馬夢鴿，宋忠興，陳 琳*，唐志書,,3*，孔 鑫，段金廒

1長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117；2陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，咸陽 712083；3中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700；4南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023

菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花是中國傳統(tǒng)的珍貴藥材，也是蒙醫(yī)臨床應(yīng)用最廣泛的藥材之一。本藥性涼，味微苦，歸心、肝經(jīng)，是活血通經(jīng)，去瘀止痛之良藥[1-3]。一直以來，對植物紅花的使用和研究只集中于其藥花，但是植物紅花的花產(chǎn)量很低，這就使得其藥用部位—“花”采收后產(chǎn)生的大量的葉子被棄掉，從而出現(xiàn)資源浪費的現(xiàn)象。有學(xué)者對紅花地上部分的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，但大多集中在生物堿和萜類[3-5]。但對其黃酮類化合物的研究較少，黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、保肝、抗癌、抗炎等藥理活性[6,7]，并且植物源黃酮類化合物具天然低毒的特點，在開發(fā)高效安全的天然藥物、護(hù)膚品、保健品等方面具有廣闊前景。目前尚未見對紅花葉黃酮類提取純化工藝和生物活性的研究。相關(guān)研究表明，紅花莖醇提取物具有明顯的抗CCl4致急性肝損傷作用[3]，那么紅花葉提取物是否也具有肝保護(hù)作用值得探討。故本實驗從充分利用紅花非藥用部位資源的角度出發(fā)，通過提取、純化工藝優(yōu)化得TFCTLL，并進(jìn)一步探究其保肝作用，為紅花非藥用部位資源的充分利用及其藥理活性研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

本實驗所用紅花葉采摘自新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州，由經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍高級工程師鑒定為紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥葉。水飛薊素(上海源葉生物科技有限公司，批號：S25549)；羧甲基纖維素鈉(天津天士力圣特制藥有限公司，批號：QHG3-2161-96)。蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：HR17513S1)。橄欖油(山東魯花集團(tuán))；四氯化碳(CCl4，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號：20210102)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT，批號：140120014)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST，批號：140220008)、總膽汁酸(total bile acid，TBA，批號：143222001)檢測試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；HPD-600、HPD-100、D-101、HP-20、AB-8型大孔吸附樹脂(西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司)；其他試劑(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 動物

SPF級雄性昆明小鼠，50只，4周齡，體質(zhì)量(20±2)g。購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司(SCXK(川) 2020-030)，飼養(yǎng)于陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)新中心SPF級動物實驗室(SYXK(陜) 2017-004)，每天光照和黑暗各12 h，適宜溫度設(shè)置在20 °C～24 °C范圍內(nèi)，室內(nèi)保持55%～65%的相對濕度。動物實驗開始前先經(jīng)過1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)。本實驗經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(SUCMDL20220612001)。

1.3 儀器

Acquity H-CLASS型超高效液相色譜(UPLC，美國沃特世科技有限公司)串聯(lián)Triple TOFTM 5600+質(zhì)譜儀(美國愛博才思公司)；液相配置：二元超高壓溶劑系統(tǒng)、FTN自動進(jìn)樣管理器、PDA檢測器和Empower3色譜工作站。全自動血清生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司)；UV-2600型紫外可見分光光度計(日本島津公司)。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

將紅花地上部分莖、葉分離，去雜質(zhì)，置于通風(fēng)陰涼處陰干后，備用。

1.4.2 總黃酮含量測定

1.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定總黃酮含量。用65%乙醇溶解蘆丁對照品后制得0.2 mg/mL的對照品溶液。精確吸取不同體積對照品溶液(0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL)于25 mL量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min，加4%NaOH溶液10.0 mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻靜置15 min，于510 nm處測定吸光度值。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程為：Y=12.706X-0.002 6(r=0.999 4)，表明蘆丁在0.008～0.056 mg/mL濃度下吸光度線性關(guān)系良好。

1.4.2.2 樣品溶液中總黃酮含量的測定

將紅花葉粉碎后過50目篩，真空干燥至恒重，得到樣品粉末。精密稱取粉末10.0 g，加入適量溶劑進(jìn)行加熱回流提取，分別考察不同乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)對TFCTLL提取率影響，根據(jù)“1.4.2.1”項下的線性方程計算總黃酮濃度并根據(jù)下列公式[8]計算總黃酮提取率。

總黃酮提取率=(C×V×D)/m×100%

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出的總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為取樣量，mg。

1.4.3 提取工藝單因素試驗

分別考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)、提取時間(30、60、90、120、150 min)和提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)對總黃酮提取率的影響。每個因素平行實驗3次。

1.4.4 提取工藝響應(yīng)面水平選取與設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，固定提取次數(shù)2次的條件下，選取料液比、乙醇濃度、提取時間作為Box-Behnken試驗設(shè)計的3個因素，以TFCTLL提取率為評價指標(biāo)，結(jié)合響應(yīng)面法的設(shè)計原理，采用3因素3水平的設(shè)計方案，共17組實驗，響應(yīng)面法實驗的因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factor and level of response surface experiment

1.4.5 總黃酮的富集和純化

1.4.5.1 紅花葉提取液前處理

稱取適量干燥至恒重的紅花葉藥材，照響應(yīng)面法的最佳提取工藝提取，提取液減壓濃縮至無醇味。上柱之前采用抽濾法過濾大量雜質(zhì)、蛋白質(zhì)、黏液以及色素。

1.4.5.2 大孔樹脂的篩選和預(yù)處理

總黃酮化合物大都呈非極性至弱極性，而其所用的大孔吸附樹脂也大都在非極性至弱極性之間。故本試驗選取AB-8型[9]、HPD-100型[10]、HPD-600樹脂[11]、D101型[12]和HP-20型[12]5種適合富集總黃酮的大孔吸附樹脂用于純化TFCTLL，使用4%的HCl浸泡24 h，蒸餾水洗滌至中性；4%的NaOH浸泡24 h，蒸餾水洗滌至中性；無水乙醇浸泡24 h，蒸餾水洗滌至無醇味，備用。將大孔樹脂用95%的乙醇浸泡24 h后進(jìn)行濕法裝柱，精密稱取一定量大孔樹脂對紅花葉提取液進(jìn)行吸附。

1.4.5.3 大孔樹脂型號的篩選

將已處理好的大孔樹脂HPD-600、HPD-100、D-101、HP-20、AB-8各稱取10 g，分別置于150 mL錐形瓶中，向每個錐形瓶中加入預(yù)處理后的紅花葉提取液40 mL，置于25 ℃恒溫水浴搖床上以110 r/min的速度震蕩2 h，靜置8 h，使各個型號大孔樹脂達(dá)到飽和吸附，并吸收上等紅花葉提取液對黃酮類物質(zhì)濃度進(jìn)行測定。比較不同型號樹脂對TFCTLL的吸附率。將載樣樹脂移入150 mL錐形瓶中，加入40 mL的95%乙醇，置于25 ℃恒溫水浴搖床振搖2 h過濾，靜置8 h即得解吸液，比較不同型號樹脂對紅花葉總黃酮的解吸率，根據(jù)吸附率和解析率結(jié)果選出大孔吸附樹脂。吸附率和解析率的計算公式[13]如下：

吸附率=(C0V0-C1V1)/C0V0×100%

解吸率=(C2V2)/(C0V0-C1V1)×100%

式中，C0為吸附前樣品液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為吸附前樣液體積，mL；C1:吸附后殘液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附后殘液體積，mL；C2為解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為解吸液體積，mL。

1.4.5.4 純化工藝單因素考察

1.4.5.4.1 不同pH的紅花葉提取液

稱取10 g經(jīng)過預(yù)處理后的樹脂，用去離子水對其進(jìn)行清洗，置于150 mL的三角瓶中，分別加入40 mLpH為2、4、7、10、12的紅花葉提取液震蕩吸附4 h。靜置12 h，檢測其中總黃酮含量，計算出吸附率，選出最佳pH值。

1.4.5.4.2 最大吸附量

準(zhǔn)確稱取已處理好的大孔樹脂100 g，采取濕法裝柱，取紅花葉提取液進(jìn)行上樣，分段收集流出液，每份40 mL，收集10份流出液，測定黃酮含量。流出液中黃酮濃度如果達(dá)到上樣液濃度的10%時，稱為泄漏點，當(dāng)流出液中黃酮濃度達(dá)到上樣液濃度的100%時，稱為飽和點，收集流出液，測定流出液中總黃酮的含量。

1.4.5.4.3 不同濃度洗脫溶劑

準(zhǔn)確量取10 g吸附總黃酮達(dá)到飽和狀態(tài)的樹脂，用去離子水對其進(jìn)行清洗，置于150 mL的三角瓶中，分別加入濃度為20%、40%、60%、80%、95%乙醇40 mL，震蕩洗脫2 h。靜置8 h，檢測其中總黃酮含量，計算出解吸率，由解吸率得出最適乙醇濃度。

1.4.6 UPLC-Q-TOF-MS/MS檢測TFCTLL化學(xué)成分

1.4.6.1 質(zhì)譜條件

離子源：ESI離子源；正、負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，源噴射電壓(IVF)分別為5 500、-4 500V，裂解電壓(DP)±80 V，碰撞能量(CE)±10 eV，GS1和輔助氣、GS2都為氮氣、344.74 kPa(50 psi)，氣簾氣(CUR)：241.32 kPa(35psi)，霧化溫度(TEM)500 ℃，采用信息依賴采集(IDA)、動態(tài)背景扣除(DBS)和高靈敏度模式；母離子(TOF-MS)、子離子的掃描范圍都為m/z 100～2000。

1.4.6.2 液相色譜條件

采用ACQUITY UPLC?BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色譜柱，使用0.1%甲酸水溶液(A)溶液-乙腈(B)作為流動相進(jìn)行梯度 洗脫條件：0～10 min，5%→12% B；10～30 min，12%→30% B；30～50 min，30%→50% B；50～52 min，50%→80% B；52～55 min，80%→80% B；55～57 min，80%→5% B；57～62 min；5%→5% B柱溫為30 ℃；流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

1.4.7 TFCTLL抗小鼠急性肝損傷動物實驗

1.4.7.1 受試藥物的制備

按最佳提取、純化工藝獲得的TFCTLL，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液分別配置成5、10 mg/mL，水飛薊素用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成10 mg/mL，4 ℃冰箱冷藏備用。

1.4.7.2 分組、造模及給藥

實驗選取50只健康雄性昆明小鼠，將小鼠隨機(jī)分為空白組(control，C)、模型組(model，M)、水飛薊素組(陽性對照組，silymarin，S)、TFCTLL低劑量組(T-L)和TFCTLL中劑量組(T-M)，每組各10只。T-L和T-M組分別給予TFCTLL提取物50、100 mg/kg，S組給予水飛薊素100 mg/kg，空白組和模型組灌胃給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每天一次，連續(xù)灌胃給藥14天。第14天末，除空白組腹腔注射等量的橄欖油溶液外，模型組和給藥組小鼠均腹腔注射含0.1%CCl4的橄欖油溶液10 mL/kg。小鼠末次給藥后間隔24 h，眼球取血后處死，分取肝臟及脾臟并稱取其重量，計算小鼠的肝臟指數(shù)及脾臟指數(shù)；收集血清，采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中ALT、AST和TBA含量。

1.4.7.3 動物體重變化及相關(guān)臟器指數(shù)測定

每周監(jiān)測并記錄小鼠體重，試驗結(jié)束后摘取各組小鼠肝臟、脾臟，生理鹽水清洗后用濾紙吸干，記錄肝臟和脾臟濕重并計算臟器指數(shù)。

1.4.7.4 血清生化指標(biāo)的測定

通過全自動生化儀檢測各組小鼠血清AST、ALT和TBA的含量。

1.4.7.5 肝組織病理學(xué)觀察

各組小鼠肝臟在4%多聚甲醛固定液中固定，肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋并切片(5 μm)，常規(guī)方式脫蠟，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，顯微鏡下觀察肝組織損傷的病理變化。

1.4.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 提取工藝單因素試驗結(jié)果

提取次數(shù)、提取時間、料液比、乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。單因素結(jié)果見圖1。綜合考慮時間和經(jīng)濟(jì)成本，選擇提取次數(shù)為2次，料液比為1∶25，提取溶劑為80%乙醇，單次提取時間為60 min。

圖1 不同因素對TFCTLL提取率的影響Fig.1 Effect of different factors on the extraction rate of TFCTLL

2.2 提取工藝響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定提取次數(shù)2次的條件下，選取料液比、乙醇濃度、提取時間3個因素為變量，以紅花葉總黃酮提取率R為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗。使用Design-Expert8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下多元二次回歸方程R=4.89+0.144 9A+0.061B+0.058 8C+0.077 4AB+0.083 1AC+0.039 9BC-0.446 3A2-0.532 8B2-0.223 8C2。對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2，該模型顯著性檢驗的P值為<0.000 1，表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，失擬項P>0.05。說明回歸模型擬合較好，能較準(zhǔn)確反映3個因素對TFCTLL提取率的影響。方差來源中的A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2的P值表明3個因素對TFCTLL提取率有顯著影響，且料液比的影響極大。乙醇濃度和提取時間的影響作用較大。結(jié)果見圖2、圖3和圖4，各因素兩兩交互作用的3D響應(yīng)面圖曲線坡度陡峭程度上得到了驗證，料液比的曲面最為陡峭；另外乙醇濃度和提取時間、料液比和提取時間均有一定的交互作用，而料液比和乙醇濃度的等高線為橢圓形，3D響應(yīng)面幾乎無曲度，說明二者幾乎無較大的交互作用。由此可知各因素對TFCTLL提取率的影響大小為料液比>乙醇濃度>提取時間。

圖2 乙醇濃度和料液比對TFCTLL提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Effect of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction of TFCTLL by response surface methodology and contour map

圖3 乙醇濃度和提取時間對TFCTLL提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Effect of ethanol concentration and extraction time on the extraction of TFCTLL by response surface methodology and contour map

圖4 料液比和提取時間對TFCTLL提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Effect of Solid-liquid ratio and extraction time on the extraction of TFCTLL by response surface methodology and contour map

表2 方差分析結(jié)果Table 2 The results of variance analysis

根據(jù)響應(yīng)面分析得到最優(yōu)提取條件為：料液比1∶26.852，乙醇濃度80.776%，提取時間65.175 min，此條件下TFCTLL的提取率理論值可達(dá)4.907%?？紤]到實際可操作性，對最佳提取條件優(yōu)化為料液比1∶27，乙醇濃度80%，提取時間65 min，得到實際提取率為4.921%，與理論值差0.014%，說明此模型預(yù)測較好且穩(wěn)定，可用于TFCTLL的提取。

2.3 總黃酮富集純化

2.3.1 不同大孔樹脂的吸附率和解析率

試驗結(jié)果見表3，以總黃酮的吸附率及解吸率為考察指標(biāo)來篩選最佳樹脂類型，結(jié)果顯示AB-8大孔樹脂吸附率及解吸率較高,故本實驗選用此做為吸附樹脂。

表3 吸附率及解析率結(jié)果Table 3 Adsorption rate and desorption rate results

2.3.2 不同pH紅花葉提取液的吸附率

結(jié)果見圖5A，pH為7時，大孔樹脂對紅花葉總黃酮的吸附率達(dá)到最大。在酸堿環(huán)境中，吸附率都較低，可能由于酸堿性的條件下紅花葉提取液中成分發(fā)生變化。酸堿性也可能導(dǎo)致大孔樹脂對TFCTLL的吸附性發(fā)生變化。從結(jié)果得出，在pH為7的條件下，大孔樹脂對TFCTLL的吸附率最好，所以選擇pH=7的紅花葉提取液進(jìn)行大孔樹脂的洗脫實驗。

2.3.3 最大吸附量

結(jié)果見圖5B，上樣提取液達(dá)到120 mL時，達(dá)到上樣濃度的10%，已經(jīng)到達(dá)理論上的泄漏點，這時已經(jīng)達(dá)到了大孔樹脂的飽和吸附量。對加入的紅花葉提取液已經(jīng)無法全部吸附，在上樣液達(dá)到160 mL時，已經(jīng)達(dá)到飽和點。超過160 mL之后紅花葉提取液就開始泄露。

2.3.4 不同乙醇濃度的解吸率

結(jié)果見圖5C。從結(jié)果看出95%的乙醇濃度達(dá)到較高的解吸率，當(dāng)乙醇濃度從20%乙醇濃度到80%乙醇濃度時，對TFCTLL的解吸率持續(xù)上升。當(dāng)選擇95%乙醇濃度時解析率最高，對TFCTLL的解吸效果最好，故此條件下進(jìn)行洗脫實驗。

圖5 TFCTLL純化工藝的考察結(jié)果Fig.5 Investigation results of TFCTLL purification process

2.3.5 純化富集最優(yōu)工藝

將提取最優(yōu)工藝下的提取液減壓濃縮至無醇味，并調(diào)節(jié)pH值為7，吸附于預(yù)處理過的大孔樹脂色譜柱AB-8，用95%乙醇洗脫，收集95%洗脫液濃縮為干浸膏，采用“1.4.2”項下方法進(jìn)行黃酮含量測定。結(jié)果顯示經(jīng)過AB-8大孔樹脂富集純化后得到的TFCTLL純度達(dá)到61.42%。

2.4 成分鑒定

TFCTLL成分表征的負(fù)離子模式的總離子流圖見圖6，通過PeakView 2.2軟件對化合物進(jìn)行鑒定表征，經(jīng)文獻(xiàn)查閱及結(jié)構(gòu)解析[14-16]，共推斷出木犀草素、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、牡荊苷等4個成分見表4。

圖6 TFCTLL成分表征的負(fù)離子模式的總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram for the characterization of TFCTLL composition under negative ion mod

表4 TFCTLL成分表征結(jié)果Table 4 TFCTLL composition characterization results

2.5 TFCTLL抗小鼠急性肝損傷動物實驗

2.5.1 TFCTLL對急性肝損傷小鼠肝、脾臟器指數(shù)的影響

空白組小鼠毛色光滑，精神狀態(tài)較好。與空白組相比，模型組小鼠精神萎靡不振，食欲下降，體重明顯減輕，其余給藥組小鼠毛色、精神狀態(tài)和攝食等明顯優(yōu)于模型組。結(jié)果見圖7，與空白組相比，模型組小鼠的肝臟、脾臟臟器指數(shù)升高具有顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，水飛薊素藥組肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，T-L、T-M肝、脾臟器指數(shù)在不同程度上降低(P<0.05)。

圖7 TFCTLL對急性肝損傷小鼠肝、脾臟器指數(shù)的影響Fig.7 Effect of TFCTLL on the index of liver and spleen in mice with acute liver 注：與C組相比，#P<0.05；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with C group,#P<0.05;Compared with M group,*P<0.05, **P<0.01.

2.5.2 TFCTLL對急性肝損傷小鼠血清生化指標(biāo)的影響

小鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果見圖8，與空白相比，模型組小鼠 ALT、AST、TBA水平顯著升高(P<0.001)。說明模型組小鼠出現(xiàn)肝功能損傷。與模型組相比，水飛薊素和TFCTLL低、中劑量組小鼠的ALT、AST、TBA均顯著降低(P<0.05)，表明TFCTLL可以較好改善急性肝損傷小鼠的肝功能。

圖8 TFCTLL對急性肝損傷小鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.8 Effect of TFCTLL on serum biochemical indexes in mice with acute liver 注：與C組相比，###P<0.001；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note:Compared with C group, ###P<0.001;Compared with M group,*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001.

2.5.3 TFCTLL對急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果見圖9，空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞無壞死、排列整齊，大小均勻，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，圓整、邊界清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，纖維結(jié)締組織增生，匯管區(qū)炎性細(xì)胞及壞死細(xì)胞增多，出現(xiàn)大量的脂肪變性及肝細(xì)胞壞死，明顯的炎癥細(xì)胞浸潤；水飛薊素組和TFCTLL低、中劑量組小鼠肝細(xì)胞變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象較模型組顯著改善。

圖9 TFCTLL對急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響Fig.9 Effect of TFCTLL on the pathological changes of liver tissue in mice with acute liver injury

3 討論與結(jié)論

本研究首次以紅花廢棄物紅花葉為試驗材料，采用加熱回流法對紅花葉總黃酮進(jìn)行提取，在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗，優(yōu)化提取紅花葉總黃酮的最佳提取工藝，確定料液比1∶27，乙醇濃度80%，提取時間65 min，得到實際提取率為4.921%，與理論值差0.014%，并且對單因素和響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)二者并沒有顯著性差異P>0.05。說明此模型預(yù)測較好且穩(wěn)定，可用紅花葉中總黃酮的提取。由于經(jīng)過最優(yōu)提取工藝得到的是含有紅花葉總黃酮的粗提物，且提取率較低，因此需要對粗提物進(jìn)一步地富集純化，以便后續(xù)的活性研究。

大孔樹脂近年來普遍運用于天然產(chǎn)物的分離純化中，特別是黃酮類成分的富集，因其純化工藝具有操作簡單、無污染、能耗小且分離效果好等特點，在黃酮類化合物的純化研究中得到廣泛使用[9]。大多黃酮類化合物呈弱極性，故弱極性和非極性的樹脂對黃酮類化合物的純化效果較好。Hou等[17]研究大孔吸附樹脂富集純化玳玳花總黃酮，通過靜態(tài)吸附實驗考察NKA-9、HPD100、HPD400、HPD600、AB-8、D101、X-5、DM301大孔吸附樹脂對總黃酮的吸附、解吸能力，結(jié)果表明AB-8大孔吸附樹脂吸附、解吸能力最佳。相關(guān)文獻(xiàn)也報道了HPD-100型[10]、HPD-600型樹脂[11]、D101型[12]和HP-20型[12]4種大孔吸附樹脂，在富集黃酮類成分中吸附和解析能力較其他型號樹脂具有明顯的優(yōu)勢，故本試驗選取AB-8型、HPD-100型、HPD-600型樹脂、D101型和HP-20型5種適合富集總黃酮的大孔吸附樹脂用于純化TFCTLL。得出最優(yōu)純化工藝后，將提取最優(yōu)工藝下的紅花葉提取液吸附于預(yù)處理過的大孔樹脂色譜柱AB-8，用95%乙醇洗脫，其總黃酮純度達(dá)到61.42%，收集洗脫液濃縮為干浸膏。為后續(xù)的活性研究提供基礎(chǔ)。

相關(guān)研究表明，紅花莖醇提取物具有明顯的抗CCl4致急性肝損傷作用[3]，紅花葉提取物是否也具有肝保護(hù)作用？本研究共鑒定了TFCTLL中木犀草素、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、牡荊苷等4個黃酮類化合物。相關(guān)研究結(jié)果證明[18-21]其具有特異性的抗炎、抗氧化和抗纖維化作用，可以降低血清ALT、AST活性、抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平、抑制抗氧化酶的活化和NF-κB通路激活，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗炎、減少鐵沉積、調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡、促進(jìn)自噬等多種途徑減輕對肝臟的損傷，常被用于治療急性肝損傷等相關(guān)的疾病。

急性肝損傷[22-24]是一種在短期內(nèi)因各種原因而引起的肝功能突發(fā)異常疾病，其臨床預(yù)后較差，如果不加以積極干預(yù)和治療，可能會進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化與肝癌，威脅人體生命健康。造成肝損傷的因素多種多樣，其中包括化學(xué)性肝損傷、細(xì)菌和病毒引起的生物性肝損傷。CCl4是實驗動物研究中誘導(dǎo)化學(xué)性肝損傷最常用的肝毒素[24]，一次給藥CCl4便可制備肝細(xì)胞損傷型的ALI?？稍斐筛渭?xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，導(dǎo)致胞內(nèi)ALT和AST溢出進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中ALT和AST活性升高，其升高水平與肝損傷程度呈正相關(guān)，因此ALT和AST活性常作為評價肝損傷程度的指標(biāo)。本研究動物實驗結(jié)果表明，腹腔注射CCl4后，血清中ALT、AST和TBA活性顯著升高，并且發(fā)生肝組織病變，表明成功建立CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型。經(jīng)TFCTLL干預(yù)后，小鼠血清中ALT、AST和TBA活性顯著降低，肝組織病變程度減輕，表明TFCTLL對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用。

本研究從紅花藥材資源的角度出發(fā)，將中藥傳統(tǒng)非藥用部位等廢棄物及副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化研制成資源性藥物，對紅花藥材充分利用，并對其紅花葉進(jìn)行了保肝作用的探索性研究。結(jié)果表明提取純化后得到的TFCTLL對急性肝損傷小鼠具有作用。本研究可為TFCTLL的后續(xù)開發(fā)利用提供參考，也對紅花資源的高值化利用具有重要意義。