黃宇，李響，胡旭

膀胱癌是產(chǎn)生于膀胱壁上皮組織和間質組織的惡性腫瘤，臨床特征主要表現(xiàn)為肉眼可見的間歇性血尿、腎積水、膀胱刺激癥(尿痛、尿頻、尿急)等，嚴重危害人們生命健康[1-2]。目前臨床上非肌層浸潤性膀胱癌患者通過尿道膀胱腫瘤切除手術治療預后良好，但肌層浸潤性且發(fā)生遠處轉移的膀胱癌患者經(jīng)手術治療后效果不理想，預后較差，有45%～80%的患者出現(xiàn)復發(fā)，再次就診時已嚴重擴散，患者3年內(nèi)生存率仍沒有得到很大提高[3-4]。因此，尋找與膀胱癌有關的靶基因并深入探索其發(fā)病機制，對提高患者生存率具有重要意義。成髓細胞瘤轉錄因子第2亞型(MYB proto-oncogene like 2，MYBL2)是癌基因編碼轉錄因子，在細胞增殖、生長、分化等過程中起重要作用[5]。研究表明，MYBL2參與腎細胞癌、胃癌、肺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[6-8]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類非編碼小分子RNA，在細胞生長、分化、增殖等過程中具有極其重要的作用，可調控多種mRNA的表達，其在許多癌癥疾病中具有早期診斷和準確評估預后情況的巨大潛力[9-10]。miR-631作為一種miRNA，在卵巢上皮性癌等腫瘤中起重要作用[11]。但是MYBL2、miR-631二者在膀胱癌中的表達情況及功能尚未可知。因此現(xiàn)研究膀胱癌組織中MYBL2、miR-631表達水平，并分析它們與患者預后的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2019年5月在四川大學華西醫(yī)院泌尿外科行手術治療的膀胱癌患者133例，術中取患者膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織。其中男81例，女52例，年齡41～80(55.34±12.29)歲；TNM分期[12]：T1～2期81例，T3～4期52例；腫瘤分化程度：中高分化86例，低分化47例；發(fā)生淋巴結轉移55例，無淋巴結轉移78例；病理類型：膀胱尿路上皮癌110例，鱗狀細胞癌13例，腺癌10例。納入標準：(1)符合膀胱癌診斷標準[12]，且經(jīng)病理學確診；(2)首次患膀胱癌；(3)所有膀胱癌患者在手術前均未進行任何免疫治療、放化療或其他輔助治療；(4)無腎、肺、心臟等其他重要器官疾病。排除標準：(1)膀胱癌家族遺傳史；(2)長期服用抑制劑或免疫增強劑藥物者；(3)合并其他惡性腫瘤；(4)存在嚴重心血管疾病、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、感染性疾病者；(5)肝腎功能異常者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(審批號LSJD2016-191)，且患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 MYBL2 mRNA、β-actin、miR-631、U6由北京賽百盛基因技術有限公司構建；Trizol試劑、兔抗人MYBL2單克隆抗體(上海鈺博生物科技有限公司)；PCR試劑盒、山羊抗兔二抗(南京新惠通生物科技有限公司)；PCR基因擴增儀(上海凌儀生物科技有限公司，型號EP1)；顯微鏡(東莞市譜標實驗器材科技有限公司，型號SPCC-200)。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 MYBL2 mRNA、miR-631表達水平檢測：采用熒光定量PCR法進行檢測，將膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織制成勻漿，提取組織中總RNA，之后反轉錄為cDNA模板，使用PCR試劑盒對MYBL2 mRNA、miR-631進行擴增。反應條件為95℃ 5 min；91℃ 19 s、55℃ 21 s、60℃ 22 s，循環(huán)31次。MYBL2 mRNA上游引物：5’-CTAGACCGGTTTCTCCTCATTC-3’，下游引物：5’-GCGTGATTGGCGGTCAAAAGAG-3’；內(nèi)參β-actin上游引物：5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’，下游引物：5’-GCTGTCAACCGTTCCAGGTCG-3’。miR-631上游引物：5’-TCTGGCTCCGTGTCTTC-3’，下游引物：5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；內(nèi)參U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-△△CT法分析MYBL2 mRNA、miR-631的表達水平。

1.3.2 MYBL2表達情況檢測：采用免疫組化法檢測，標本經(jīng)石蠟包埋后，制作5 μm的膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織石蠟切片，將其編碼并烘干，進行脫蠟、修復抗原等一系列操作后，加入兔抗人MYBL2單克隆抗體(1∶500)作為一抗，4℃過夜，使用磷酸緩沖溶液清洗后加入山羊抗兔二抗25℃孵育1 h，使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木素輕微復染。使用顯微鏡高倍視野(×200)下觀察切片，PBS代替一抗作為空白對照。染色強度評分：0分(無)、1分(弱，淺黃色)、2分(中等，棕黃色)、3分(強，棕褐色)。陽性細胞百分比評分：0分(0～5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(76%～100%)。將染色強度評分和陽性細胞百分比評分的乘積作為總計分[13]：0分為陰性(-)，1～5分為弱陽性(+)，6～9分為中度陽性(++)，10～12分為強陽性(+++)，其中，陰性(-)記為MYBL2陰性，弱陽性(+)、中度陽性(++)、強陽性(+++)記為MYBL2陽性。

1.3.3 隨訪情況：通過電話、醫(yī)院復查或家訪等方式對膀胱癌患者進行3年隨訪，術后第1天為隨訪起始日期，術后第1年每3個月醫(yī)院復查1次，第2、3年每6個月醫(yī)院復查1次，3年內(nèi)每2個月通過電話或家訪，記錄膀胱癌患者生存情況。隨訪截止日期2022年5月31日，以膀胱癌患者3年內(nèi)死亡定義為預后不良。

2 結 果

2.1 預后良好組與預后不良組臨床資料比較 經(jīng)過3年隨訪，患者生存89例(預后良好組)，死亡44例(預后不良組)，無失訪病例。預后不良組T3～4期、低分化、有淋巴結轉移患者比例顯著高于預后良好組(P<0.01)，見表1。

表1 預后良好組與預后不良組膀胱癌患者臨床資料比較

2.2 膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織MYBL2 mRNA、miR-631表達水平及MYBL2陽性表達率比較 與癌旁正常膀胱組織比較，膀胱癌組織MYBL2 mRNA表達水平、MYBL2陽性率明顯升高，miR-631表達水平明顯降低(P<0.01)，見表2、圖1。

表2 膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織MYBL2 mRNA、miR-631表達水平及MYBL2陽性率比較

圖1 膀胱癌組織MYBL2表達情況(免疫組化染色，×200)

2.3 膀胱癌組織MYBL2與miR-631的相關性分析 生物信息學ENCORI網(wǎng)站顯示，MYBL2、miR-631存在結合位點。Spearman相關性分析發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織MYBL2與miR-631表達呈負相關(r=-0.424，P<0.001)。

2.4 膀胱癌組織MYBL2、miR-631表達與患者的預后關系 MYBL2陽性組、陰性組3年生存率分別為62.50%(70/112)、90.48%(19/21)，MYBL2陽性組3年生存率低于MYBL2陰性組(χ2=5.052，P=0.025)；根據(jù)膀胱癌組織miR-631表達水平均數(shù)(0.71)將患者分為miR-631高表達組56例(≥0.71)，miR-631低表達組77例(<0.71)；miR-631低表達組、高表達組3年生存率分別為58.44%(45/77)、78.57%(44/56)，miR-631低表達組3年生存率低于miR-631高表達組(χ2=5.934，P=0.015)，見圖2。

圖2 膀胱癌組織MYBL2、miR-631表達與患者3年內(nèi)生存的關系

2.5 Logistic回歸分析膀胱癌患者預后不良的危險因素 多因素Logistic回歸分析表明，TNM分期T3～4期、腫瘤低分化、有淋巴結轉移及膀胱癌組織MYBL2陽性、miR-631低表達是影響膀胱癌患者預后不良的危險因素(P<0.01)，見表3。

表3 Logistic回歸分析膀胱癌患者預后不良的危險因素

3 討 論

膀胱癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于50歲以上中老年人，我國每年約有7萬多例新確診的患者，且男性患病率高于女性，膀胱癌在我國男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病中排名第8位，具有較高的發(fā)病率、復發(fā)率和病死率，近年來，膀胱癌的患病率、致死率仍逐年上升，且具有趨向年輕化的特點[14-15]。膀胱癌發(fā)病初期病情隱匿，一些患者就診時已經(jīng)發(fā)生了遠處轉移，治療后復發(fā)和轉移是患者預后較差、3年生存率較低的重要原因[16-17]。因此，尋找與膀胱癌有關的合適的預測因子，可為膀胱癌的臨床診治和預后評估提供重要依據(jù)。

MYBL2是轉錄因子MYB家族的成員之一，是高度保守的癌基因編碼轉錄因子，可參與調控細胞周期、細胞增殖分化、細胞生存等多種生理病理過程[18]。盧洪勝等[19]研究結果表明，MYBL2在胃腺癌組織中呈高表達，且MYBL2高表達患者預后不良，提示MYBL2可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結果表明，膀胱癌組織中MYBL2 mRNA表達水平和MYBL2陽性表達率明顯高于癌旁正常膀胱組織，提示MYBL2在膀胱癌的發(fā)生中發(fā)揮一定作用；Kaplan-Meier結果顯示，MYBL2陽性組3年生存率低于MYBL2陰性組，提示MYBL2高表達患者預后不良；多因素Logistic回歸分析表明，MYBL2陽性是影響膀胱癌患者預后不良的危險因素，提示MYBL2可作為膀胱癌患者預后評估的腫瘤標志物。

大量研究表明，miRNAs在多種惡性腫瘤侵襲轉移等過程起著不可忽視的作用，近年來，其在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用引起了研究者們的極大興趣[20-21]，例如，miR-137在膀胱癌組織中呈高表達，且其水平隨患者病理分級惡性程度的增加而升高，miR-137在膀胱癌的侵襲轉移等過程中具有極其重要的作用[22]。郝朝輝等[23]研究結果表明，miR-182-5p在膀胱癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，miR-182-5p可能具有促進膀胱癌發(fā)生的作用。miR-631作為一種miRNAs，在細胞增殖、分化、凋亡等過程具有重要作用，余丹揚等[11]研究結果表明，卵巢上皮性癌患者miR-631表達下調，且miR-631低表達患者預后不良。miR-631在膀胱癌中發(fā)揮的作用研究較少，本研究結果表明，膀胱癌組織中miR-631表達水平明顯低于癌旁正常膀胱組織，提示miR-631在膀胱癌的發(fā)生中發(fā)揮一定作用；Kaplan-Meier結果顯示，miR-631低表達組3年生存率低于miR-631高表達組，提示miR-631低表達患者預后不良。多因素Logistic回歸分析表明，TNM分期T3～4期、腫瘤低分化、有淋巴結轉移、miR-631低表達是影響膀胱癌患者預后不良的危險因素，提示miR-631可作為膀胱癌患者預后評估的腫瘤標志物，且臨床上要重點關注T3～4期、腫瘤低分化、淋巴結轉移的患者，及時給予患者干預和治療，以減少不良預后的發(fā)生。生物信息學ENCORI網(wǎng)站顯示，MYBL2、miR-631存在結合位點，本研究經(jīng)進一步Spearman分析發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中MYBL2與miR-631表達呈負相關，提示MYBL2、miR-631可能存在某種靶向關系，共同參與膀胱癌的發(fā)生進展過程。

綜上所述，miR-631可能通過負調控MYBL2的表達參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程，MYBL2陽性、miR-631低表達均與膀胱癌的發(fā)生及不良預后有關，檢測MYBL2、miR-631水平對膀胱癌的早期防治及預后評估具有重要意義。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

黃宇：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；李響：病例收集，數(shù)據(jù)整理；胡旭：統(tǒng)計學分析，論文修改