董鑫鑫， 楊方威， 于 航， 姚衛(wèi)蓉， 謝云飛

江南大學(xué)食品學(xué)院， 江蘇 無錫 214122

引 言

豬肉富含蛋白質(zhì)、 脂肪、 礦物質(zhì)等， 是我國居民膳食組成中的重要部分。 據(jù)調(diào)查顯示， 豬肉仍是主要肉類消費產(chǎn)品[1]， 豬肉新鮮與否與居民健康密切相關(guān)， 因此研究豬肉新鮮度的快速無損檢測方法意義重大。 目前， 肉品新鮮度的通用檢測方法可分為感官檢測、 理化檢測、 微生物檢測[2]， 感官檢測易受主觀因素的影響， 其可靠性、 可比性差， 理化檢測和微生物檢測耗時長、 操作繁瑣， 不適用于加工業(yè)快速實時大批量檢測。 近年來， 許多研究已將光譜分析技術(shù)用于肉類新鮮度快速檢測領(lǐng)域， 如近紅外光譜[3-5]、 拉曼光譜、 高光譜、 熒光光譜[6]等， 其中近紅外光譜技術(shù)是研究最多、 最常見的新鮮度檢測技術(shù)。

拉曼光譜和近紅外光譜均可以表征分子振動或轉(zhuǎn)動信息， 但拉曼光譜屬于散射光譜， 主要由非極性基團振動引起， 不會造成偶極矩的改變， 而近紅外光譜是吸收光譜， 主要反映由C—H， O—H， N—H， S—H等含氫基團振動引起的分子內(nèi)部偶極矩的改變， 因而二者可以互補。 近年來許多研究表明拉曼光譜在肉質(zhì)品檢測領(lǐng)域具有巨大潛力， Santos[7]等研究了便攜式拉曼光譜儀預(yù)測豬肉嫩度和剪切力的效果， 也有研究表明拉曼光譜儀具有預(yù)測牛肉多汁性和嫩度的潛力[8]， Zhao[9]等采用拉曼光譜結(jié)合多變量數(shù)據(jù)分析判斷牛肉漢堡是否摻假， 也有研究采用拉曼光譜結(jié)合偏最小二乘回歸(partial least squares regression， PLSR)模型及嶺回歸模型對明蝦鮮度進(jìn)行快速定量檢測， 結(jié)果表明可行性較高[10]。

目前近紅外光譜技術(shù)是最常見的肉品新鮮度光譜檢測技術(shù)， 而拉曼光譜技術(shù)同樣具有快速、 無損的特點， 便攜式拉曼光譜更是為食品現(xiàn)場檢測提供了新途徑。 本研究以揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen， TVB-N)為豬瘦肉主要新鮮度指標(biāo)， pH、 顏色L*值(亮度)、 顏色a*值(紅色)、 顏色b*值(黃色)為新鮮度參考指標(biāo)， 首先采用化學(xué)計量學(xué)方法將豬瘦肉全波段拉曼光譜和新鮮度指標(biāo)間建立關(guān)聯(lián)， 建立全波段PLSR預(yù)測模型， 篩選出最優(yōu)模型， 然后采用回歸系數(shù)(regression coefficient， RC)法篩選出特征波段， 建立優(yōu)選波段PLSR模型， 以期建立一種基于拉曼光譜技術(shù)的豬瘦肉新鮮度快速檢測方法， 解決傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣、 費時等問題， 為后續(xù)拉曼光譜快速檢測肉品新鮮度的研究提供參考， 推動肉品現(xiàn)場快速無損檢測方法的應(yīng)用拓展。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

材料： 6 kg豬后腿肉購于無錫市博大購物廣場歐尚大潤發(fā)超市， 1 h內(nèi)運往實驗室。 對6 kg豬后腿肉進(jìn)行去脂、 去筋處理， 用絞肉機將其絞碎后混合均勻， 進(jìn)行分裝處理， 每份樣品30 g(±0.001 g)， 保鮮膜包好， 置于實驗室4 ℃冰箱儲存。 每天選取3～5個時間點取樣， 每個時間點取出6份樣本進(jìn)行拉曼光譜的采集和新鮮度指標(biāo)的測定， 連續(xù)測定7 d。

試劑： 氫氧化鈉， 硼酸， 鹽酸， 氧化鎂， 氯化鉀， 均為分析純， 購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司； 甲基紅， 溴甲酚綠， 均為分析純， 購于北京伊諾凱科技有限公司。

1.2 儀器

BCD-551WKM冰箱(安徽合肥美的冰箱有限公司)； F1-F0785E60X-W No.19001便攜式拉曼光譜儀(北京卓立漢光儀器有限公司)、 CR-400色差計(日本柯尼卡美能達(dá)控股公司)、 K9860自動凱氏定氮儀(山東濟南海能儀器股份有限公司)、 便攜式酸度計(瑞士梅特勒-托利多集團)。

1.3 拉曼光譜的采集

為減少環(huán)境光的干擾， 在暗室中進(jìn)行拉曼光譜測量， 在激發(fā)波長785 nm、 激光功率60 mW、 積分時間5 s、 積分次數(shù)1次、 采樣間距7 mm， 儀器分辨率14 cm-1的檢測條件下， 對每份豬瘦肉樣品在203～3 198 cm-1范圍進(jìn)行便攜式拉曼光譜掃描。 每份豬瘦肉樣品隨機掃描20次(正面不同位置掃描10次， 反面不同位置掃描10次)以獲得較多的豬瘦肉樣品表面信息， 20次測量的平均值代表每個樣品的拉曼光譜。

1.4 豬瘦肉新鮮度指標(biāo)的測定

按照1.1中的取樣方法取樣進(jìn)行豬瘦肉新鮮度指標(biāo)的測定。

TVB-N值參照GB5009.228—2016中第二法自動凱氏定氮法規(guī)定的方法進(jìn)行測定。 pH值的測定： 稱取5 g豬瘦肉于燒杯中， 向其中加入50 mL 0.1 mol·L-1氯化鉀溶液， 用玻璃棒攪拌均勻， 使用pH計測定其pH， 每份樣本3個平行， 每個平行測定3次， 以平均值代表每份樣本的pH值。 色澤的測定： 使用手持式色差計對豬瘦肉進(jìn)行顏色的測定， 從每個樣品正反面共選取10個位置測量以獲得各位置的顏色L*值(亮度)， 顏色a*值(紅色)和顏色b*值(黃色)， 最終以10個位置L*值， a*值和顏色b*值的平均值代表樣品顏色。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2021進(jìn)行作圖。 光譜預(yù)處理、 波段優(yōu)選及模型的建立使用軟件The Unscrambler X 6.4完成， 光譜預(yù)處理方式為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variate， SNV)、 曲線平滑(Savitzky-Golay， SG)、 歸一化(normalize， NL)、 多元散射校正(multiplicative scatter correction， MSC)、 基線校正(baseline， BL)、 去趨勢化處理(detrending， DFA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同儲存時間豬瘦肉樣本拉曼光譜分析

不同樣本的拉曼光譜圖如圖1所示， 由圖1可知， 所有樣本的拉曼光譜曲線總體趨勢相似， 但同一樣本的不同位置光譜有差異， 不同樣本同一位置的光譜強度也有差異。

圖1 豬瘦肉樣本原始拉曼光譜圖Fig.1 Original Raman spectroscopy of lean pork samples

圖2 不同新鮮度樣本原始拉曼光譜對比圖Fig.2 Comparison of original Raman spectra of different freshness samples

2.2 樣本分集統(tǒng)計數(shù)據(jù)

本研究中獲得的TVB-N、 pH、 顏色(L*、 a*、 b*)值的樣本數(shù)分別為124， 130和121， 各指標(biāo)75%樣本作為校正集， 25%樣本作為預(yù)測集。 指標(biāo)分集統(tǒng)計數(shù)據(jù)如表1所示， 由表1可知， 儲存7 d后， TVB-N值由12.766增大到22.665， pH值由5.67增大到6.42， 豬瘦肉樣本大部分處在新鮮、 次新鮮范圍內(nèi)， 且校正集和預(yù)測集的平均值相差不大， 這為后續(xù)PLSR模型的建立奠定基礎(chǔ)。

表1 各新鮮度指標(biāo)的分集統(tǒng)計數(shù)據(jù)Table 1 Diversity statistical data of each freshness indicator

2.3 基于拉曼光譜的豬瘦肉新鮮度指標(biāo)PLSR模型的建立

2.3.1 全波段PLSR模型的建立

將全波段拉曼光譜同測定的不同新鮮度指標(biāo)值建立全波段PLSR模型， 評價模型的效果好壞指標(biāo)為相關(guān)系數(shù)(R)、校正均方根誤差(RMSEC)和預(yù)測均方根誤差(RMSEP)。 R越接近于1， RMSEC和RMSEP， RMSEP和RMSEC的差值越小， 模型的預(yù)測能力越好[12]。

各指標(biāo)原始光譜全波段建模結(jié)果如表2所示， 基于拉曼全譜建立的PLSR模型對各指標(biāo)均有一定的預(yù)測能力。 TVB-N、 pH預(yù)測模型RC分別為0.991和0.975，RP分別為0.938和0.886， 建立的色澤預(yù)測模型效果一般， 這可能是由于噪聲、 基線漂移等因素對拉曼光譜產(chǎn)生影響， 從而導(dǎo)致后續(xù)分析的誤差， 因此為了降低外界因素的干擾， 要通過光譜預(yù)處理提高光譜的貢獻(xiàn)量[13]。

表2 不同新鮮度指標(biāo)原始光譜建模結(jié)果對比Table 2 Comparison of original spectral modeling results of different freshness indexes

光譜預(yù)處理圖如圖3所示， 由圖3可知， 經(jīng)MSC、 SNV、 NL處理后， 光譜更為集中， 光譜的強度分布范圍變窄， 光譜形狀趨勢未改變； 經(jīng)SG和BL處理后， 光譜與原始光譜基本無差異； 經(jīng)DFA處理后， 譜峰較原始光譜更明顯， 在一定程度上減少了光譜的基線漂移。

圖3 豬肉樣本拉曼光譜預(yù)處理圖Fig.3 Pre-processing Raman spectra of pork samples

不同光譜預(yù)處理方式對模型效果會產(chǎn)生不同的影響， 以TVB-N模型為例， 不同預(yù)處理方式對其影響如表3所示， 由表3可知， 光譜經(jīng)SNV、 NL、 BL預(yù)處理后，RC和RP提高； 光譜經(jīng)SG、 MSC、 DFA預(yù)處理后，RC和RP降低， 說明并不是所有的光譜預(yù)處理方式都可以提高模型性能。

表3 不同光譜預(yù)處理方式對TVB-N模型的影響Table 3 Influence of different spectral preprocessing methods on model building

采用不同方法對光譜進(jìn)行預(yù)處理后建立不同指標(biāo)新鮮度模型， 各指標(biāo)最優(yōu)模型如表4所示， 由表4可知， 光譜經(jīng)SNV處理后， TVB-N、 pH、 L*值預(yù)測模型校正集和預(yù)測集的相關(guān)系數(shù)均提高， 為最佳光譜預(yù)處理方式， 其中TVB-N模型的RC和RP均可達(dá)0.9以上， 分別為0.994和0.948， 同時模型的均方根誤差減小， RMSEC由0.405降至0.329， RMSEP由1.058降至0.917， 說明模型的穩(wěn)定性提高， pH值模型的RC和RP分別為0.993和0.886， RMSEC和RMSEP分別為0.031和0.114， L*值模型的RC和RP分別為0.989和0.827， a*值的最佳模型為DFA-PLSR模型，RC和RP分別為0.966和0.858， L*值模型和a*值模型的的過擬合現(xiàn)象較為嚴(yán)重， 可能是由于光譜維數(shù)過多造成的。 光譜經(jīng)MSC處理后建立的b*值預(yù)測模型效果最好， 模型的RC和RP分別為0.964和0.900， 與SNV處理后模型預(yù)測效果相近。 經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)， 基于拉曼全波段光譜建立的豬瘦肉新鮮度模型對TVB-N的預(yù)測能力最佳， 對pH、 顏色b*值預(yù)測效果次之。

表4 不同新鮮度指標(biāo)最優(yōu)PLSR模型對比Table 4 Comparison of the optimal PLSR models for each freshness indicator

2.3.2 優(yōu)選波段PLSR模型的建立

采用RC法優(yōu)選拉曼光譜特征波段， 以期能簡化各指標(biāo)全波段PLSR最優(yōu)模型， 縮短運算時間， 優(yōu)選波段建模結(jié)果如表5所示， 由表5可知， TVB-N、 pH、 b*值所對應(yīng)的拉曼光譜優(yōu)選波段僅占全波段20%， L*值和a*值優(yōu)選波段分別占比15%和17%。 最終建模結(jié)果表明， TVB-N全波段模型和pH全波段模型可以簡化， TVB-N優(yōu)選波段PLSR模型RC和RP分別為0.958和0.933， RMSEP和RMSEC的差值降低， pH優(yōu)選波段PLSR模型RC和RP分別為0.988和0.880。 L*、 a*優(yōu)選波段模型RC和RP均降低， b*值優(yōu)選波段模型RP僅為0.649， 因此不建議采用RC法簡化L*、 a*、 b*值全波段PLSR模型。

表5 優(yōu)選波段建模結(jié)果Table 5 Modeling results of selected wavenumber

3 結(jié) 論

采用便攜式拉曼光譜儀快速無損檢測豬瘦肉新鮮度， 以拉曼光譜為基礎(chǔ)， 采用化學(xué)計量學(xué)方法同新鮮度指標(biāo)TVB-N、 pH、 顏色L*、 a*、 b*建立了全波段PLSR定量預(yù)測模型， 其最優(yōu)模型RP分別為0.948， 0.886， 0.827， 0.858和0.900， RMSEP分別為0.917， 0.114， 0.970， 0.468和0.425。 在全譜建模基礎(chǔ)上， 采用RC法篩選特征波段， 建立了各指標(biāo)優(yōu)選波段PLSR定量預(yù)測模型， TVB-N和pH預(yù)測模型可以簡化， 雖然模型精度較全譜模型有小幅下降， 但僅用20%的光譜波段就可達(dá)到定量預(yù)測的目的， 縮短了運算時間， 研究結(jié)果表明， 便攜式拉曼光譜儀可以實現(xiàn)對豬瘦肉新鮮度的快速無損檢測， 且對最常用的新鮮度指標(biāo)TVB-N值的預(yù)測效果最好。