徐志玲*，劉萬(wàn)錢(qián)，祝連彩，郝石磊

（1.重慶大學(xué)生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶 400030;2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 重慶 400030）

新工科建設(shè)通過(guò)新興學(xué)科建設(shè)引領(lǐng)專(zhuān)業(yè)建設(shè)，實(shí)現(xiàn)學(xué)科建設(shè)與專(zhuān)業(yè)建設(shè)的聯(lián)動(dòng)發(fā)展，以及推動(dòng)新興交叉融合學(xué)科建設(shè)，致力于培養(yǎng)創(chuàng)新型的卓越工程人才[1]。新工科背景下，專(zhuān)業(yè)人才培養(yǎng)要放在科技創(chuàng)新最優(yōu)先的位置[2]。生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室是專(zhuān)業(yè)人才培養(yǎng)的重要平臺(tái)和基地。隨著科技創(chuàng)新的持續(xù)推進(jìn)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大型儀器設(shè)備的性能更新很快，大型儀器設(shè)備應(yīng)與專(zhuān)業(yè)緊密結(jié)合，滿足相關(guān)專(zhuān)業(yè)科研發(fā)展的需求。應(yīng)力加載系統(tǒng)平臺(tái)可模擬體內(nèi)細(xì)胞的真實(shí)受力自然環(huán)境，為體外細(xì)胞提供類(lèi)似人體內(nèi)的生理環(huán)境，并在牽張拉伸應(yīng)力作用下誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生生化，生理變化包括細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、分化、癌變等，進(jìn)而闡釋細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和相關(guān)通路的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理等。該設(shè)備已為實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)研究、生物醫(yī)學(xué)工程專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域的創(chuàng)新型人才培養(yǎng)和社會(huì)服務(wù)等提供了重要保障。新工科建設(shè)背景下，如何提升設(shè)備的使用效益，與高校學(xué)科建設(shè)、科研水平、教學(xué)質(zhì)量等密切相關(guān)[3]。因此，厘清應(yīng)力加載系統(tǒng)功能提升的建設(shè)思路，具有重要指導(dǎo)意義。

1 應(yīng)力加載系統(tǒng)服務(wù)功能的局限性

實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的應(yīng)力加載系統(tǒng)版本很低，其固有功能僅是對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞施加一定幅度、頻率的周期性應(yīng)力刺激，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生生理生化反應(yīng)[4]。目前，該設(shè)備的很多重要功能都無(wú)法實(shí)現(xiàn)，如靜動(dòng)態(tài)對(duì)比實(shí)驗(yàn)、共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等。基于新工科對(duì)交叉學(xué)科專(zhuān)業(yè)科研創(chuàng)新的重要需求，充分發(fā)揮該儀器設(shè)備原有的功能，盡可能做到“物增其用”，開(kāi)發(fā)和拓展該儀器設(shè)備的功能和應(yīng)用范圍，提升科研、教學(xué)和社會(huì)服務(wù)價(jià)值，是非常有必要的。

2 應(yīng)力加載系統(tǒng)功能的提升途徑

實(shí)驗(yàn)室在原有的應(yīng)力加載系統(tǒng)周期性牽張的固有功能基礎(chǔ)上，配置共培養(yǎng)裝置、動(dòng)態(tài)對(duì)照隔離閥、細(xì)胞居中種植器，不僅可以拓展和完善細(xì)胞應(yīng)變范圍，開(kāi)展共培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞形態(tài)、功能、生命周期的變化研究，而且還可以對(duì)同一批樣品中細(xì)胞受力和不受力進(jìn)行動(dòng)態(tài)、靜態(tài)培養(yǎng)的對(duì)照（圖1）。

圖1 應(yīng)力加載系統(tǒng)的新功能開(kāi)發(fā)后的技術(shù)路線

3 應(yīng)力加載系統(tǒng)功能提升內(nèi)涵

3.1 細(xì)胞居中種植器

應(yīng)力加載系統(tǒng)的加載原理是孔中心的圓形塑料元件頂著膜，膜周?chē)沫h(huán)形空腔連接儀器造成真空，膜周?chē)h(huán)形一圈向下吸引，膜中間圓形區(qū)域的細(xì)胞受到徑向牽拉。原有的細(xì)胞接種方式是覆蓋整張膜，牽張應(yīng)力加載之后，只有仍在中心區(qū)域的細(xì)胞才能受到均勻的應(yīng)變，而周?chē)?xì)胞受力不均勻。但在收集蛋白或RNA樣品時(shí)，所有細(xì)胞是一起收集的，細(xì)胞的力學(xué)刺激狀況復(fù)雜，可能影響后期蛋白水平、基因水平等方面的檢測(cè)結(jié)果。細(xì)胞居中種植器主要用于細(xì)胞的居中種植，可保障所有細(xì)胞受到均勻應(yīng)變，杜絕浪費(fèi)細(xì)胞，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性和準(zhǔn)確性。

細(xì)胞居中培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作方案：

①將細(xì)胞居中種植器插入基板，類(lèi)似于將圓柱形加載站放入基板的方式，確保板中的孔與細(xì)胞接種器上的柱對(duì)齊，施加負(fù)壓。

②種植細(xì)胞，使細(xì)胞粘附到膜上所需的播種時(shí)間至少兩個(gè)小時(shí)。

③每孔緩慢加入1 ml新鮮培養(yǎng)基以增加體積，以便正確吸出非貼壁細(xì)胞。然后，在每個(gè)孔的側(cè)面插入一個(gè)吸氣器尖端，并吸出含有非貼壁細(xì)胞的介質(zhì)。

④每孔加入3 ml新鮮培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱，直到準(zhǔn)備好進(jìn)行加載應(yīng)變。

3.2 動(dòng)態(tài)對(duì)照隔離閥

隔離閥可進(jìn)行細(xì)胞靜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，使同一培養(yǎng)板內(nèi)，部分孔內(nèi)細(xì)胞受力進(jìn)行牽張應(yīng)變，部分孔內(nèi)細(xì)胞不受力進(jìn)行靜態(tài)生長(zhǎng)，可對(duì)比同一環(huán)境下細(xì)胞的靜態(tài)培養(yǎng)與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，降低實(shí)驗(yàn)成本。換句話說(shuō)，隔離閥能夠在單獨(dú)的六孔板上阻斷某一個(gè)或幾個(gè)孔的真空吸引力，從而在一個(gè)六孔板中同時(shí)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。而以往實(shí)驗(yàn)中，需要六個(gè)孔進(jìn)行同樣的處理，對(duì)照組需要額外取一個(gè)六孔板種細(xì)胞來(lái)做，也增加了耗材成本。

動(dòng)靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作方案：

為防止對(duì)單個(gè)孔的底部施加真空壓力，為培養(yǎng)細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)不受約束的受控環(huán)境，同時(shí)對(duì)同一板內(nèi)的其他培養(yǎng)物施加應(yīng)變，形成細(xì)胞動(dòng)態(tài)牽張與靜態(tài)對(duì)比。

在細(xì)胞接種之前，取出隔離閥，拔出銷(xiāo)釘，放入培養(yǎng)板底部，并使其附著在膜表面，確保隔離閥每一側(cè)的兩個(gè)氣孔都暴露在外，并且沒(méi)有被推過(guò)培養(yǎng)板孔的底部邊緣，然后將銷(xiāo)釘推回穿過(guò)塞子的氣孔，直到銷(xiāo)釘頭碰到隔離閥的側(cè)面。

3.3 細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)裝置

使用標(biāo)準(zhǔn)Transwell進(jìn)行共培養(yǎng)或細(xì)胞遷移測(cè)定，可以實(shí)現(xiàn)以下功能：在存在或不存在機(jī)械負(fù)荷的情況下培養(yǎng)兩種不同的細(xì)胞類(lèi)型；隔離機(jī)械負(fù)載的直接和自動(dòng)/旁分泌效應(yīng)；檢查底物菌株對(duì)細(xì)胞遷移的旁分泌/自分泌影響；檢查藥物運(yùn)輸以響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷的旁分泌效應(yīng)；分析細(xì)胞極化層的形成，以響應(yīng)機(jī)械負(fù)載帶來(lái)的旁分泌效應(yīng)等。如果將Transwell共培養(yǎng)體系引入力學(xué)加載平臺(tái)，對(duì)于細(xì)胞力學(xué)研究尤其是骨關(guān)節(jié)力學(xué)方向的研究具有重大意義。以往只能單獨(dú)測(cè)試力學(xué)刺激對(duì)某種細(xì)胞造成的影響，不知道受到力學(xué)刺激后細(xì)胞的外分泌物對(duì)同培養(yǎng)體系其他細(xì)胞的影響，而骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)里就是多種組織、多種細(xì)胞類(lèi)型存在于一個(gè)環(huán)境中的。

細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作方案：

細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)裝置，可使其位于生長(zhǎng)在培養(yǎng)板橡膠膜底部的下層細(xì)胞單層之上。Transwell裝置可在培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞遷移測(cè)定、細(xì)胞極性測(cè)定、細(xì)胞趨化性和侵襲性等實(shí)驗(yàn)，從而檢測(cè)來(lái)自應(yīng)變細(xì)胞的促分泌素對(duì)Transwell中未應(yīng)變細(xì)胞的影響。Transwells也可以作為應(yīng)變樣品在同一孔中的非應(yīng)變對(duì)照。使共培養(yǎng)裝置位于生長(zhǎng)在培養(yǎng)板橡膠膜底部的下層細(xì)胞單層之上，然后放入Transwell孔板，以小鼠MSCs細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)為例：①將細(xì)胞加入10 ml含有20%FBS和1.3%DMSO的培養(yǎng)基中。②在37℃、5%CO2下孵育5―7天，使細(xì)胞能夠遷移。③將100微升制備好的水凝膠添加到6.5 mm直徑Transwell的上腔室中，確保水凝膠均勻涂抹并形成凝膠。④離心活化的細(xì)胞并重懸于培養(yǎng)基中。稀釋至1.5 106個(gè)細(xì)胞/ml的密度。⑤將100微升懸浮液添加到上腔室中。⑥將擬定的化學(xué)引誘劑添加到下室。⑦在37℃、5%CO2、100%濕度下孵育2小時(shí)。⑧從Transwell中取出上清液并用PBS輕輕沖洗。⑨添加細(xì)胞檢測(cè)試劑（例如鈣黃綠素等）并使用適合所選檢測(cè)試劑的方案對(duì)遷移到水凝膠中的細(xì)胞進(jìn)行定量。

基于以上分析，在充分發(fā)揮現(xiàn)有儀器功能和確保實(shí)驗(yàn)安全的前提下，細(xì)胞居中種植器、動(dòng)態(tài)對(duì)照隔離閥、細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)裝置不僅擴(kuò)展了應(yīng)力加載系統(tǒng)的功能，還可以提高科學(xué)研究水平，節(jié)省科研經(jīng)費(fèi)和降低科研成本，這對(duì)應(yīng)力加載系統(tǒng)儀器的功能開(kāi)發(fā)與提升具有重要意義，而且已有研究證明，三種裝置均可有效用于細(xì)胞應(yīng)力加載實(shí)驗(yàn)[5]。

4 結(jié)語(yǔ)

應(yīng)力加載系統(tǒng)歷經(jīng)十幾年的運(yùn)行服務(wù)，實(shí)驗(yàn)室通過(guò)增添新功能附件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)現(xiàn)有系統(tǒng)的升級(jí)增配、擴(kuò)展與完善，可進(jìn)一步明確生物力學(xué)等因素在人體正常生理情況下以及相關(guān)病變發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，可為疾病預(yù)防、治療提供更多的具有生物力學(xué)特色的新技術(shù)、新方法和新思路。同時(shí)未來(lái)將該設(shè)備功能提升所產(chǎn)出的高水平科研成果和高新技術(shù)及時(shí)轉(zhuǎn)化到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，契合科研反哺教學(xué)機(jī)制，積極將科研優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為教學(xué)優(yōu)勢(shì)，以期在此項(xiàng)目基礎(chǔ)上培育生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域優(yōu)秀的科研成果和教學(xué)成果，最終提高生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域?qū)I(yè)人才培養(yǎng)質(zhì)量。