吳姝雯 劉 敏 樓毅杰 崔宇勝 劉承浩

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是臨床常見的便秘類型，占16%～40%[1]。電針“后三里”穴位可改善腸易激綜合征便秘大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的可塑性，推測該方法有助于治療便秘[2]。而STC 結(jié)腸肌間神經(jīng)叢病理改變，以結(jié)腸Cajal 間質(zhì)細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）神經(jīng)叢及突起分支減少、細胞網(wǎng)絡(luò)損毀為典型表現(xiàn)[3]。在STC 中線粒體自噬相關(guān)蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten-in-duced kinase 1，PINK1）/帕金蛋白（Parkin protein，Parkin）通路被激活，PINK1、Parkin、自噬效應(yīng)蛋白1（Beclin-1，Beclin1）、自噬相關(guān)蛋白3（light chain 3，LC3）表達升高，而原癌基因（C-kit）、p62 表達下降，導(dǎo)致ICC 細胞自噬增多、ICC 細胞減少[4]。本研究擬探討電針對STC 的作用與機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 8 周齡雄性健康SD 大鼠34 只，體質(zhì)量200～250 g，購自上海加科生物科技有限公司，許可證號：SCXK（滬）2020-0001。飼養(yǎng)條件依據(jù)清潔級要求，飼養(yǎng)室溫度保持在20～25 ℃，相對濕度50%～65%。飼養(yǎng)室采用光照定時裝置，提供適當?shù)模?2 h光照，12 h 黑暗）晝夜光變化周期，均予嚙齒動物標準顆粒飼料和飲水。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批通過（院準字202004-001）。

1.2 試劑洛哌丁胺（上海華氏制藥有限公司第十五制藥廠，批號20020913）；墨汁（德國DOKUMENTAL 公司）；10%活性炭懸液（河南中聚凈化材料有限公司，批號20201014）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號190516）；電鏡固定液、鋨酸溶液、醋酸鈾水溶液、甲苯胺蘭、檸檬酸鉛、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液、細胞裂解液、電化學發(fā)光液（美國Sigma 公司，批號20200304、20191215、20200117、20200225、20191214、20200311）；內(nèi)源性過氧化物酶（武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號R1911178）；兔抗鼠C-kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（一抗，Abcam 中國公司，批號190816、190913、190925、190611、191014、191207、191105），羊抗兔C-kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3、GAPDH 多克隆抗體（過氧化物酶標記）（二抗，Abcam 中國公司，批號190904、191025、191018、190803、191025、191217、191223）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（美國Bio-rad 公司，批號20191004）。

1.3 儀器 HL-DXG 型大鼠固定架（北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）；一次性針灸針（吳江市佳辰針灸器械有限公司，0.25 mm×25 mm）；SDZ-IIB 型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；500 型游標卡尺（上海九量五金工具有限公司）；RM2235 型組織切片機（德國Leica 公司）；PowerTome-XL 型超薄切片機（美國RMC 公司）；CX31 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；EVOS M5000 型免疫熒光共聚焦顯微鏡（美國Thermo 公司）；T10 型組織勻漿機（德國IKA 公司）；Image Pro-plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司）；DYCA 24F 蛋白質(zhì)凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；170-3940 型轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；SC 320 型搖床（上海達姆實業(yè)有限公司）。

2 實驗方法

2.1 建模方法 將34 只SD 大鼠采用隨機數(shù)字表分為正常對照組7 只和建模組27 只。建模組采用洛哌丁胺混懸液灌胃法制備STC 模型大鼠[5]，劑量3.0 mg/kg，正常對照組同時灌胃等量無菌生理鹽水，均每天1 次，連續(xù)6 d。末次灌胃結(jié)束，均灌胃2 mL 墨汁，自由飲水6 h，記錄建模組與正常對照組首粒黑便排出時間，即從墨汁灌胃結(jié)束到首粒黑便排出時間間隔，若建模組首粒黑便排出時間較正常對照組顯著延長，則認為建模成功[6]。于建模組、正常對照組中各隨機處死1 只大鼠暴露腸管、分離腸系膜，將回盲部上端與直腸末端結(jié)扎并剪斷腸管，取出大腸后輕拉成直線，剖開盲腸至直腸的腸系帶觀察糞便殘留情況，計算大腸碳素墨汁推進率，即大腸內(nèi)墨汁推進距離/大腸全長×100.00%。

2.2 分組及干預(yù)方法 驗證STC 建模成功后將模型組剩余存活大鼠采用隨機數(shù)字表分為模型對照組8 只、2 Hz 電針組6 只、50 Hz 電針組6 只、假電針組6 只，正常對照組剩余6 只存活大鼠?！昂笕铩倍ㄎ挥诿劰瞧脚_下方3 寸（約6.87 mm），在脛骨前緣外側(cè)約4.5 mm、腓骨頭尖下方0.84 mm 并向前約3.35 mm處，進針角度與脛骨前緣矢狀面呈45°，深度約6 mm。在“后三里”下約2 mm 刺入另一毫針作為參考電極（接負極），“后三里”穴位接正極。2 Hz 電針組予以電子針療儀頻率2 Hz、強度10 mA 刺激“后三里”，50 Hz 電針組予以電子針療儀頻率50 Hz、強度10 mA 刺激“后三里”，假電針組針刺“后三里”但電子針療儀不通電，模型對照組和正常對照組僅固定處理，每天30 min，每天1 次，持續(xù)14 d。

2.3 腸道推進率比較 各組大鼠分別于干預(yù)14 d后禁食不禁水24 h，灌服10%活性炭懸液2 mL，40 min 后脫臼法處死。參照1.2.1 中方法取出全段腸管，計算腸道推進率，即活性炭前端至幽門的距離/幽門至直腸末端總長度×100.00%。

2.4 結(jié)腸組織病理改變、ICC 形態(tài)觀察 生理鹽水沖洗大鼠結(jié)腸內(nèi)容物，分裝于37%的甲醛溶液中，固定后梯度濃度乙醇脫水透明（100%→95%→90%→80%→70%，其中每級脫水2～3 min）、石蠟包埋、連續(xù)切片（層厚4 μm），以二甲苯溶液脫蠟、酒精溶液水化，蘇木精染色后鹽酸酒精分化，伊紅復(fù)染，脫水、封片、光學顯微鏡下觀察。另取1 mm×1 m×1 mm 結(jié)腸組織標本分別置于電鏡固定液、鋨酸溶液中固定，飽和醋酸鈾水溶液中避光染色，脫水、干燥后純環(huán)氧丙烷處理，包埋后制作超薄切片（層厚0.2～0.4 μm）。甲苯胺蘭染色，再次切片（層厚50～60 nm），加入飽和醋酸鈾水溶液，室溫避光10 min；檸檬酸鉛染色，5 min后免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察ICC 形態(tài)并分析積分光密度（integrated optical density，IOD）。

2.5 結(jié)腸組織C-kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3 蛋白表達檢測 采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot，WB）法：取大鼠結(jié)腸組織研磨勻漿，細胞裂解液裂解，提取總蛋白并以BCA 試劑盒定量。30 μg 蛋白電泳，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，轉(zhuǎn)印時間35～40 min。沖洗后37 ℃封閉2 h，滴加一抗（稀釋倍數(shù)均1∶2000），4 ℃孵育過夜，沖洗3 次，劇烈洗滌；滴加二抗（稀釋倍數(shù)均1∶3000），沖洗3 次并劇烈洗滌。電化學發(fā)光法顯影，以GAPDH 為內(nèi)參，檢測蛋白條帶灰度×面積/（內(nèi)參條帶灰度×面積）即為蛋白相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 建模、分組情況及各組大鼠干預(yù)后腸道推進率比較 建模組大鼠6 d 后均出現(xiàn)活動減少、食量減少、毛發(fā)色澤暗淡且枯萎脫落、大便數(shù)量減少等表現(xiàn)，正常對照組大鼠活動、食量、大便均正常，毛發(fā)有光澤且濃密。建模組大鼠首粒黑便排出時間為306～418（355.67±42.05）min；正常對照組大鼠首粒黑便排出時間為215～297（261.34±34.45）min。建模組較正常對照組顯著延長（t=46.753，P＜0.001），證實STC 大鼠模型構(gòu)建成功。另正常對照組大鼠大腸碳素墨汁推進率、糞便含水率分別為65.42%、68.75%，建模組分別為50.12%、53.04%。

干預(yù)期間各組大鼠均無死亡。與正常對照組比較，其余各組大鼠腸道推進率下降（P＜0.05）；與模型對照組和假電針組比較，2 Hz 電針組、50 Hz 電針組腸道推進率均升高（P＜0.05）；與2 Hz 電針組比較，50 Hz 電針組腸道推進率升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)后腸道推進率比較（%，）

表1 各組大鼠干預(yù)后腸道推進率比較（%，）

注：2 Hz 電針組予以電子針療儀頻率2 Hz、強度10 mA 刺激“后三里”，50 Hz 電針組予以電子針療儀頻率50 Hz、強度10 mA 刺激“后三里”，假電針組針刺“后三里”但不通電，模型對照組和正常對照組僅固定處理，與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05；與假電針組比較，cP＜0.05；與2 Hz 電針組比較，dP＜0.05

3.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理變化 正常對照組大鼠結(jié)腸組織可見完整的黏膜，且腸壁黏膜層、黏膜下層、肌層與外膜層均結(jié)構(gòu)清晰、層次明確，柱狀細胞與腺體排列整齊；模型對照組和假電針組黏膜層間質(zhì)有嚴重充血、擴張表現(xiàn)，各層次結(jié)構(gòu)不清，有嚴重上皮損傷（肌層顯著變薄、絨毛顯著減少）；2 Hz 電針組黏膜層間質(zhì)有充血、擴張表現(xiàn)，各層次結(jié)構(gòu)輕微紊亂，可見上皮損傷（肌層變薄、絨毛減少）；50 Hz 電針組黏膜層間質(zhì)基本正常，各層次結(jié)構(gòu)基本清晰，上皮輕微損傷（肌層稍薄、絨毛稍少）。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理變化（HE 染色，×200，刻度尺：50 μm）

3.3 各組大鼠ICC 形態(tài)變化 正常對照組大鼠ICC呈星形，主要分布于環(huán)形肌深部肌間神經(jīng)叢，有3～5個突觸，不同ICC 間通過突觸連接形成網(wǎng)絡(luò)，且結(jié)構(gòu)完整，長突觸與平滑肌緊密連接、網(wǎng)絡(luò)清晰；模型對照組和假電針組大鼠ICC 突觸顯著減少，連接松散，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)遭到顯著損壞；2 Hz 電針組ICC 突觸減少、連接不緊密，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)遭到損壞；50 Hz 電針組ICC 突觸數(shù)量、連接基本正常，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)基本完整（見圖2）。與正常對照組大鼠比較，其余四組ICC 數(shù)量、免疫熒光IOD 值均下降（P＜0.05）；與模型對照組和假電針組比較，2 Hz 電針組和50 Hz 電針組ICC數(shù)量、免疫熒光IOD 值均升高（P＜0.05）；與2 Hz 電針組比較，50 Hz 電針組ICC 數(shù)量、免疫熒光IOD 值均升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠ICC 數(shù)量、免疫熒光IOD 值比較（）

表2 各組大鼠ICC 數(shù)量、免疫熒光IOD 值比較（）

注：2 Hz 電針組予以電子針療儀頻率2 Hz、強度10 mA 刺激“后三里”；50 Hz 電針組予以電子針療儀頻率50 Hz、強度10 mA 刺激“后三里”；假電針組針刺“后三里”但不通電；模型對照組和正常對照組僅固定處理；ICC 為結(jié)腸Cajal 間質(zhì)細胞；IOD 為積分光密度；與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05；與假電針組比較，cP＜0.05；與2 Hz 電針組比較，dP＜0.05

圖2 各組大鼠ICC 形態(tài)變化（免疫熒光共聚焦顯微鏡，×200，刻度尺：50 μm）

3.4 各組大鼠結(jié)腸組織C-Kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3 蛋白表達比較 與正常對照組比較，其余四組C-kit、p62 蛋白表達均下降（P＜0.05），PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 蛋白表達均升高（P ＜0.05）；與模型對照組和假電針組比較，2 Hz 電針組和50 Hz 電針組C-kit、p62 蛋白表達均升高（P＜0.05），PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 蛋白表達均下降（P＜0.05）；與2 Hz 電針組比較，50 Hz 電針組C-kit、p62 蛋白表達均升高（P＜0.05），PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 蛋白表達均下降（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織C-Kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3 蛋白表達比較（）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織C-Kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3 蛋白表達比較（）

注：2 Hz 電針組予以電子針療儀頻率2 Hz、強度10 mA 刺激“后三里”；50 Hz 電針組予以電子針療儀頻率50 Hz、強度10 mA 刺激“后三里”，假電針組針刺“后三里”但不通電；模型對照組和正常對照組僅固定處理；C-Kit 為原癌基因；PINK1 為線粒體自噬相關(guān)蛋白；Parkin 為帕金蛋白；Beclin1 為自噬效應(yīng)蛋白1；p62 為核孔糖蛋白；LC3 為自噬相關(guān)蛋白3；與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05；與假電針組比較，cP＜0.05；與2Hz 電針組比較，dP＜0.05

4 討論

STC 發(fā)病原因復(fù)雜，主要表現(xiàn)為大腸功能紊亂、傳導(dǎo)異常，可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、ICC 自噬增多、激素水平異常、中樞及自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能障礙等有關(guān)。有研究顯示，STC 結(jié)腸ICC 細胞突觸減少，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)遭損壞，自噬小體增多，細胞自噬嚴重可導(dǎo)致平滑肌收縮、運動失常，進而引起結(jié)腸傳導(dǎo)功能障礙[7]。因此減少STC 結(jié)腸ICC 自噬是治療STC 的重要方向。

本研究利用洛哌丁胺混懸液灌胃法制備STC 模型大鼠，建模組首粒黑便排出時間較正常對照組顯著延長，證實建模成功，且大腸碳素墨汁推進率、糞便含水率均低于正常對照組，為后續(xù)實驗提供了條件。本研究還發(fā)現(xiàn)，2 Hz 電針組和50 Hz 電針組腸道推進率均低于正常對照組，但均高于模型對照組和假電針組，且50 Hz 電針組腸道推進率高于2 Hz 電針組，表明對STC 模型大鼠予以電針“后三里”有確切效果，且50 Hz 電針效果更佳。電針療法是針刺法的改良，能夠代替手工操作并客觀控制刺激量，還可利用電刺激疏經(jīng)通絡(luò)、溫通氣血、祛邪扶正[8]。電針“后三里”穴位可調(diào)節(jié)五臟六腑功能，促進腸道蠕動，在STC 治療中有應(yīng)用價值。而本研究中假電針組腸道推進率與模型對照組相當，說明僅針刺“后三里”對STC 大鼠模型無效，與唐歐風等[9]報道的結(jié)論不一致，可能是因為本研究中僅將針刺入“后三里”穴位，但未實施手法治療，其未通電刺激，而在上述報道中將針刺入穴位后有得氣、捻針、留針等操作。本研究還發(fā)現(xiàn)，2 Hz 電針組和50 Hz 電針組結(jié)腸病理、ICC形態(tài)均較模型對照組、假電針組顯著減輕，且50 Hz電針組接近正常對照組，與上述分析相符。

STC 結(jié)腸ICC 的過度自噬可導(dǎo)致線粒體功能障礙[10]。在此過程中，結(jié)腸組織C-Kit 表達下降，而PINK1 轉(zhuǎn)移受阻，PINK1/Parkin 通路被激活，可使得ICC 分化不足或不成熟造成損傷，減低線粒體膜電位，同時還可促進自噬體形成并與溶酶體相融合，產(chǎn)生自噬體溶酶體，啟動線粒體自噬，而線粒體大量自噬可導(dǎo)致腸運動及傳輸功能障礙，最終引發(fā)STC[11]。對結(jié)腸ICC 阻斷PINK1/Parkin 信號通路傳導(dǎo)可減少自噬，維持正常的細胞形態(tài)與功能，并使得其網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)保持完整，且平滑肌的結(jié)構(gòu)和功能也可維持正常，是STC 治療的新方向[12]。本研究中2 Hz 電針組與50 Hz 電針組結(jié)腸組織C-kit、p62 表達均低于正常對照組但均較模型對照組和假電針組升高，而二者結(jié)腸組織PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 表達均高于正常對照組但均較模型對照組和假電針組降低，推測電針“后三里”很可能能夠通過上調(diào)結(jié)腸組織C-kit 表達，抑制PINK1/Parkin 通路從而發(fā)揮對STC 大鼠模型的治療作用的，且50 Hz 電針的效果更佳。

綜上所述，電針“后三里”可能能夠提高STC 模型大鼠腸道推進率，減輕結(jié)腸組織病理和ICC 形態(tài)學改變，減少ICC 線粒體自噬，且可上調(diào)結(jié)腸組織C-kit 表達，抑制PINK1/Parkin 通路，下調(diào)PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 表達，抑制p62 表達，其中50 Hz電針的作用顯著優(yōu)于2 Hz 電針。