伊特格樂(lè)，燕 興，賀 平，賈晨光，白玉娥

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.鄂爾多斯市杭錦旗林業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017499；3.呼和浩特市林業(yè)和草原保護(hù)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011）

黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr.），茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium L）多年生棘刺灌木，主要分布于我國(guó)青海、新疆、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等地的鹽堿地、沙漠、戈壁，是一種抗旱、耐鹽堿植物。

本研究以野生黑果枸杞葉片為外植體材料，篩選不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑比例培養(yǎng)基，僅用1 種培養(yǎng)基便完成了愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化試驗(yàn)過(guò)程，簡(jiǎn)化了操作步驟，將培養(yǎng)時(shí)間控制在35 d 內(nèi)，并顯著提高了不定芽分化系數(shù)，為黑果枸杞的遺傳轉(zhuǎn)化、工廠化育苗及資源保護(hù)提供了技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟奧倫布拉格鎮(zhèn)黑果枸杞種質(zhì)資源收集圃的青海種源黑果枸杞2 年生實(shí)生苗。因野外距離實(shí)驗(yàn)室較遠(yuǎn)，2020 年4 月末，將無(wú)病蟲(chóng)害萌蘗苗移栽到內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)育種實(shí)驗(yàn)室。6月中旬采集嫩葉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

將試驗(yàn)外植體材料分為A、B、C、D 共4 個(gè)組，均先用洗潔精水浸泡3 min，然后采取不同消毒處理。A 組用流動(dòng)水沖洗2 h 作為對(duì)照，B、C、D 組沖洗2 h 過(guò)程中，每隔30 min 用75%酒精分別浸泡10 s、20 s、30 s，洗去殘留酒精后繼續(xù)流動(dòng)水沖洗，每組3 次重復(fù)。

將處理好的葉片放置在超凈臺(tái)上，用75%的酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3 次以上，再用2%的NaClO 浸泡8 min，無(wú)菌水沖洗5 次，獲得無(wú)菌外植體材料。7 d后統(tǒng)計(jì)存活率、死亡率、污染率。

以上試驗(yàn)重復(fù)3 次，每7 d 觀察拍照。存活率、死亡率和污染率相關(guān)計(jì)算公式如下。

1.2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)愈傷及不定芽分化

MS 為基本培養(yǎng)基，以0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.6 mg/L NAA 不同配比，設(shè)定12 個(gè)不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合。將葉片切成長(zhǎng)方形，在表面劃3～4 個(gè)傷口，接種到培養(yǎng)基上。每瓶接種2 個(gè)外植體，共20 瓶。暗培養(yǎng)，20 d 左右統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，35 d 左右統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率及不定芽分化系數(shù)。以上試驗(yàn)重復(fù)3 次，每7 d 觀察拍照。相關(guān)計(jì)算公式如下。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 和SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片外植體消毒方法篩選

從表1 可以看出，用流動(dòng)水沖洗葉片時(shí)，75%酒精溶液浸泡外植體20 s 的C 組外植體存活率顯著高于其他處理。浸泡20 s 的C 組污染率為2.5%，比對(duì)照組污染率降低32.5%；經(jīng)過(guò)30 s 浸泡處理的D 組污染率最低，為1.25%，但死亡率最高，達(dá)到20%，明顯對(duì)葉片造成了傷害。用流動(dòng)水沖洗外植體2 h 的過(guò)程中，每隔30 min 用75%酒精處理外植體20 s，能顯著降低外植體的死亡率和污染率，而存活率比未經(jīng)過(guò)酒精浸泡處理提高了31.25%。綜合比較認(rèn)為，最佳消毒方法為C 組，即葉片在流水沖洗時(shí)，每隔30 min 用75%酒精溶液浸泡20 s，將處理好的葉片放置在超凈臺(tái)上，再用75%的酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗，2%的NaClO 浸泡8 min，無(wú)菌水沖洗5 次。

表1 不同消毒處理對(duì)黑果枸杞葉片外植體污染的影響

2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)葉片誘導(dǎo)愈傷及不定芽分化的影響

由圖1 可知，外植體接種到添加不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS 培養(yǎng)基上，3～4 d 后葉片開(kāi)始明顯膨大，顏色由深綠色變?yōu)闇\綠色，多數(shù)葉片出現(xiàn)卷曲；經(jīng)過(guò)10 d左右，葉片劃傷處開(kāi)始產(chǎn)生愈傷組織。

圖1 A6 培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)情況

由表2 可知，NAA 濃度同一條件下，6-BA 濃度不同，外植體愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率和不定芽分化系數(shù)均存在顯著性差異。隨著6-BA 濃度降低，愈傷誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率明顯增加，且褐化現(xiàn)象減少；當(dāng)6-BA 濃度達(dá)到1.5 mg/L 時(shí)，愈傷增殖和不定芽分化受到抑制，出現(xiàn)褐化等現(xiàn)象。因此，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最大的培養(yǎng)基組合為MS+0.6 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

不定芽分化情況顯示，6-BA 濃度在0.1～0.5 mg/L時(shí)，隨著NAA 濃度降低，不定芽分化系數(shù)總體呈增加趨勢(shì)；6-BA 濃度在1～1.5 mg/L 時(shí)，不定芽分化系數(shù)隨著NAA 濃度降低而降低。在0.3 mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA 的組合條件下，不定芽分化系數(shù)可達(dá)22.94，在該培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d 左右時(shí)，愈傷組織分化出4～5 個(gè)白色健壯的芽，30 d 時(shí)分化出大量健康的芽。因此，誘導(dǎo)不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。

綜合總體生長(zhǎng)情況，如果采用同一培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷協(xié)同不定芽分化，最佳組合為A6 組合，即MS+0.3mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。

3 討論

外植體的選擇在植物離體培養(yǎng)中至關(guān)重要。相關(guān)研究中，黑果枸杞組培多數(shù)以種子播種的無(wú)菌苗獲得莖尖、葉片等外植體，此方法不利于保持母本性狀，而后期出現(xiàn)以帶芽莖段、葉片等作為外植體材料。前期研究發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞葉片類似海綿狀，老葉片較嫩葉更易粘附空氣中細(xì)菌和污漬，因此本研究采用野生黑果枸杞嫩葉。

外植體的消毒是植物離體培養(yǎng)成功的前提。孫曉紅等（2016）[1]以0.1%氯化汞消毒葉片，幾乎無(wú)感染。胡相偉等（2015）[2]利用75%酒精和0.1%氯化汞溶液（加1～2 滴吐溫20）依次處理1 年生休眠枝條，得到無(wú)菌外植體。

氯化汞滅菌效率高，但屬于劇毒藥物，被排除。酒精消毒時(shí)間太短，不能清除干凈附在外植體表面的雜質(zhì)和各種微生物，易污染；酒精消毒時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)破損外植體表面進(jìn)而受傷害。因此，本研究采用75%酒精每隔30 min 時(shí)浸泡20 s 的多次短時(shí)間重復(fù)的消毒方法獲得黑果枸杞無(wú)菌外植體。

試驗(yàn)結(jié)果表明，采集的嫩葉最佳消毒方法為流水沖洗外植體2 h，期間每隔30 min 用75%酒精處理外植體20 s，將處理好的葉片放置在超凈臺(tái)上再用75%的酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗，2%的NaClO 浸泡8 min，無(wú)菌水沖洗5 次。該方法污染率2.50%，死亡率3.75%，存活率95.00%，存活率比對(duì)照提高31.25%。

影響植物再生頻率的主要因素是培養(yǎng)基添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量。Li Yuanyuan 等（2017）[3]研究結(jié)果顯示，黑果枸杞叢芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L KT+0.02 mg/L NAA，增殖系數(shù)為3.83，叢芽健壯且無(wú)玻璃化現(xiàn)象。孫曉紅等（2016）以葉片為材料的研究表明，添加1.0 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基，愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)100%。本研究顯示，對(duì)于黑果枸杞葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+0.6 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率達(dá)97.78%；對(duì)于不定芽分化而言，6-BA濃度在0.1～0.5 mg/L 時(shí)，隨著NAA 濃度降低，不定芽分化系數(shù)總體呈增加趨勢(shì)，當(dāng)6-BA 濃度在1～1.5 mg/L時(shí)，不定芽分化系數(shù)隨著NAA 濃度降低而降低。本研究中葉片愈傷誘導(dǎo)和不定芽分化采用同一培養(yǎng)基，最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，暗培養(yǎng)，愈傷誘導(dǎo)率97.22%，愈傷繼續(xù)培養(yǎng)20 d 左右開(kāi)始分化不定芽；15 d 后統(tǒng)計(jì)，不定芽誘導(dǎo)率97.38%，不定芽分化系數(shù)22.94。這樣可以將整個(gè)繁育期整體縮短到35 d 內(nèi)，較前人研究更滿足黑果枸杞快繁工廠化生產(chǎn)的需求。