陳宣諭 張存明 馬健雄 吳忠標(biāo) 葉妙勇

紅景天是景天屬多年生草本植物的根莖，《晶珠本草》記載紅景天根莖入藥有清熱解毒、扶正固本之功效，而紅景天苷則是紅景天中的主要活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有多種藥理學(xué)活性，包括心血管系統(tǒng)及神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗氧化、抗癌、抗代謝失調(diào)等[1-2]。勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）指男性持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作3 個(gè)月以上不能獲得和/或維持必要的陰莖勃起完成性交，是最為常見的男性性功能障礙，約半數(shù)男性在40～70 歲之間均會(huì)呈現(xiàn)不同程度的ED[3-4]。中藥治療ED 有著數(shù)千年的歷史，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，以紅景天為君藥的益氣活血方可顯著改善神經(jīng)損傷大鼠ED，并且紅景天苷能夠調(diào)控自噬改善大鼠ED[5-6]，而其作用靶點(diǎn)與機(jī)制尚未明確。因此，本研究通過系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法聯(lián)合基于理論模擬評(píng)估的分子對(duì)接方法，對(duì)紅景天苷治療ED 的可能靶點(diǎn)與機(jī)制進(jìn)行探索，為紅景天苷的基礎(chǔ)研究與藥物研發(fā)提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）、pharmMapper（http://lilabecust.cn/pharmmapper/）、STRING 蛋白互作信息網(wǎng)站（http://string-db.org/）、SEA（Similarity ensemble approach）預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http://sea.bkslab.org/）、Draw Venn Diagram 網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、CTD 疾病基因數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org/）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM（https://omim.org/）、DisGeNet 疾病基因相關(guān)網(wǎng)站、比較毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（https://ctdbase.org）、AutoDock vina 軟件、R 語言4.1.0、Cytoscape 3.8.0 軟件（http://cytoscape.org/）。

1.2 紅景天苷作用靶點(diǎn) 從PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得紅景天苷的SDF 文件后導(dǎo)入至SwissTargetPrediction 及pharmMapper 網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，設(shè)置種屬為“Homo sapiens”進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。此外將SDF 獲得的SMILES 分子表達(dá)式導(dǎo)入到Similarity ensemble approach 預(yù)測(cè)網(wǎng)站篩選出藥物相關(guān)人類相關(guān)的靶點(diǎn)基因[7]。

1.3 ED 相關(guān)靶點(diǎn)收集 GeneCards 數(shù)據(jù)庫、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM、DisGeNet 疾病基因相關(guān)網(wǎng)站、CTD 疾病基因數(shù)據(jù)庫設(shè)置推理分值最低為30，將上述數(shù)據(jù)庫獲得的ED 相關(guān)靶點(diǎn)基因合并后刪除重復(fù)值共獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 紅景天苷與ED 交集靶點(diǎn)篩選及蛋白互作（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將紅景天苷的相關(guān)靶點(diǎn)與ED 相關(guān)靶點(diǎn)上傳至Draw Venn Diagram 網(wǎng)站進(jìn)行韋恩圖繪制，并獲得交集基因。交集基因上傳至STRING 網(wǎng)站，設(shè)置medium confidence=0.4，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)并傳輸至Cytoscape 3.8.0 軟件后根據(jù)蛋白degree 值進(jìn)行可視化作圖，由內(nèi)向外degree 值由高至低。此外紅景天苷-京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路-作用靶點(diǎn)相互關(guān)系使用Cytoscape 進(jìn)行可視化。

1.5 交集靶點(diǎn)功能富集分析 使用R 語言中clusterprofiler 包對(duì)紅景天苷-ED 共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）注釋及KEGG分析，結(jié)果以氣泡圖及柱狀圖呈現(xiàn)。GO 功能注釋包括生物途徑（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）以及細(xì)胞定位（celluar component，CC）。

1.6 核心靶基因挖掘 Cytoscape 3.8.0 軟件中使用Molecular Complex Detection（MCODE）與Cytohubba插件挖掘紅景天苷作用于ED PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心模塊與基因[8]，插件參數(shù)設(shè)定均默認(rèn)。MCODE 根據(jù)邊與節(jié)點(diǎn)關(guān)系，從而尋找出能夠挖掘PPI 中的核心模塊。Cytohubba 插件使用最大臨近成分（maximum neighborhood component，MNC）、最大團(tuán)塊中心（maximal clique centrality，MCC）、以及相互程度拓?fù)渌惴▽?duì)PPI 進(jìn)行分析，分別獲得前十的靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步取交集。

1.7 紅景天苷與核心靶基因分子對(duì)接 采用Molecular Operating Environment（MOE）軟件進(jìn)行分子對(duì)接，選取Cytohubba 與MCODE 分析出的核心靶點(diǎn)蛋白與紅景天苷進(jìn)行對(duì)接，使用PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得紅景天苷化合物的二維結(jié)構(gòu)式SDF 文件，紅景天苷的SDF 文件導(dǎo)入MOE 進(jìn)行能量最小化操作。靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)來自蛋白數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB），將獲得的PDB 結(jié)構(gòu)去水分子后進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理的蛋白結(jié)構(gòu)與紅景天苷的結(jié)構(gòu)文件進(jìn)行全原子模擬對(duì)接，獲得對(duì)接的二、三維結(jié)構(gòu)示意圖以及分子結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷作用靶點(diǎn) PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得紅景天苷的SDF 文件導(dǎo)入至SwissTargetPrediction 及pharmMapper 網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，設(shè)置種屬為“Homo sapiens”進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。此外將SDF 獲得的SMILES 分子表達(dá)式導(dǎo)入到SEA 網(wǎng)站，并篩選出藥物相關(guān)人類相關(guān)的靶點(diǎn)基因。將上述數(shù)據(jù)庫獲得的藥物相關(guān)靶點(diǎn)基因合并后刪除重復(fù)值共獲得藥物相關(guān)靶點(diǎn)379 個(gè)。

2.2 ED 相關(guān)靶點(diǎn)收集 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中獲取ED 相關(guān)靶點(diǎn)1700 個(gè)，人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫獲得的ED 相關(guān)靶點(diǎn)15 個(gè)，DisGeNet 疾病基因相關(guān)網(wǎng)站獲得ED 相關(guān)靶點(diǎn)256 個(gè)，CTD 疾病基因數(shù)據(jù)庫獲得ED 相關(guān)靶點(diǎn)1585 個(gè)，將上述數(shù)據(jù)庫獲得的ED相關(guān)靶點(diǎn)基因合并后刪除重復(fù)值共獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)2869 個(gè)，與紅景天苷的藥物相關(guān)靶點(diǎn)取交集得到142 個(gè)交集基因（見圖1）。

圖1 疾病及藥物潛在靶點(diǎn)

2.3 核心靶基因網(wǎng)絡(luò)圖及分析 STRING 網(wǎng)絡(luò)得到交集基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖有142 個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，1304 條相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），并對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)相互作用大小進(jìn)行排序，其中排名前十的節(jié)點(diǎn)為AKT1、GAPDH、VEGFA、IL6、EGFR、SRC、CASP3、HSP90A -A1、HRAS、ESR1。

圖2 紅景天苷作用靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

Cytohubba 的拓?fù)浞治鏊惴ü搏@得VEGFA、CASP3、HSP90AA1、SRC、IL6、GAPDH、HRAS、ESR1、AKT1、IGF1R、MMP9、EGFR 核心靶基因共12 個(gè)（見圖3A），MNC、MCC、Degree 的交集靶點(diǎn)8 個(gè)，包括VEGFA、CASP3、HSP90AA1、SRC、IL6、GAPDH、HRAS、ESR1。MCODE 分析得分最高的兩個(gè)模塊，分?jǐn)?shù)分別是22.6 與6.296。兩個(gè)模塊均包含了使用Cytohubba中分析得到的8 個(gè)核心靶基因，表明VEGFA、CASP3、HSP90AA1、SRC、IL6、GAPDH、HRAS、ESR1的重要功能（見圖3B、3C）。

圖3 Cytohubba 與MCODE 分析核心靶點(diǎn)

2.4 交集靶點(diǎn)功能富集分析 GO 富集分析上述142 個(gè)交集基因，獲得GO 富集的結(jié)果以調(diào)整后的P值進(jìn)行排序，并使用R 語言繪制柱狀圖（見圖4），其中GO 富集的生物過程（biological process，BP）主要涉及肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、類固醇激素的反應(yīng)、活性氧反應(yīng)等；GO 富集的分子功能（molecular function，MF）主要涉及囊腔、胞質(zhì)囊腔、膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域等；GO 富集的細(xì)胞組分（cellular component，CC）主要涉及核受體激活、轉(zhuǎn)錄因子激活-直接配體調(diào)控序列特異性DNA 活性、蛋白酪氨酸激酶活性、肽活性等。交集基因的KEGG 富集分析結(jié)果根據(jù)調(diào)整后P 值進(jìn)行排序后使用R 語言繪制氣泡圖（見圖5），主要包括PI3K-AKT 信號(hào)通路、癌癥蛋白聚糖通路、Rap1 信號(hào)通路、肝細(xì)胞癌通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路、前列腺癌通路、HIF-1 信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抵抗通路、膀胱癌等，其中PI3K-AKT 信號(hào)通路的GeneRation 為0.213，涉及該條通路的差異基因包括AKT1、AKT2、、CDK2、CDK6、EGFR、EPHA2、ERBB4、、FGF1、FGF2、FGFR1、GSK3B、HRAS 等。

圖4 紅景天苷治療ED 靶點(diǎn)的GO 富集分析

圖5 紅景天苷治療ED 靶點(diǎn)的KEGG 富集分析

2.5 紅景天苷與ED 關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接 紅景天苷與Caspase-3、ESR1、HSP90AA1、IL6、VEGFA 的分子結(jié)合能分別為-5.8730、-6.3824、-6.7591、-5.5853、-5.9959 kcal/mol（見表1），分子結(jié)合能數(shù)值越小表明二者的結(jié)合程度緊密，能夠發(fā)揮更強(qiáng)的相互作用，其中結(jié)合能<-5 表示二者對(duì)接程度較好。紅景天苷與Caspase-3、ESR1、HSP90AA1、IL6、VEGFA 的對(duì)接程度均較好，二、三維對(duì)接圖表明紅景天苷處于Caspase-3、ESR1、HSP90AA1、VEGFA 的活性口袋，因此對(duì)紅景天苷的包裹更佳（見圖6）。

圖6 藥物-核心靶點(diǎn)對(duì)接圖

表1 紅景天苷與靶基因結(jié)合能

3 討論

ED 中醫(yī)謂之“陽痿”，表現(xiàn)為陰莖無法勃起、勃而不堅(jiān)、堅(jiān)而不久，從而導(dǎo)致無法獲得滿意的性交[9]。前期研究表明紅景天為君藥的益氣活血方能夠引氣血入下焦起痿，改善海綿體神經(jīng)損傷后大鼠ED，而紅景天苷作為紅景天主要活性成分能夠調(diào)控自噬改善海綿體神經(jīng)損傷大鼠ED[5-6]，但是否有其他的作用靶點(diǎn)及機(jī)制仍需明確?，F(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接的方法能夠較為全面地挖掘中藥作用機(jī)制并初步闡明中藥藥理學(xué)作用機(jī)制[10]。

陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌均可分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），VEGFA 是VEGF 家族研究最為廣泛的亞型，作為一種多功能糖蛋白，可促進(jìn)海綿體平滑肌與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)血管生成，刺激內(nèi)源性NO 的產(chǎn)生維持陰莖勃起[11]。此外，ED 男性患者與雄性大鼠分別與正常對(duì)照比較，VEGFA 的表達(dá)量減少，因此VEGFA可能是治療ED 的重要靶點(diǎn)[12]。本研究顯示，VEGFA靶點(diǎn)富集顯著，而Ariyanti 等[13]研究表明紅景天苷能夠改善糖尿病患者下肢缺血并發(fā)癥，通過促進(jìn)VEGFA 分泌增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移潛能，誘導(dǎo)新生血管生成及血流灌注恢復(fù)，因此VEGFA 可能是紅景天苷治療ED 的重要治療靶點(diǎn)。

陰莖海綿體細(xì)胞的過度凋亡會(huì)引起ED，因此抑制凋亡達(dá)到治療ED 的目的[14]。Caspase 家族成員在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮主導(dǎo)作用，尤其是Caspase3 作為細(xì)胞凋亡執(zhí)行者，而紅景天苷與Caspase3對(duì)接活性良好。目前大量研究顯示紅景天苷能夠抑制細(xì)胞凋亡[15-16]，此外紅景天苷能夠抑制低氧誘導(dǎo)的Caspase3 表達(dá)進(jìn)而改善大鼠海綿體平滑肌細(xì)胞凋亡[17]。

合并糖尿病、高血壓及神經(jīng)損傷的ED 患者可出現(xiàn)陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞由“收縮型”向“合成型”的表型轉(zhuǎn)化，由于維持陰莖舒張和收縮功能的基本單位受損從而產(chǎn)生ED[18]。Okumu 等[19]對(duì)新生大鼠連續(xù)使用己烯雌酚干預(yù)6 d、21 d 后出現(xiàn)永久性陰莖畸形，陰莖實(shí)時(shí)熒光定量PCR 顯示雌激素受體1（ESR1）表達(dá)均明顯增加，肌球蛋白重鏈11（MYH11）mRNA 與蛋白表達(dá)量降低，同時(shí)α 平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組化染色表達(dá)減少，表明大鼠海綿體平滑肌細(xì)胞分化受到阻礙，然而使用ESR 拮抗劑后上述表性改變得到逆轉(zhuǎn)，因此ESR 通路可通過調(diào)控陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞分化維持正常陰莖形態(tài)。研究表明，紅景天苷可調(diào)控大鼠體內(nèi)、外缺氧誘導(dǎo)的陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[20]，而從雌激素及其受體通路著手研究海綿體表型轉(zhuǎn)化與ED 的研究尚未見報(bào)道。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，紅景天苷治療ED 的分子機(jī)制與PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)，并且該信號(hào)通路富集的基因最多，同時(shí)AKT1 是交集蛋白互作中最顯著的靶點(diǎn)，提示紅景天苷可能通過PI3K/AKT 通路治療ED?；A(chǔ)研究表明，PI3K/AKT 與ED密切相關(guān)，其中代謝綜合征與糖尿病誘發(fā)ED 的大鼠可通過調(diào)控陰莖海綿體內(nèi)PI3K/AKT 促進(jìn)eNOS（Ser1177）磷酸化水平及內(nèi)皮細(xì)胞增生，從而提高NO 與cGMP 的含量改善勃起功能[21-22]。

綜上所述，本研究表明紅景天中的主要成分紅景天苷能夠通過多成分-多靶點(diǎn)-多通路治療ED，為紅景天進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供了新方向與思路。通過分子對(duì)接驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，紅景天苷與五組靶標(biāo)蛋白結(jié)合性較好，且紅景天苷處于靶標(biāo)蛋白的活性口袋?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究藥物分子靶點(diǎn)治療疾病仍存在不足，其能夠系統(tǒng)預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)及通路，但是仍需要通過開展體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。