耿子翔,聶小麗,劉鵬,袁龍,李冰融,張開勇,閻旻宇,凌樂樂,劉特,張必萌

(1.上海交通大學醫(yī)學院,上海 200001;2.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院,上海 200080;3.上海市中醫(yī)老年醫(yī)學研究所,上海 200030)

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是一種以閉經、不孕不育、雌激素水平低、促性腺激素水平高以及 40歲前女性缺乏成熟卵泡為特征的疾病[1]。其發(fā)病機制可能與遺傳、放化療、飲食、環(huán)境因素、免疫功能障礙等因素有關[2]。在中醫(yī)古籍中并沒有 POF的記載,根據其癥狀特點可以歸屬為“閉經”“血枯”“不孕”“經水早斷”等中醫(yī)學疾病范疇。中醫(yī)治療以補腎為主,同時結合疏肝、健脾、祛瘀、化痰和養(yǎng)血等辨證論治。針灸作為一種獨特的中醫(yī)療法,在POF的治療中發(fā)揮著重要作用。臨床研究表明,針刺治療POF的總有效率超過89%[3],且不良反應較少,僅部分人存在局部的不適。從運用針灸治療POF至今,對其治療方式和機制的研究一直在進行,但至今收效甚微,目前僅探明針灸發(fā)揮作用的機制可能是抑制原始卵泡的丟失、增加血清抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone, AMH)的分泌、誘導抗氧化和抗凋亡系統(tǒng)來減少卵巢功能衰竭[4-6]。因此本實驗擬從電針的抗氧化和抗凋亡途徑出發(fā),驗證電針對 POF小鼠的治療作用并探究其可能的實現路徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與方法

選取36只6～8周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠,體質量(18±2) g,由上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院實驗動物中心提供。12 h晝夜節(jié)律交替,室溫(20±2) ℃,室內濕度50%～70%,適應性飼養(yǎng)1周。所有動物實驗及操作經上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院動物倫理委員會通過(2020AW126)。

1.2 主要試劑與儀器

多聚甲醛(Sigma)、二甲苯(Sigma)、蘇木精-伊紅染料(Sigma)、RIPA裂解液(碧云天)、PVDF膜(Millipore)、酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(Invitgen)、逆轉錄試劑盒(TOYOBO)、PCR試劑盒(TOYOBO)、ECL試劑盒(Millipore)、RealPlex4實時 PCR檢測系統(tǒng)(Eppendorf)、兔抗 GAPDH抗體(51332, CST)、Ferritin(4393, CST)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)(52455, CST)、B淋巴細胞瘤 2(B-cell lymphoma 2, BCL2)(3498,CST)、P53(9282, CST)。

1.3 造模方法

將36只小鼠隨機分為對照組(wild type, WT)、模型組(premature ovarian failure, POF)和電針組(electroacupuncture, EA)組,每組12只。建立高脂高糖 POF模型[7], 8 g·kg-1高脂喂養(yǎng),30%果糖溶液灌胃,每只200 μL,持續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)8周,對照小鼠則正常飲食,每只生理鹽水溶液灌胃 200 μL。造模結束后隨機抽取4只模型小鼠取血取卵巢組織觀察造模情況。應用 ELISA檢測血清卵泡生成素(folliclestimulating hormone, FSH)、雌二醇(estradiol, E2)水平,HE染色觀察卵巢組織病理以確認造模成功。

1.4 干預方法

WT組和POF組不作任何處理,EA組進行為期4周的電針治療,選用直徑0.18 mm、長度13 mm的無菌針灸針,以關元、雙側足三里和三陰交為針刺穴位,連接SDZ-V電子針灸儀,調整參數為 0.1～1 mA,1～3 Hz,連續(xù)波,對所選穴位進行刺激。每次30 min,每2日干預1次,連續(xù)4周。

1.5 標本采集

用 3%異氟烷溶液麻醉下頸椎脫臼法處死小鼠,快速進行眼球取血并分離血清。冰上取卵巢組織,去除卵巢附著脂肪,將卵巢凍于﹣80 ℃冰箱備用。

1.6 指標檢測

1.6.1 組織病理學觀察

取新鮮小鼠卵巢組織室溫下在 4%多聚甲醛溶液中固定30 min。組織用乙醇溶液梯度脫水,石蠟包埋,切成6 μm切片,用二甲苯溶液浸泡脫蠟。組織切片用蘇木精-伊紅染色,二甲苯滲透,并用中性樹脂固定。隨后在顯微鏡下觀察分析3組小鼠卵巢重量、健康及閉鎖卵泡數目。

1.6.2 卵巢組織激素E2、FSH水平測定

將卵巢組織按1:9加入PBS緩沖液制備組織勻漿,離心取上清,按照說明書于 96孔板中加樣,用酶標儀檢測3組OD值,并計算血清E2和FSH激素水平。

1.6.3 小鼠卵巢組織Fe2﹢、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的檢測

將卵巢組織置于裂解液中,冰上孵育 2 h,進一步超聲裂解卵巢組織,離心取上清,冰上備用。分別按照Fe2﹢、MDA和SOD檢測試劑盒要求加入反應液和檢測試劑,用酶標儀分別檢測3組OD值,并計算卵巢中Fe2﹢、MDA和SOD含量。

1.6.4 RT-qPCR檢測

使用Trizol溶液從每個卵巢樣本中分離總RNA。用逆轉錄試劑盒逆轉錄。使用SYBR Green檢測染料和RealPlex4實時 PCR檢測系統(tǒng)對 18S、GPX4、BCL2、Ferritin、BAX基因進行qPCR。qPCR擴增40個循環(huán),95 ℃變性 15 s,58 ℃退火 45 s,用 2﹣ΔΔCt法計算相對基因表達值。根據18S rRNA水平校準mRNA水平。引物序列詳見表1。

1.6.5 Western blot檢測

取小鼠卵巢組織加入 RIPA裂解液后進行冰上研磨、超聲。離心后取上清備用。利用12%的SDS-PAGE進行蛋白電泳,并轉移到 PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后,在室溫下用TBST清洗PVDF膜3次各10 min,然后在 4 ℃下一抗 GAPDH(1:1 000)、Ferritin(1:1 000)、GPX4(1:1 000)、BCL2(1:1 000)、P53(1:1 000)孵育過夜。重復以上清洗過程,將膜與山羊抗兔二抗(1:1 000)孵育1 h。清洗后,使用 ECL試劑盒顯影觀察,并用Image J軟件計算灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有數據采用 SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料用均數±標準差表示;若數據方差齊則組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA);若方差不齊則組間比較采用 Student’stest檢驗;不符合正態(tài)分布的數據采用 Kruskal-Wallis秩和檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠卵巢組織病理結構比較

與WT組相比,POF組成熟卵泡消失,卵巢重量減輕,正常卵泡比例下降而閉鎖卵泡比例升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。在經過4周的電針治療后,成熟卵泡重新出現(直線標注處),與POF組比較,EA組卵巢重量明顯恢復,閉鎖卵泡比例下降,而正常卵泡比例升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。詳見圖1。

圖1 3組小鼠卵巢組織病理結構比較(HE×200,±s, n＝6)

2.2 3組小鼠血清激素水平比較

與 WT組比較,POF組小鼠血清 E2水平顯著降低,FSH水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與POF組比較,EA組小鼠E2水平顯著升高,而FSH水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。詳見圖2。

圖2 3組小鼠血清激素水平比較(±s, n＝6)

2.3 3組小鼠卵巢組織Fe2﹢、MDA和SOD水平比較

與WT組比較,POF組小鼠卵巢組織Fe2﹢和MDA水平顯著升高,而 SOD水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與POF比較,EA組小鼠卵巢組織內MDA和Fe2﹢水平顯著降低,而 SOD水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。提示電針可以抑制POF小鼠卵巢內的氧化應激反應。詳見圖3。

圖3 3組小鼠卵巢組織Fe2﹢、MDA和SOD水平比較(±s, n＝6)

2.4 3組小鼠卵巢組織內Ferritin、GPX4、BCL2、BAX mRNA水平比較

與WT組比較,POF組小鼠卵巢組織內Ferritin、

GPX4、BCL2基因表達水平顯著降低,BAX基因表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與POF組比較,EA組小鼠卵巢組織內Ferritin、GPX4、BCL2基因表達顯著升高,而BAX基因表達顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。詳見圖4。

圖4 3組小鼠卵巢組織內Ferritin、GPX4、BCL2、BAX mRNA水平比較(±s, n＝6)

2.5 3組小鼠卵巢組織內Ferritin、GPX4、BCL2、BAX蛋白表達的比較

與WT組比較,POF組小鼠卵巢組織內BCL2、GPX4、Ferritin蛋白表達水平顯著降低,P53蛋白表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與POF組比較,EA組小鼠卵巢組織內BCL2、GPX4、Ferritin蛋白表達顯著升高,而P53蛋白表達顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。詳見圖5。

圖5 3組小鼠卵巢組織內Ferritin、GPX4、BCL2、BAX蛋白表達的比較(±s)

3 討論

針灸在臨床應用上十分常見,并且被認為是治療卵巢早衰(POF)最有前景的手段之一。但臨床上治療POF時穴位選取復雜多樣,難以在動物實驗中復現。因此,確定一個針灸治療 POF的基礎穴位配伍對其機制研究十分重要。中醫(yī)學認為POF是由于先天不足、氣血虧虛、邪氣外侵和情志失調等多種病因的存在,引起腎肝脾等多臟腑功能失調。其核心病機為腎精虧虛,天癸早竭,沖任受損,從而使人體生殖功能早衰。因此,在POF治療時以補腎為主,同時結合疏肝、健脾、祛瘀、化痰和養(yǎng)血等辨證論治。最近的研究表明,關元-足三里-三陰交是治療POF時最常被使用的穴位[8]。針刺關元、足三里、三陰交可以改善患者的FSH和LH等激素水平,促進卵泡發(fā)育[9],其作用機制可能跟 PI3K-AKT-mTOR信號通路激活有關[4-5]。另外,針刺產生的信號會沿著一定的外周和中樞徑路逐步傳導到腦的高級部位,進而啟動免疫-神經-內分泌網絡系統(tǒng),從而恢復卵巢的正常機能[4-6]。以關元-足三里-三陰交為基礎穴位配伍體現了近治與遠治作用相結合,通過補虛瀉實以實現標本同治。運用該基礎穴位配伍對POF小鼠進行電針治療,發(fā)現電針可以顯著改善小鼠的卵巢損傷,恢復卵巢重量,促進卵泡發(fā)育并降低閉鎖卵泡比例。此外,電針還可以改善 POF小鼠的內分泌情況,調整性激素(E2、FSH、黃體生成素等)的釋放水平,顯著恢復卵巢儲備。

研究表明 POF的發(fā)生與飲食和環(huán)境因素密切相關[2]。前期發(fā)現高糖高脂飲食誘發(fā)的高過氧化水平在POF的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[7,10]。高脂高糖飲食不僅會增加肥胖的風險,還會嚴重影響卵巢功能和卵母細胞質量[7]。此外,人體內的高過氧化水平往往誘導自身免疫系統(tǒng)的改變,通過增強免疫細胞活性導致POF的發(fā)生[10-14]。脂質過氧化是鐵死亡發(fā)生的前提。鐵死亡是一種不同于凋亡、壞死和自噬的鐵依賴的新型細胞程序性死亡方式,其主要發(fā)生機制是鐵離子或脂加氧酶催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸引起脂質過氧化和抗氧化系統(tǒng)(Xc-系統(tǒng))中 GPX4的表達減少[14-19]。事實上,鐵死亡是否發(fā)生取決于鐵離子積累誘導的過氧化物和氧自由基生成與對抗脂質過氧化的Xc-之間的平衡。在POF小鼠卵巢中,可以明顯觀察到MDA濃度顯著升高,SOD濃度和GPX4表達水平顯著降低,而電針治療后,過氧化物生成和抗氧化系統(tǒng)重新建立平衡。另外,POF小鼠卵巢中Ferritin表達顯著降低,鐵蛋白被消耗轉化成大量鐵離子,而電針治療后Ferritin表達水平顯著恢復。以上結果表明電針可以抑制脂質過氧化誘導的鐵死亡。

除此之外,研究還發(fā)現電針可以顯著降低 P53和BAX的表達水平,升高BCL2的表達水平。這表明電針可以通過抑制細胞凋亡,促進卵泡生長發(fā)育,減少卵泡閉鎖,增強卵巢儲備功能[4,6,20-21]。值得一提的是,細胞凋亡與鐵死亡存在密切的聯系。P53不僅僅是促凋亡基因,而且還是 Xc-系統(tǒng)的抑制劑,可以通過靶向SLC7A11抑制GPX4、GSS等抗氧化基因的表達[22-23]。因此,電針治療后POF小鼠卵巢內P53的表達降低進一步證明了電針的抑制鐵死亡作用。

綜上所述,本研究表明電針可能通過提高 Xc-系統(tǒng)的GPX4表達降低POF小鼠的脂質過氧化水平,避免Fe2﹢的蓄積,從而減少鐵死亡對POF小鼠卵巢組織的損傷。并且電針還可以通過升高BCL2和降低P53、BAX表達水平減少卵巢內細胞的凋亡,促進其增殖,恢復卵巢儲備。本研究探索了電針對POF的治療作用,創(chuàng)新性地發(fā)現了 POF小鼠中存在鐵死亡現象,闡述了電針可能通過提高GPX4表達抑制鐵死亡發(fā)揮治療作用。這為臨床應用電針(關元-足三里-三陰交)治療POF奠定了理論和實驗基礎,并對電針治療 POF的機制提供了新的見解。