＊龍弟梅 張?jiān)虑?葉文峰* 葉雨欣 項(xiàng)慧靈 陶秀花

（1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院 江西 336000 2.江西省林業(yè)科學(xué)院 江西 330200）

山香圓葉為省沽油科植物山香圓（Turpinia arguta Seem）。干燥的葉，味苦、性寒，生產(chǎn)于中國(guó)南部和西南部，具有清熱解毒、利咽消腫、消炎止痛等功能[1-2]。黃酮為山香圓葉中重要活性成分之一。

目前，提取山香圓葉黃酮類化合物的方法有熱回流法[3]、超聲波提取法[4]、微波提取法[5]，但有關(guān)酶法協(xié)同超聲波輔助提取山香圓葉中總黃酮的工藝研究未見報(bào)道。本研究以山香圓葉為原材料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助酶法提取山香圓葉中總黃酮工藝，提高化合物的提取率，為山香圓葉綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)實(shí)驗(yàn)材料

山香圓葉：采摘于江西省九江市共青城；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、纖維素酶（10萬U/g）：購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純

(2)實(shí)驗(yàn)儀器

AL-104電子天平：上海梅特勒-托利多儀器公司；DHG-9140電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海鴻都電子科技有限公司；CS-1000高速多功能粉碎機(jī)：武義海納電器有限公司；TECAN Infinite 200PRO全波段酶標(biāo)儀：北京世貿(mào)遠(yuǎn)東儀器有限公司；SK8210LHC超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

(3)實(shí)驗(yàn)方法

①山香圓葉的預(yù)處理

將山香圓葉在50℃干燥箱內(nèi)烘干，粉碎，過80目篩，裝于密封袋內(nèi)放置干燥處。

②蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于25mL容量瓶中，加無水乙醇定位至刻度，搖勻。精密吸取0mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入5% NaNO20.4mL搖勻，6min后加入10%Al(NO3)30.4mL，搖勻6min后加入NaOH 4mL搖勻，靜置20min后在500nm處測(cè)定吸光度[6]，得到回歸方程為Y=0.5161X+0.0114（R2=0.9991）。

③山香圓葉黃酮的提取及含量測(cè)定

精確稱取山香圓葉粉末1.00g，加入20mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至5，向料液中加入6mg纖維素酶，在50℃水浴下酶解40min，微沸水滅活后，超聲20min，離心15min（3500r/min）后得到山香圓葉黃酮提取液，加蒸餾水定容至25mL，吸取0.2mL黃酮提取液，按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立中的方法測(cè)定吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出山香圓葉總黃酮含量，根據(jù)公式（1）計(jì)算出總黃酮的提取率。

式中：Y為總黃酮得率，%；M1為根據(jù)回歸方程計(jì)算出測(cè)定時(shí)樣液中黃酮的質(zhì)量，mg；V1為樣液的體積，mL；M2為樣品的質(zhì)量，g；V2為測(cè)定時(shí)取樣液的體積，mL。

④山香圓葉總黃酮提取單因素試驗(yàn)

以總黃酮得率為參考指標(biāo)，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)選取超聲時(shí)間、酶添加量、酶解時(shí)間三因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

⑤山香圓葉黃酮提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以酶解時(shí)間、酶添加量、超聲時(shí)間為自變量，黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因數(shù)3水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)單因素試驗(yàn)結(jié)果

①酶解時(shí)間對(duì)山香圓葉黃酮得率的影響

圖1 酶解時(shí)間對(duì)山香圓葉黃酮得率的影響

圖2 酶添加量對(duì)黃酮提取率的影響

由圖1可知，在酶解時(shí)間為60min時(shí)山香圓葉總黃酮提取率達(dá)到最大，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，酶與底物充分結(jié)合，黃酮溶出，但反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起損失，導(dǎo)致山香圓葉黃酮得率呈下降趨勢(shì)。

②酶添加量對(duì)山香圓葉黃酮得率的影響

由圖2可知，隨著酶添加量的增加，黃酮的提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，是因?yàn)槊柑砑恿枯^少時(shí)，酶濃度和底物反應(yīng)未達(dá)到最佳反應(yīng)程度，反應(yīng)速度會(huì)隨酶的增加而加快。但酶的添加量達(dá)到一定的量時(shí)，會(huì)抑制酶與底物的反應(yīng)，導(dǎo)致黃酮的提取率下降。酶添加量為4mg時(shí)黃酮提取率最高.

③超聲時(shí)間對(duì)山香圓葉黃酮得率的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

由圖3可知，超聲時(shí)間也會(huì)影響黃酮的提取率，超聲時(shí)間過短不利于黃酮的溶出，超聲時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)破壞總黃酮，最佳提取時(shí)間為50min。

(2)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及方差分析結(jié)果

①響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素選取超聲時(shí)間、酶添加量、酶解時(shí)間3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

②響應(yīng)面結(jié)果及分析。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)曲面優(yōu)化山香圓葉黃酮提取率實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

③山香圓葉黃酮提取率模型建立分析。運(yùn)用Design expert 10.0.3數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，通過匯總分析，結(jié)果表明二次模型的擬合度較好?；貧w模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3，得到二次多項(xiàng)回歸模型：Y山香圓葉黃酮提取率為：2.79-0.029×A+0.20×B+0.019×C-0.033×AB+0.13×AC+0.052×BC-0.39×A2-0.48×B2-0.18×C2模型的決定系數(shù)R2為0.9879，Adj R2=0.9723，能夠解釋實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值變異，且與展望擬合度Pre R2=0.9523也接近，說明此實(shí)驗(yàn)具有良好的擬合性，試驗(yàn)誤差小。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，因素AC的P值為0.0063小于0.01，因素AB的P值為0.3679、BC的P值為0.1639均大于0.05，說明交互項(xiàng)AC對(duì)山香圓葉黃酮提取率具有極顯著的影響，交互項(xiàng)AB、BC對(duì)山香圓葉黃酮提取率影響不顯著，比較各因素的F值，B的F值為68.42、C的F值為62.49、A的F值為1.45，工藝條件對(duì)山香圓葉黃酮提取率影響大小順序?yàn)椋築＞C＞A，即酶添加量＞酶解時(shí)間＞超聲時(shí)間，且二次項(xiàng)交互作用對(duì)山香圓葉黃酮提取率影響大小程度為AC＞BC＞AB。

④各因素的交互作用。采用響應(yīng)面分析，通過Design-Expert軟件繪制各因素之間交互作用圖見圖4～圖6。

圖4 酶添加量和超聲時(shí)間對(duì)山香圓葉黃酮提取率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

從圖4可知，山香圓葉黃酮提取率隨酶添加量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，固定酶解時(shí)間，黃酮提取率隨超聲時(shí)間的增加呈先增后減變化趨勢(shì)，相對(duì)而言，酶添加量方向曲面波動(dòng)幅度較大，表明其對(duì)山香圓葉黃酮提取率影響較酶添加量影響更加顯著。僅考慮二者交互作用的情況下，酶添加量取3～5mg附近取值、超聲時(shí)間在40～50min時(shí)為山香圓葉黃酮提取率的臨界最佳工藝參數(shù)。

圖5 酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)山香圓葉黃酮提取率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

從圖5可知，固定超聲時(shí)間為零水平時(shí)，山香圓葉黃酮提取率隨酶添加量、酶解時(shí)間呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶添加量取3～5mg、酶解時(shí)間60～70min水平區(qū)間組合時(shí)，可顯著提高產(chǎn)物山香圓葉黃酮提取率。

在圖6所示的響應(yīng)面與等高線交互作用直觀圖中，當(dāng)酶添加量處于零水平時(shí)，山香圓葉黃酮提取率隨超聲時(shí)間、酶解時(shí)間呈先增加后降低的趨勢(shì)。僅考慮二者影響下的山香圓葉黃酮提取率優(yōu)化工藝條件集中于酶解時(shí)間60～70min，超聲時(shí)間40～50min區(qū)間組合。

圖6 超聲時(shí)間和酶解時(shí)間對(duì)山香圓葉黃酮提取率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

⑤驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)Design-Expert 10.0.3軟件運(yùn)行結(jié)果，得出最優(yōu)工藝為：酶添加量4.45mg、超聲時(shí)間42.8min、酶解時(shí)間63.1min。為了方便實(shí)際操作，修改為：酶添加量4mg、超聲時(shí)間43min、酶解時(shí)間63min，并測(cè)得山香圓葉黃酮提取率為2.65%。據(jù)此條件進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果山香圓葉黃酮提取率平均為2.67%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果2.65%非常接近，表明此響應(yīng)面模型可用于優(yōu)化山香圓葉黃酮提取率最佳工藝。

3.結(jié)論

通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到山香圓葉總黃酮最佳提取條件為：酶解時(shí)間63min，超聲時(shí)間43min，纖維素酶添加量4mg，在此條件下山香圓葉總黃酮得率為2.65%。與有機(jī)溶劑提取法相比，此法提取山香圓葉總黃酮簡(jiǎn)便、高效、沒有有機(jī)溶劑殘留，該方法只對(duì)山香圓葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化進(jìn)行了研究，未對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行分離，因此需進(jìn)一步分離山香圓葉中的黃酮類化合物，得出單體黃酮，為山香圓葉進(jìn)一步利用開發(fā)提供參考。