◎ 文/陳玉函 姜淑泓 黃金泰 李冰清 趙道全 張嵐 王磊

為探索和完善烏蘇里擬鲿遺傳學(xué)研究中的分子標(biāo)記技術(shù)，本實驗對烏蘇里擬鲿80條SCoT引物進行多態(tài)性及其最佳退火溫度篩選，從中得出26條具有多態(tài)性且條帶清晰的引物，共擴增出135條條帶，其中多態(tài)性條帶86條，占總條帶數(shù)的63.70%，多態(tài)百分率為25%～100%，最佳退火溫度為47℃～63℃。該研究結(jié)果為SCoT分子標(biāo)記技術(shù)在烏蘇里擬鲿相關(guān)研究中的應(yīng)用提供了參考。

烏蘇里擬鲿（Pseudobagrus ussuriensis）俗稱牛尾巴、招財魚等，屬鲇形目（Siluriformes）、鲿科（Bagridae）、擬鲿屬（Pseudobagrus），在中國大部分江河、湖泊等水域均有分布，是一種重要的中小型經(jīng)濟魚類，其肉質(zhì)細嫩，無肌間刺，味道鮮美，營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值均較高，深受消費者和養(yǎng)殖戶的青睞。

在魚類分子標(biāo)記的研究中，常見的分子標(biāo)記有限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、簡單重復(fù)序列標(biāo)記（Simple Sequence Repeats，SSR）、擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、相關(guān)序列擴增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）等。目前，關(guān)于烏蘇里擬鲿遺傳學(xué)的研究報道常用的分子標(biāo)記主要有RAPD、SSR及SRAP等，以上方法在靈敏度、穩(wěn)定性、操作性上有各自的優(yōu)點，但也存在成本高、耗時長或重復(fù)性差等缺點。

2009年，澳大利亞學(xué)者Collard和美國學(xué)者Mackill開發(fā)了一種針對ATG起始密碼子及側(cè)翼保守性序列開發(fā)的新型目基因分子標(biāo)記技術(shù)（SCoT），此分子標(biāo)記具有成本低廉、多態(tài)性高、通用性強、操作簡單等優(yōu)點。國內(nèi)外已有許多學(xué)者利用SCoT分子標(biāo)記對眾多物種（如：橙點若鲹、六帶鲹、黑尻鲹等）進行了研究，但關(guān)于SCoT分子標(biāo)記在烏蘇里擬鲿中的研究目前尚未見報道。因此，本實驗利用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對80條SCoT引物進行篩選，以期為SCoT分子標(biāo)記技術(shù)在烏蘇里擬鲿中的應(yīng)用提供理論參考。

一、材料方法

（一）實驗材料

1.烏蘇里擬鲿

該研究所用的12尾烏蘇里擬鲿樣本采自河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院試驗中心，每尾個體剪取尾鰭組織后放在裝有無水乙醇的EP管中常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.SCoT引物

所用SCoT1～SCoT80由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物長度為18bp，推薦退火溫度49.6℃～63.2℃，將引物稀釋至0.05μmol/L備用。供試引物序列信息見表1。所用2×Taq PCR Master Mix（含染料）、基因組DNA提取試劑盒、DL2000均購于北京某公司。

表1 SCoT引物信息

（二）DNA提取與檢測

采用DNA提取試劑盒（D2100-100T）提取烏蘇里擬鲿鰭條的基因組

DNA，利用NanoDropOne/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀測定DNA濃度，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

（三）SCoT-PCR反應(yīng)

烏蘇里擬鲿SCoT-PCR反應(yīng)體系（20mL）為：10mL的2×Taq RCR Master Mix、1mL的模板DNA、1mL的引物（0.05mol/L）以及8mL的ddH2O。

PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性4min；95℃變性40s，適宜退火溫度復(fù)性50s，72℃延伸90s，共36個循環(huán)；最后72℃再延伸10min，4℃保存。

（四）退火溫度的確定及多態(tài)性引物篩選

使用如上PCR體系對SCoT的80條引物進行篩選。PCR擴增實驗程序同上，設(shè)置8個退火溫度為47℃、48.1℃、50.3℃、53.6℃、57.7℃、61.1℃、63℃、64℃。取10μLPCR產(chǎn)物、以2μL Marker為參照在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電極緩沖液為1×TAE，電壓為200V，電泳時間為25min，初步篩選出每條引物的最佳退火溫度。在該溫度及其前后兩個溫度下再次進行如上PCR擴增及電泳實驗，每個梯度設(shè)置3個平行，觀察凝膠成像，進而準(zhǔn)確篩選出引物的最佳退火溫度。利用上述篩選獲得的條帶清晰的引物及其最佳退火溫度，對12尾烏蘇里擬鲿基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增實驗程序同上。

（五）數(shù)據(jù)處理

SCoT-PCR擴增產(chǎn)物按同一遷移水平下條帶的有無分別賦值，有條帶記為1，無條帶記為0，人工讀取和統(tǒng)計條帶。

二、結(jié)果分析

（一）SCoT引物及其退火溫度的篩選

對SCoT引物退火溫度篩選的結(jié)果表明，對于同一模板DNA，在不同的退火溫度下，引物的擴增效果在條帶明亮程度及清晰度上存在較大差異。以SCoT-23（見圖1）為例，當(dāng)退火溫度為53.3℃時，擴增條帶完整且清晰明亮，當(dāng)退火溫度為大于或小于53.3℃時，擴增條帶不完整且模糊；根據(jù)最佳退火溫度的篩選，從80條引物中篩選出條帶清晰的引物35條，最佳退火溫度見表2。

表2 35條SCoT引物及其退火溫度

圖1 SCoT-23擴增的PCR產(chǎn)物

（二）多態(tài)性引物的篩選

利用上述擴增出的條帶清晰的35條SCoT引物及其最佳退火溫度，對12尾烏蘇里擬鲿基因組DNA進行PCR擴增，最終篩選出26條條帶清晰、具有多態(tài)性的SCoT引物。如表3所示，26條引物共擴增出135個條帶，范圍為3條～9條，其中多態(tài)性條帶86個，平均每條引物擴增出3.31條多態(tài)性片段，范圍為1條～7條，多態(tài)性比率為64.28%。多態(tài)性最高的引物為SCoT-18、SCoT-25、SCoT-61、SCoT-72，多態(tài)百分率均為100%；多態(tài)性最低的引物為SCoT-23，多態(tài)百分率為25%。部分引物對烏蘇里擬鲿擴增結(jié)果如圖2所示。

圖2 SCoT-29擴增的PCR產(chǎn)物

表3 26條SCoT引物擴增結(jié)果

三、討論

SCoT分子標(biāo)記是一種基于翻譯起始位點的目的基因標(biāo)記新技術(shù)，擴增產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)顯性多態(tài)性標(biāo)記，其操作簡單，易于各物種SCoT-PCR反應(yīng)體系的建立，且成本相對較低，在生物多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和重要性狀標(biāo)記等方面得到廣泛應(yīng)用。不同的實驗材料與反應(yīng)條件下的退火溫度各不相同，因此有必要針對不同的物種篩選適宜的SCoT退火溫度。本實驗從80條引物中篩選出26條條帶完整、清晰且多態(tài)性較高的引物，退火溫度分布在47℃～63℃，在26條適用引物中，退火溫度為50.3℃的有13條，占適用引物的50%。

有學(xué)者在利用SCoT標(biāo)記對花生屬遺傳多樣性分析中，篩選出19條多態(tài)性引物，多態(tài)性比率為31.80%；有研究表明，對歐洲舌齒鱸與斑點舌齒鱸兩個相近物種遺傳關(guān)系分析時所利用的11條SCoT引物的多態(tài)性比率為39%；另有學(xué)者對橙點若鲹、六帶鲹、黑尻鲹相互間的遺傳多樣性分析時所利用的12條SCoT引物的多態(tài)性比率為39%、35%、53%。該實驗篩選出能在烏蘇里擬鲿中擴增的26條多態(tài)性引物，其多態(tài)性比率為64.28%，明顯高于上述物種，這可能是因為烏蘇里擬鲿的親本來自自然水域，保留了較高的多態(tài)性。該實驗首次將SCoT分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于烏蘇里擬鲿，填補了烏蘇里擬鲿SCoT分子標(biāo)記方面的空缺，為SCoT分子標(biāo)記在烏蘇里擬鲿中的應(yīng)用提供了參考。