何瓊，鄭彥伯，姜鈺虹，陳安均

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625000)

無花果(FicuscaricaL.)，為植物?？?Moraceae)榕屬(Ficus)多年生木本果樹[1]，具有獨(dú)特的“由內(nèi)而外”結(jié)構(gòu)的水果，花序托果實的果肉呈囊狀，頂端有一個小孔，小花團(tuán)聚在內(nèi)壁上，在外部不可見，因而將其稱為“無花果”[2]。新鮮時果實皮薄而嫩，成熟時多汁而甜，而且富含礦物質(zhì)、維生素、糖類、黃酮類等物質(zhì)，還含有苯甲醛、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯等多種活性物質(zhì)成分，可起到抗氧化、抗衰老、抗痙攣、抗病毒、抗炎以及潛在的抗癌活性和降低患心血管疾病的風(fēng)險[3-4]。無花果因其營養(yǎng)價值、良好的風(fēng)味且易腐爛、難以貯存而適合加工成無花果酒。無花果酒是指以無花果為原料，將其破碎后利用酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為酒精等產(chǎn)物，再經(jīng)陳釀后成為酒質(zhì)醇厚芳香、酒體清亮透明的果酒產(chǎn)品。

無花果酒外觀清澈悅目，香氣濃郁協(xié)調(diào)，含有多種對人體有益的生物活性成分。但無花果酒釀制后易出現(xiàn)高級醇含量偏高的現(xiàn)象，酒體刺激而不夠飽滿，需要進(jìn)行陳釀以促進(jìn)酒體的飽滿。本實驗以高級醇類物質(zhì)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和有機(jī)酸類物質(zhì)含量為主要評價指標(biāo)，找到無花果酒的最佳陳釀期，在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)研究陳釀期無花果酒的品質(zhì)變化規(guī)律，為無花果酒的研究提供理論依據(jù)，對無花果酒的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

布朗瑞克新鮮無花果，采自四川威遠(yuǎn)縣；市售酵母KD，法國馬丁威蘭特公司；食品級蔗糖，市售；食品級焦亞硫酸鉀，浙江一諾生物科技有限公司。

NaOH、葡萄糖、磷酸、體積分?jǐn)?shù)30% H2O2、NaCl、NaCO3、KCl、HCl、甲醇、無水乙醇、乙腈、磷酸、環(huán)己酮(均為色譜純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；乙酸正丁酯、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、苯乙醇(均為標(biāo)準(zhǔn)品)，上海晶純生化科技有限公司；蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、草酸、丁二酸、叔戊醇(均為標(biāo)準(zhǔn)品)，阿拉丁。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SHP生化恒溫培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HDP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DZKW-D-4型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；超聲清洗機(jī)，昆山潔力美超聲儀器有限公司；U3000液相色譜儀，美國Thermo公司；7890A/59750氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，7890B氣相色譜儀；美國Agilent Technologies公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無花果酒的釀制

參考蔣成等[5]的方法，并稍作修改。新鮮無花果經(jīng)清洗后，去梗打漿，用食品級焦亞硫酸鉀將SO2質(zhì)量濃度調(diào)為80 mg/kg，用蔗糖調(diào)整糖度為23°Brix。各取800 mL無花果汁于1 000 mL磨砂廣口瓶中，分別接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%酵母KD(酵母在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%糖水中37 ℃時活化30 min)，于20 ℃發(fā)酵15 d。進(jìn)行倒罐后于20 ℃繼續(xù)后發(fā)酵10 d，分離酒腳即得到原酒。

1.2.2 無花果酒的釀制

將1.2.1得到的無花果酒罐裝到250 mL玻璃瓶中裝滿密封，置于溫度為10 ℃、濕度為70%～80%、隔光的保鮮柜中，每隔30 d取出3瓶進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.2.3 理化指標(biāo)測定

酒精度、總干浸出物、總酸采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測定。酒精度采用GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測定》進(jìn)行測定。

1.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

參照ZHU等[6]的方法，采用頂空固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)結(jié)合GC-MS進(jìn)行無花果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定。以環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)。

色譜條件：采用30 m×0.250 mm的HP-5MS色譜柱，初始溫度為40 ℃，保持時間1 min，以5 ℃/min升至70 ℃，再以2 ℃/min升至120 ℃，以8 ℃/min升至160 ℃，再以6 ℃/min升至250 ℃，保持1 min，載氣為He，流速為1.2 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度為260 ℃。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離電壓70 eV，燈絲流量0.25 mA，連接桿溫度280 ℃，電子倍增器電壓為1 500 V，掃描范圍為30～350 AMU，離子源溫度250 ℃。

定性、定量分析：使用NIST11譜庫對未知揮發(fā)性化合物譜圖進(jìn)行比對，選取匹配度≥70%的物質(zhì)作為有效的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)合相關(guān)資料進(jìn)行分析鑒定，并采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 有機(jī)酸含量的測定

參照GB/T 32783—2016《藍(lán)莓酒》，并略作修改。色譜條件：色譜柱為美國Zorbax Eclipse Plus C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；紫外檢測波長214 nm。洗脫條件：0～5 min，0.1%磷酸水溶液95%，流速0.5 mL/min；5～8 min，0.1%磷酸水溶液95%，流速0.3 mL/min；8～15 min，0.1%磷酸水溶液40%，流速0.3 mL/min；15～25 min，0.1%磷酸水溶液95%，流速0.5 mL/min。以此方法所制標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線表Table 1 Organic acid standard curve table

1.2.6 高級醇含量的測定

參考蔣成等[5]的方法，采用氣相色譜/氫火焰離子檢測器(gas chromatography-flame ionization detector, GC-FID)。以乙酸正丁酯為內(nèi)標(biāo)，配制正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇和苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。

色譜條件：采用30 m×0.250 mm的HP-INNOWAX色譜柱，初始溫度為40 ℃，保持時間4 min，以3.5 ℃/min升至170 ℃，再以20 ℃/min升至200 ℃，保持10 min；進(jìn)樣量為1 μL；分流比50∶1；分流流量50 mL/min；空氣流量400 mL/min；H2流量30 mL/min；尾吹氣流量25 mL/min。

甲醇測定采用GB 5009.266—2016《食品中甲醇的測定》進(jìn)行測定。按照以上方法所制標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

表2 醇類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線表Table 2 Standard curve table of alcohols

1.2.7 Kramer 感官順位評定

參照桑葦?shù)萚7]的方法，并略作修改。品評員進(jìn)行Kramer感官品評，得到隨機(jī)排序編號的樣品后，按照喜好程度將樣品先大致分為上、中、下3組，再在3組組內(nèi)進(jìn)行比較排序，確定所有樣品喜好順序。

1.2.8 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗至少重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 24軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 8.5和TBtools軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同陳釀時間的無花果酒的基礎(chǔ)指標(biāo)分析

如表3所示，不同陳釀時間的無花果酒在酒精度、總浸出物和總酸中存在顯著性差異(P<0.05)。其中，陳釀0個月時無花果酒的酒精度最高(13.26%vol)，而陳釀9個月時酒樣酒精度較低(11.55%vol)，且酒精度隨著陳釀時間的增加而減少，這與曾竟藍(lán)[8]的研究類似，可能是陳釀過程中醇與酸緩慢反應(yīng)生成酯，增加了果酒的陳釀香[9]。本實驗的無花果酒總浸出物含量均大于NY/T 1508—2017《綠色食品 果酒》中規(guī)定的12 g/L，其中，陳釀0個月時無花果酒的總浸出物含量最低(21.60 g/L)，9個月時較高(23.63 g/L)，隨著陳釀時間的延長總浸出物含量呈現(xiàn)上升趨勢。陳釀0個月的無花果酒的總酸含量最高(5.1 g/L)，陳釀3個月的酒樣總酸含量最低(4.88 g/L)，隨著陳釀時間的增加總酸含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，這與周雪燕等[10]對冰葡萄酒的研究類似。

表3 不同陳釀時間酒樣的基礎(chǔ)指標(biāo)Table 3 Basic indicators of wine samples at different ages

2.2 不同陳釀時間的無花果酒醇類物質(zhì)含量分析

本實驗的無花果酒中檢測出了正丙醇、正丁醇、異戊醇和苯乙醇。陳釀0個月時高級醇總量最高(641.88 mg/L)，隨著陳釀時間的增加，高級醇總量顯著下降，在陳釀9個月時較低(363.49 mg/L)，而高級醇含量<400 mg/L時，能賦予果酒典型的香氣[11]。正丙醇、正丁醇、異戊醇的含量都隨著陳釀時間的增加而呈現(xiàn)下降趨勢，其中，異戊醇含量下降最多，陳釀9個月(219.61 mg/L)較0個月(384.6 mg/L)時下降了42.90%，正丙醇下降了19.89%(由45.29 mg/L下降到了36.28 mg/L)，正丁醇下降了47.46%(由131.1 mg/L下降到了68.88 mg/L)。正丙醇有輕微的醚味和較重的苦味[12]，下降會使酒中的苦味略微減弱。異戊醇有強(qiáng)烈的沖辣感[12]，因而陳釀后的無花果酒會較為柔和。高級醇含量下降的原因可能是轉(zhuǎn)化為相應(yīng)醛類及酸類物質(zhì)[13]，如異丁醇、異戊醇可以轉(zhuǎn)化形成乙酸酯[14]。

苯乙醇的香味獨(dú)特，具有玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香等多樣風(fēng)味[15]。在陳釀過程中，苯乙醇的含量呈現(xiàn)下降的趨勢，陳釀9個月時的酒樣苯乙醇含量較低(38.73 mg/L)，陳釀1個月時含量最高(87.63 mg/L)。

甲醇具有一定的毒性，不同陳釀時間酒樣的甲醇含量均小于GB/T 15037—2006《葡萄酒》規(guī)定的400 mg/L。由圖1可知，未陳釀的酒樣甲醇含量最高(375.3 mg/L)，隨著陳釀時間的增加含量呈現(xiàn)顯著下降趨勢，陳釀9個月時(271.79 mg/L)較未陳釀時下降了27.58%。這可能是陳釀過程中甲醇轉(zhuǎn)化為了甲酸[16]。

a-醇類；b-甲醇；c-有機(jī)酸圖1 不同陳釀時間無花果酒的醇類物質(zhì)含量、有機(jī)酸含量Fig.1 Alcohol content and organic acid content in FIG wine with different aging time注：不同小寫字母代表差異顯著(下同)

2.3 不同陳釀時間的無花果酒有機(jī)酸含量分析

在本實驗的無花果酒中能檢測到的有機(jī)酸有草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸和丁二酸。就整體而言，陳釀0個月時有機(jī)酸的總量最低(3 682.48 mg/L)，隨著陳釀時間的延長有機(jī)酸含量呈顯著上升趨勢，以陳釀9個月時較高(4 193.78 mg/L)(圖1-c)，可能是陳釀過程中醛類物質(zhì)逐漸氧化而生成酸[8]，這與BAIANO等[17]的研究結(jié)果相似。蘋果酸在有機(jī)酸中占比最高，為36.50%～44.72%，陳釀0個月時蘋果酸含量最低(1 344.01 mg/L)，隨著陳釀時間的延長顯著升高，陳釀9個月時較高(1 875.53 mg/L)。此外，草酸、乳酸、檸檬酸和丁二酸均隨著陳釀時間的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，乳酸含量的下降可能是和乙醇作用生成乳酸乙酯[18]。其中，草酸、乳酸和檸檬酸含量在陳釀5個月時達(dá)到最大值(分別為54.91、1 089.12和751.96 mg/L)，丁二酸含量在陳釀4個月時達(dá)到最大值(367.41 mg/L)。酒石酸含量在陳釀0個月時最低(231.22 mg/L)，其含量隨著陳釀時間的增加呈現(xiàn)上升趨勢，陳釀9個月時含量較高(258.99 mg/L)，酒石酸含量的變化可能與酒石酸絡(luò)合物的形成與解聚有關(guān)系。

2.4 不同陳釀時間的無花果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量及熱圖分析

不同陳釀時間無花果酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量見電子增強(qiáng)出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.030394)。利用TBtools得到不同陳釀時間的無花果酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中氣味活性值(odor activity value, OAV)>1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的熱圖(圖2)。X軸為不同的陳釀時間，Y軸為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的名稱。樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量越高顏色越紅，含量越低顏色越綠，紅色的圓形圖案越大，OAV越大，綠色的圓形圖案越大，OAV越小。不同陳釀時間無花果酒OAV>1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量見電子增強(qiáng)出版附表2。

通過對比10種樣品可知，OAV最大的物質(zhì)為辛酸乙酯，具有花果、杏子香氣[19]，其含量隨著陳釀時間的增加而呈現(xiàn)顯著增加的趨勢，在陳釀9個月時OAV達(dá)到20 109.08，為無花果酒最主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其次，OAV較大的物質(zhì)為正己酸乙酯、乙酸異戊酯、十四酸乙酯、DL-2-羥基己酸乙酯、香茅醇和大馬士酮，這些為無花果酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)。其中，己酸乙酯提供青蘋果樣的香氣[20]，乙酸異戊酯賦予果酒成熟香蕉的氣味[21]，大馬士酮賦予果酒花香及漿果香[21]，香茅醇擁有玫瑰香、甜香、柑橘香[21]。隨著陳釀時間的增加，乙酸異戊酯的含量呈現(xiàn)上升趨勢，在陳釀9個月時較大(10 631.59 μg/L)。隨著陳釀時間的增加，正己酸乙酯的含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在陳釀0個月時為最大值(17 917.47 μg/L)。大馬士酮、香茅醇和十四酸乙酯均在陳釀9個月時較大(分別為10 561.83、5 936.61和3 240.08 μg/L)。另外，在無花果酒中OAV稍大的物質(zhì)為乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、2-甲基肉豆蔻酸甲酯、乙基異戊基琥珀酸酯、苯乙醇和D-檸檬烯，這些物質(zhì)在無花果酒中的風(fēng)味也很重要。其中，乙酸苯乙酯賦予果酒以玫瑰花香[21]，癸酸乙酯具有菠蘿水果香、花香、甜香等[21]，苯乙醇具有玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香等多樣風(fēng)味[15]，D-檸檬烯具有花香、甜香、檸檬香和柑橘香等香味[21]。在陳釀過程中，乙酸苯乙酯和癸酸乙酯含量隨著陳釀時間的增加而增加，在陳釀9個月時較大(分別為11 281.48和17 623.91 μg/L)。隨著陳釀時間的增加，丁二酸二乙酯和苯乙醇的含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在陳釀9個月時較大(分別為21 217.09和193 194.87 μg/L)。D-檸檬烯的含量也在陳釀9個月時較大(2 528.52 μg/L)?？傮w而言，陳釀時間的延長對無花果酒的風(fēng)味有積極的影響。

圖2 OAV>1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的熱圖Fig.2 Heat map of volatile flavor substance with OAV>1

2.5 不同陳釀時間的無花果酒電化學(xué)指標(biāo)分析

pH值代表H+在溶液中的濃度，圖3-a是不同陳釀時間無花果酒pH值的變化情況。隨著陳釀時間的增加，無花果酒的pH值呈現(xiàn)輕微下降的趨勢，在陳釀9個月時較小(3.76)。

電導(dǎo)率反映了單位體積溶液中離子總數(shù)的多少，由圖3-b可知，未陳釀的無花果酒的初始電導(dǎo)率為1 678 μs/cm，隨著陳釀時間的增加，無花果酒的電導(dǎo)率值不斷增加，在陳釀9個月時較大(1 747 μs/cm)。這說明在陳釀過程中某些物質(zhì)發(fā)生了一定的氧化及離子化，導(dǎo)致酒體離子化程度升高，電導(dǎo)率值因此而升高，而電導(dǎo)率的升高可促使果酒更快的達(dá)到平衡狀態(tài)，這與楊星[22]和張斌[23]的研究結(jié)果類似。

a-pH；b-電導(dǎo)率；c-溶解氧；d-氧化還原電位圖3 不同陳釀時間無花果酒的電化學(xué)指標(biāo)Fig.3 Electrochemical indexes of FIG wine with different aging time

溶解氧指酒體中溶解的分子態(tài)氧，控制好溶解氧值可以提高果酒的風(fēng)味和品質(zhì)。由圖3-c可以看出，未陳釀的無花果酒的溶解氧值最大(4.76 mg/L)，隨著陳釀時間的增加，溶解氧值顯著下降，在陳釀9個月時較小(3.59 mg/L)，這與張斌[23]對白蘭地陳釀的研究結(jié)果類似。這說明，隨著陳釀時間的延長，無花果酒中發(fā)生了氧化反應(yīng)，氧化反應(yīng)消耗了無花果酒中的溶解氧，這也與電導(dǎo)率值的升高相互印證。在陳釀后期，溶解氧值的變化幅度較小，這也說明無花果酒的整體狀態(tài)逐漸趨于平衡狀態(tài)。

氧化還原電位值反映溶液中各種物質(zhì)的綜合氧化能力或還原能力的一個狀態(tài)參數(shù)，電位為正表示溶液顯示出一定的氧化性，為負(fù)顯示出還原性[24]。如圖3-d所示，不同陳釀時間的無花果酒的氧化還原電位值都為正數(shù)，說明無花果酒顯示出氧化性。未陳釀的無花果酒氧化還原電位值最高(206.9 mV)，隨著陳釀時間的增加，氧化還原電位值顯著下降，在陳釀9個月時較小(192.1 mV)，也與張斌[23]的研究結(jié)果類似。這說明無花果酒的氧化性隨著陳釀時間的增加而逐漸降低，說明酒體在逐漸達(dá)到氧化還原電位的平衡狀態(tài)，與溶解氧值和電導(dǎo)率值的變化相互印證。

2.6 不同陳釀時間的無花果酒的Kramer感官順位評定分析

12名感官品評員對不同陳釀時間的10個無花果酒樣品的風(fēng)味優(yōu)劣進(jìn)行Kramer感官評定，結(jié)果如表4所示。

表4 Kramer感官順位評定結(jié)果排序Table 4 Ranking of Kramer sensory placement results

由表4可知，12名品評員對10個酒樣進(jìn)行排序，無相同位級。由表5可知，在1%顯著性水平下，上段為36～96，下段為43～89。上段中，Rimax=96R0月=17，所以在1%顯著水平，10個樣品間有顯著性差異。在下段中，43R8月>89，R0月<43，10個樣品可劃分為3組，即0；1、2、3、4、5、6、7；8、9，組內(nèi)各樣品無顯著性差異。因此，陳釀8個月和9個月的樣品感官風(fēng)味較優(yōu)。

表5 Kramer 感官順位評定顯著水平臨界值Table 5 The critical level of significance was assessed by Kramer sensory alignment

3 結(jié)論

不同陳釀時間對無花果酒的理化指標(biāo)、高級醇、有機(jī)酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、電化學(xué)指標(biāo)和感官風(fēng)味等均有顯著影響。陳釀至9個月的無花果酒外觀清澈悅目，口味柔和，酒體不刺激，香氣濃郁協(xié)調(diào)。

陳釀9個月時，無花果酒的高級醇含量為363.49 mg/L<400 mg/L，較未陳釀下降了43.37%，能賦予果酒積極的醇類風(fēng)味；無花果酒的有機(jī)酸含量為4 193.78 mg/L，較未陳釀下降了12.14%，且有草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸和丁二酸6種有機(jī)酸，賦予無花果酒爽口、協(xié)調(diào)的口感；陳釀9個月時酒樣中賦予無花果酒花香、甜香、果香等風(fēng)味的辛酸乙酯、大馬士酮、香茅醇、己酸乙酯和乙酸異戊酯等物質(zhì)含量都較未陳釀時有所上升。因而，陳釀9個月時無花果酒的風(fēng)味、口感和典型性都較未陳釀酒樣高。另外，根據(jù)Kramer感官順位評定的結(jié)果，得出陳釀第8個月和9個月時的無花果酒感官風(fēng)味優(yōu)于未陳釀的酒樣。

在陳釀后期尤其是陳釀9個月時，與陳釀初期相比，pH值較小(3.76)；電導(dǎo)率值較大(1 747 μs/cm)；溶解氧值較小(3.59 mg/L)；氧化還原電位值較小(192.1 mV)，這些說明無花果酒正在趨于平衡狀態(tài)，陳釀期中第9個月時的無花果酒酒體穩(wěn)定性優(yōu)于未陳釀的酒樣。

本實驗比較了不同陳釀時間對無花果酒品質(zhì)的影響，揭示了陳釀期品質(zhì)變化的規(guī)律，與未陳釀相比，陳釀后的無花果酒整體的口感和風(fēng)味有了提升，酒體也趨于穩(wěn)定，為無花果酒的工業(yè)化提供了一定的理論支持。