào)通路,其已被證明可調(diào)節(jié)突觸分化和傳遞[40].有研究證明Notch信號(hào)是神經(jīng)形成過(guò)程中神經(jīng)周?chē)w移和分化所必需的,神經(jīng)周?chē)?xì)胞中Notch信號(hào)的丟失會(huì)導(dǎo)致雪旺細(xì)胞分化失敗[41].Apelin/APJ受體系統(tǒng)已被證明在下丘腦調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮作用,例如食物攝入、體液穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)內(nèi)分泌控制,以及心血管、胃腸運(yùn)動(dòng)和呼吸功能等自主神經(jīng)/內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)信號(hào)的調(diào)控[42].

2)三種內(nèi)分泌干擾物差異基因表達(dá)和富集的通路存在差異,并且TCC的差異更為顯著,可能是由于三種藥物結(jié)構(gòu)不同,構(gòu)效關(guān)系不同導(dǎo)致其作用的靶分子也不同.由于TCC分子結(jié)構(gòu)中含有的脲鍵可以作為調(diào)節(jié)藥物分子理化性質(zhì)的功能基團(tuán),調(diào)節(jié)分子間的氫鍵作用.而氫鍵是藥物與蛋白之間最主要的相互作用,其中脲鍵的羰基可作為氫鍵受體,-NH-既可為氫鍵供體也可為受體.故TCC中形成的氫鍵較多,所作用的靶蛋白可能較其他兩種藥物多,以及與靶蛋白作用的作用力可能強(qiáng)于其他兩種藥物[43].

3)通過(guò)進(jìn)行Hub基因篩選,發(fā)現(xiàn)TCS、TCC、BPA均能直接靶向于神經(jīng)相關(guān)的Hub基因誘導(dǎo)不同的神經(jīng)毒性,也可通過(guò)Hub基因間接地與神經(jīng)標(biāo)志功能基因的互作而誘導(dǎo)神經(jīng)毒性.

4)最后,我們?cè)u(píng)估了這三種內(nèi)分泌干擾物引起腦膠質(zhì)瘤的可能風(fēng)險(xiǎn),BPA暴露可能會(huì)通過(guò)影響NOTCH3的表達(dá)以及Raf信號(hào)通路導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生癌變繼而引起神經(jīng)膠質(zhì)瘤.TCS暴露可能會(huì)通過(guò)影響SOCS2的表達(dá)以及PIK3/AKT信號(hào)通路影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生及其預(yù)后.TCC暴露可能會(huì)通過(guò)影響STAT3、PPARG、CDKN1A等癌基因的表達(dá)導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生.

5)總而言之,這些發(fā)現(xiàn)使我們?cè)诜肿铀缴狭私饬巳N污染物誘導(dǎo)神經(jīng)毒性效應(yīng)的靶基因不同、作用的分子機(jī)制與途徑不同,為從分子水平上評(píng)判環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的健康風(fēng)險(xiǎn)與預(yù)警提供科學(xué)依據(jù).然而,還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明其如何通過(guò)Hub基因與神經(jīng)標(biāo)志基因的互作而誘導(dǎo)神經(jīng)毒性,以及通過(guò)經(jīng)典的通路抑制劑和激動(dòng)劑的使用證明具體信號(hào)通路的介導(dǎo)作用.另外對(duì)于內(nèi)分泌干擾物的暴露是否會(huì)增加腦膠質(zhì)瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)、易感性及其預(yù)后,以及內(nèi)分泌干擾物暴露的時(shí)間和劑量與誘發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系均需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí).

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Neurotoxicity effects of the three endocrine disruptors on zebrafish and the underlying molecular mechanisms by using the Illumina RNA-seq technique.

GUO Zi-yi1, WANG Wei-wei2, SONG Jie1, WANG Hui-li1*

(1.Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China；2.Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)., 2023,43(2)：946～956

Triclosan (TCS), triclocarban (TCC), and bispenol A (BPA) are all proved to possess endocrine disrupting effects; however, little data are available on their neurotoxicity effects on zebrafish () and the underlying molecular mechanisms. Herein, zebrafish transcriptomic data was obtained with the aid of RNA-Seq after exposure to the aforementioned three pollutants. By means of bioinformatics analysis, nine common positively differential expression genes (DEGs) were screened in the three exposure treatments. The GO functions and KEGG pathways of nine DEGs were mainly attributable to biological process, cellular component, and molecular function, in which the number and function were different with varying chemical exposure. Notably, most of the DEGs were found to be enriched in the nerve-related pathways, but their detailed pathways were different for three chemicals. The computation of node-correlation degree of PPI network showed that the hub genes enriched in neural pathways were different in the three treatments, which had rich and indirect interaction networks with neural marker genes. By integrating DEGs with GBM mutant gene of glioblastoma in the TCGA database, we confirmed that chemical exposure induced GBM risk, but the related occurrence pathway and regulatory signaling pathway were different. Therefore, the underlying neurotoxicity mechanisms induced by the three pollutants were disclosed at the molecular level.

endocrine disruptors；zebrafish；transcriptome sequencing；neurotoxicity；glioblastoma

X171

A

1000-6923(2023)02-0946-11

郭子一(2000-),女,山東棗莊人,蘇州科技大學(xué)碩士研究生,主要從事風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)與生態(tài)安全方面的研究.

2022-07-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(32071617)

* 責(zé)任作者, 教授, whuili@163.com