王菲，錢萌，歐陽怡，薛曉婕

支氣管哮喘急性發(fā)作(acute exacerbation of bronchial asthma，AEBA)在世界范圍內(nèi)影響了0.3%～9.2%的人群，且發(fā)病人數(shù)仍以較高速率增長[1]。研究證實(shí)，細(xì)菌感染是繼呼吸道合胞病毒感染之后誘發(fā)AEBA的第二大因素，且細(xì)菌感染誘發(fā)的AEBA患者存在更高復(fù)發(fā)率[2]。臨床評估細(xì)菌感染類型對指導(dǎo)早期經(jīng)驗(yàn)性選擇抗生素有積極作用。臨床研究證實(shí)，以髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2，MD-2)為靶點(diǎn)治療脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的相關(guān)疾病效果明顯，而LPS則主要存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁[3]。嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophilia，EOS)同樣對LPS有調(diào)控作用，其水平變化與LPS直接相關(guān)[4]?，F(xiàn)分析不同細(xì)菌感染類型AEBA患者血清MD-2、EOS%表達(dá)水平變化，以尋找兩者鑒別細(xì)菌感染類型的臨界點(diǎn)，為臨床早期用藥提供指導(dǎo)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年8月—2022年2月鄂東醫(yī)療集團(tuán)市中心醫(yī)院/湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的AEBA患者94例為觀察組，男53例，女41例，年齡45～68(56.63±5.27)歲。另選取同期醫(yī)院健康體檢者94例為健康對照組，男50例，女44例，年齡43～69(55.39±5.44)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(KY202007-32)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組患者均符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，急性發(fā)作期，且誘因?yàn)楹粑兰?xì)菌感染；健康對照組體檢結(jié)果無異常，無支氣管哮喘史及家族遺傳史；年齡>18歲，<70歲；近1個月未服用抗生素、激素等影響呼吸道生態(tài)環(huán)境的藥物。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：合并結(jié)核病、急性心力衰竭；肝腎功能異常；病毒感染、肺炎支原體感染；呼吸道畸形；妊娠期、哺乳期女性；合并自身免疫性疾病；合并其他肺部疾??；肺部發(fā)育不良。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 檢測呼吸道菌群分布特征：受試人員清晨以生理鹽水漱口，用力咯出深部痰送檢；標(biāo)本接種于巧克力平板、血平板、中國藍(lán)平板，其中中國藍(lán)平板置于培養(yǎng)箱(35℃)培養(yǎng)，巧克力平板、血平板置于二氧化碳孵箱(35℃)培養(yǎng)，48 h后觀察，挑取單個菌落進(jìn)行革蘭染色，以細(xì)菌生化鑒定管(杭州天和微生物試劑有限公司)進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3.2 臨床資料收集：通過問卷調(diào)查方式收集AEBA患者臨床資料，包括性別、年齡、哮喘病程、病情程度、合并癥、吸煙史、鼻炎史等，記錄是否存在侵入性操作；檢測第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide，F(xiàn)eNO)；檢測血清降鈣素原(procalcitonin，PCT)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、血總免疫球蛋白E(total immunoglobulin E，TIgE)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell count，WBC)水平；以急性發(fā)作期哮喘感知控制力問卷評估其控制力，共11個條目，每項(xiàng)1～5分，分值越高表明控制力越好。

1.3.3 血清MD-2及EOS%檢測：觀察組入院時、健康對照組體檢時抽取受試人員晨起空腹肘靜脈血6 ml分為2份，每份3 ml，1份離心提取上層血清，另1份血液樣本肝素抗凝。取血清樣本根據(jù)酶聯(lián)免疫法試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?順序每孔加入50 μl終止反應(yīng)，于Aurora-600型酶標(biāo)儀(杭州海沛儀器有限公司)調(diào)至450 nm處，5 min后測量光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度值。采用全自動貝克曼五分類血細(xì)胞分析儀檢測EOS，計(jì)算EOS%。

1.4 病情程度判定標(biāo)準(zhǔn)[6]輕度：步行或上樓時氣短，呼吸頻率稍微增加，肺通氣功能、血?dú)鈾z查正常；中度：稍微活動偶感氣促，講話有中斷，呼吸頻率增加明顯，可聞及哮鳴音，有三凹征，血氧飽和度91%～95%，呼氣峰值流速障礙預(yù)計(jì)值60%～80%；重度：休息時氣短，端坐呼吸，呼吸頻率>30次/min，有三凹征，可聞及哮鳴音，心率>124次/min，血氧飽和度≤90%，血?dú)鈖H降低。

2 結(jié) 果

2.1 AEBA患者呼吸道菌群分布特征 AEBA患者94例共分離細(xì)菌102株，其中革蘭陰性菌74株(72.55%)，包括流感嗜血菌22株(21.57%)、卡他莫拉菌17株(16.67%)、感染大腸埃希菌13株(12.75%)、肺炎克雷伯菌11株(10.78%)、銅綠假單胞菌6株(5.88%)、陰溝腸桿菌3株(2.94%)、鮑曼不動桿菌2株(1.96%)；革蘭陽性菌28株(27.45%)，包括肺炎鏈球菌18株(17.65%)、金黃色葡萄球菌6株(5.88%)、表皮葡萄球菌3株(2.94%)、腸球菌1株(0.98%)。單純感染革蘭陰性菌患者63例，單純感染革蘭陽性菌患者26例，同時感染革蘭陰性菌、革蘭陽性菌患者5例(流感嗜血菌與肺炎鏈球菌3例，卡他莫拉菌與金黃色葡萄球菌1例，卡他莫拉菌與肺炎鏈球菌1例)。

2.2 不同類型細(xì)菌感染患者臨床資料比較 剔除同時感染革蘭陰性菌、革蘭陽性菌的患者5例。革蘭陰性菌感染者病情程度重度比例及血清MD-2、EOS%、PCT水平高于革蘭陽性菌感染者，控制力評分低于革蘭陽性菌感染者(P<0.05)，見表1。

表1 革蘭陰性菌與革蘭陽性菌感染AEBA患者臨床資料比較

2.3 2組血清MD-2、EOS%比較 觀察組血清MD-2、EOS%均高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 健康對照組與觀察組血清MD-2、EOS%水平比較

2.4 不同病情程度AEBA患者血清MD-2、EOS%比較 觀察組94例患者輕度35例，中度37例，重度22例，血清MD-2、EOS%水平隨病情程度加重而升高(P均<0.01)，見表3。

表3 不同病情程度AEBA患者血清MD-2、EOS%比較

2.5 AEBA患者血清MD-2、EOS%與病情程度的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清MD-2、EOS%與AEBA患者病情程度均呈正相關(guān)(r=0.842、0.846，P均<0.001)。

2.6 不同細(xì)菌感染類型危險(xiǎn)因素分析 將病情程度、血清MD-2、EOS%、控制力評分、PCT進(jìn)行多重共線性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MD-2、EOS%水平與病情程度存在多重共線性(VIF>5)，手動移除病情程度。以不同細(xì)菌感染類型為因變量(賦值：革蘭陰性菌=1，革蘭陽性菌=0)，以血清MD-2、EOS%、控制力評分、PCT為自變量(均以實(shí)際值進(jìn)行賦值)，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，EOS%高、血清MD-2高是AEBA患者感染革蘭陰性菌的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表4 不同細(xì)菌感染類型危險(xiǎn)因素分析

2.7 血清MD-2、EOS%鑒別AEBA患者細(xì)菌感染類型的價值 繪制ROC曲線結(jié)果顯示，血清MD-2、EOS%及二者聯(lián)合鑒別AEBA患者細(xì)菌感染類型的曲線下面積(AUC)分別為0.778、0.772、0.877，二者聯(lián)合鑒別效能大于單項(xiàng)指標(biāo)(Z/P=2.118/0.034、2.366/0.018)，見表5、圖1。

表5 血清MD-2、EOS%鑒別AEBA患者細(xì)菌感染類型的價值

圖1 血清MD-2、EOS%鑒別AEBA患者細(xì)菌感染類型的ROC曲線

3 討 論

AEBA在世界范圍內(nèi)均較常見，有數(shù)據(jù)顯示[7]，2018年我國≤19歲支氣管哮喘患者病死率為2.3%。相關(guān)研究認(rèn)為[8]，哮喘發(fā)作次數(shù)、住院史、鼻部結(jié)構(gòu)異常、家里養(yǎng)動物是支氣管哮喘患者合并感染的危險(xiǎn)因素，細(xì)菌感染是導(dǎo)致AEBA發(fā)生及病情進(jìn)展的重要誘因。一項(xiàng)研究顯示[9]，64例AEBA患者中有29例為細(xì)菌感染所致，而檢測到最多的病原微生物為流感嗜血菌。本研究細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，分離最多的菌株同樣為流感嗜血菌，其次為肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌，其中革蘭陰性菌明顯更多。支氣管哮喘合并細(xì)菌感染患者多存在黏液分泌增加、支氣管黏膜腫脹癥狀，進(jìn)一步造成氣道狹窄，促使呼吸困難加重。支氣管黏膜感染細(xì)菌后通過輔助T淋巴細(xì)胞及相關(guān)因子增加氣道高反應(yīng)性，可直接導(dǎo)致哮喘再次發(fā)作；同時細(xì)菌還可通過神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制、免疫機(jī)制誘發(fā)哮喘。另外，細(xì)菌感染會產(chǎn)生黏膜變應(yīng)性炎性反應(yīng)，分泌大量白介素，形成細(xì)胞因子風(fēng)暴現(xiàn)象，提高免疫性疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，對細(xì)菌感染誘發(fā)的AEBA患者應(yīng)積極控制呼吸道微生態(tài)平衡，而及早明確細(xì)菌類型對指導(dǎo)臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥有一定幫助。既往主要采用細(xì)菌培養(yǎng)明確細(xì)菌感染類型，但該檢測方法具有明顯滯后性，主要用于后續(xù)治療中將早期經(jīng)驗(yàn)性抗生素更換為敏感度更高的抗生素，而對早期經(jīng)驗(yàn)性用藥無直接幫助，選擇可及早鑒別細(xì)菌類型的客觀指標(biāo)具有臨床價值。

MD-2與哮喘常見過敏原塵螨具有結(jié)構(gòu)、功能同源性，可通過與Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)復(fù)合物直接作用而介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，相關(guān)研究證實(shí)[10]，MD-2可調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞炎性因子，對塵螨誘導(dǎo)的過敏性哮喘有保護(hù)作用，是臨床治療哮喘的新靶點(diǎn)。已有臨床研究證實(shí)[11]，抑制MD-2可通過抑制TLR4信號通路減輕氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組血清MD-2水平明顯較健康對照組高，且隨病情程度加重其水平呈上升趨勢，提示血清MD-2對AEBA發(fā)生、進(jìn)展有促進(jìn)作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，感染革蘭陰性菌的患者血清MD-2水平明顯更高，這可能與革蘭陰性菌細(xì)胞壁中含有較多LPS有關(guān)。既往研究認(rèn)為[12]，LPS可與其結(jié)合蛋白相結(jié)合，在MD-2輔助下傳遞信號至TLR4，誘導(dǎo)TLR4低聚化，形成LPS信號細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)。但近年來相關(guān)報(bào)道指出[13]，MD-2不僅能增強(qiáng)TLR4識別LPS，其本身作為LPS聯(lián)系TLR4的橋梁還具有重要調(diào)控作用。MD-2分子結(jié)構(gòu)含有LPS及TLR4的獨(dú)立結(jié)合區(qū)，分別為N末端TLR4結(jié)合區(qū)、C末端LPS結(jié)合區(qū)，其既能直接結(jié)合LPS形成LPS/MD-2復(fù)合體再與TLR4結(jié)合，也能先和TLR4結(jié)合形成TLR4/MD-2復(fù)合體再與LPS結(jié)合，但其最終結(jié)果均為LPS/TLR4/MD-2復(fù)合體，而TLR4真正意義上的配基并非單獨(dú)的LPS，而是LPS/MD-2復(fù)合體[14]。臨床研究證實(shí)[15]，MD-2是識別LPS的重要靶點(diǎn)，通過抑制MD-2治療LPS誘導(dǎo)相關(guān)疾病已成為靶向治療研究重點(diǎn)。因此，通過檢測血清MD-2鑒別細(xì)菌感染類型具有較高敏感度、特異度，本研究發(fā)現(xiàn)其水平高于634.08 ng/L時提示患者可能為革蘭陰性菌感染。

EOS是參與AEBA慢性炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞，具有釋放細(xì)胞因子及顆粒蛋白功能，可產(chǎn)生炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子與自身相互作用，從而促進(jìn)哮喘進(jìn)展[16-18]。相關(guān)研究證實(shí)，EOS浸潤深度與肺功能、氣道重塑關(guān)系密切，且與胸腔氣體容量、肺總量存在相關(guān)性[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，AEBA患者EOS%存在異常高表達(dá)，且與病情程度呈正相關(guān)，證實(shí)EOS參與AEBA發(fā)生、進(jìn)展過程。另外，感染革蘭陰性菌AEBA患者的EOS%水平較感染革蘭陽性菌患者更高，提示檢測EOS%對鑒別細(xì)菌感染類型有積極作用，其原因在于EOS具有調(diào)控LPS作用。EOS可通過PPARγ信號通路降低炎性介質(zhì)表達(dá)，機(jī)體感染革蘭陰性菌后LPS水平提高，通過激活TLR4信號通路產(chǎn)生炎性介質(zhì)，促使炎性反應(yīng)加重，該過程中EOS%代償性升高以減輕LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[21-22]。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清MD-2、EOS%水平升高均是革蘭陰性菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步ROC分析二者聯(lián)合鑒別革蘭陰性菌感染的AUC值達(dá)0.877，具有較高鑒別效能。

綜上，血清MD-2、EOS%在AEBA患者體內(nèi)均呈高水平表達(dá)，且與患者病情程度存在正相關(guān)關(guān)系，其中血清MD-2>634.08 ng/L、EOS%>6.24%可作為臨床鑒別細(xì)菌感染類型的臨界值，超過該水平提示患者為革蘭陰性菌感染，便于指導(dǎo)臨床早期經(jīng)驗(yàn)用藥。本研究不足之處在于未深入探究MD-2、EOS之間的機(jī)制關(guān)系，二者作用機(jī)制均與TLR4明顯相關(guān)，在患者感染革蘭陰性菌后二者是否存在相互作用可作為下一步的研究方向。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王菲：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，課題設(shè)計(jì)，論文撰寫；錢萌：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;歐陽怡：實(shí)施研究過程，資料搜集整理;薛曉婕：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析