沈 棚，薛紅瑋

（1.上海康諾執(zhí)信食品有限公司，上海 201703；2.上海營家生物科技有限公司，上海 201703）

黃酒是中國傳統(tǒng)釀造酒，其歷史可以追溯到5 000多年前，其與啤酒、葡萄酒并稱是世界三大古酒[1]。黃酒通常是以谷物為原料、經(jīng)過浸泡、蒸煮、加曲、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、陳釀等復(fù)雜工序釀制而成[2]。由于其獨特的原料和復(fù)雜的釀造工藝賦予了黃酒甜、苦、鮮、澀、酸的口感和醇香、果香、曲香、焦糖香等豐富的風味[3]。黃酒的風味是評價其品質(zhì)的重要指標之一，黃酒中的揮發(fā)性風味物質(zhì)對其整體風味有著重要貢獻，而不同陳釀年份的黃酒風味成分也有所不同。而黃酒的特點就在于隨著陳釀時間的延長，其風味會愈加豐富、協(xié)調(diào)，其香氣也會更加濃郁、醇和[4]。對于同一種黃酒樣品而言，不同陳釀時間使得黃酒中各香氣物質(zhì)含量也會有所不同。

黃酒由于其特殊的發(fā)酵工藝保留了絕大部分對人體有益的營養(yǎng)成分，并且在其發(fā)酵過程中也會產(chǎn)生部分容易被人體吸收利用的功能性成分，如氨基酸、低聚糖、活性肽、酚類等[5-7]，因此黃酒被稱之為“液體蛋糕”[8]。其中，氨基酸是黃酒中較為重要的一類營養(yǎng)素，主要來源于其獨特的原料與微生物的代謝作用，對評價黃酒的品質(zhì)至關(guān)重要[9]。氨基酸具有多種味感，可以協(xié)調(diào)黃酒中的醇類、酯類、酚類等物質(zhì)，賦予了黃酒豐富的味覺層次[10]。目前，有關(guān)氨基酸的測定方法主要有比色法、毛細管電泳法以及紙層析法等，但是這些方法存在操作繁瑣、定量不準確等問題，而全自動氨基酸分析儀不僅準確、操作簡單，還具有良好的重現(xiàn)性[11]。高云超等[12-13]采用全自動氨基酸分析儀，分析測定氨基酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酒中含有十分豐富的氨基酸。黃酒的香氣是由酒中各種揮發(fā)性風味物質(zhì)所提供的，而其口味又很大程度上受氨基酸的影響[14]。苗雨田等[13]則建立采用全自動氨基酸分析儀測定黃酒中游離氨基酸的含量的方法，測定不同年份的黃酒中游離氨基酸含量，并發(fā)現(xiàn)不同酒齡的黃酒中氨基酸的總含量不同，各氨基酸含量隨年份的不同也會發(fā)生變化。本研究將通過頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法以及全自動氨基酸分析儀對不同陳釀年份黃酒中的揮發(fā)性風味物質(zhì)、氨基酸含量進行測定，以期對不同陳釀年份中黃酒風味與營養(yǎng)研究提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紹興黃酒樣品：2008、2010、2012、2014、2018、2019年份的黃酒，分別為14年陳、12年陳、10年陳、8年陳、4年陳、3年陳，均采用相同工藝制作，源自農(nóng)家自釀。

氨基酸混合標準液（B型）：日本和光純藥株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）裝置配SPME手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、8890-5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）毛細管色譜柱：美國Agilent科技有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

前處理條件：取5 mL黃酒樣品于頂空瓶中，放入轉(zhuǎn)子并蓋上蓋子，置于50 ℃固相萃取臺上，并使用萃取頭進行吸附40 min，250 ℃解吸10 min，用于GC-MS測定。

色譜條件：柱溫程序為起始溫度40 ℃，以10 ℃/min升溫至50 ℃，保持3 min，以3 ℃/min程序升溫至80 ℃，保持3 min，以6 ℃/min程序升溫至240 ℃，保持3 min；載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.999%），流速1 mL/min，不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；采用全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍30～550 amu。

定性定量分析：采用美國國家標準技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)合標準物質(zhì)進行定性分析，采用峰面積歸一化法進行定量分析。

1.3.2 游離氨基酸含量測定

將氨基酸混合標準液（B型）用0.02 mol/L鹽酸配制成0.5×10-3mol/L的標準溶液。取0.5 mL黃酒樣品稀釋20倍，充分混勻后，過0.22 μL水膜后通過全自動氨基酸分析儀待測。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

供試樣品進行3次重復(fù)，分析結(jié)果使用Microsoft Office Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，同時采用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳釀年份對黃酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響

固相微萃取得到的揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS分析，得到的總離子流色譜圖見圖1，隨后通過計算保留指數(shù)、檢索NIST 11L譜庫以及人工解析質(zhì)譜圖進行定性，匹配度＞80的物質(zhì)共有28種，結(jié)果見表1。

圖1 不同陳釀年份黃酒酒樣揮發(fā)性風味物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of volatile flavor substances in Huangjiu samples of different aging years analysis by GC-MS

表1 不同陳釀年份黃酒酒樣中揮發(fā)性成分及相對含量Table 1 Volatile components and relative contents in Huangjiu samples of different aging years

如表1所示，6種不同年份酒中共檢測到酯類物質(zhì)13種、醇類物質(zhì)4種、醛類物質(zhì)5種、酮類物質(zhì)2種、其他物質(zhì)4種。被檢測到的酯類物質(zhì)有苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、γ-壬內(nèi)酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、2-羥基苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、煙酸乙酯、2-呋喃甲酸乙酯、苯丙酸乙酯，酯類是黃酒的主要風味物質(zhì)之一[15]，主要呈特殊的花香或水果香氣[16]。醇類物質(zhì)有苯乙醇、辛醇、2-甲基-1-丁醇、4-羥基苯乙醇，黃酒中的醇類物質(zhì)不僅是呈味物質(zhì)，更是呈香物質(zhì)，可以起到豐富黃酒口感和助香的作用。醛類物質(zhì)有糠醛、苯甲醛、癸醛、異戊醛、α-亞乙基-苯乙醛；酮類物質(zhì)有苯乙酮、香葉基丙酮；其他物質(zhì)有棕櫚酸、2,4-二叔丁基苯酚、2-氟丙烯、檸檬烯等。并且，由表1可以看出，隨著儲存年份增加后，會有新的物質(zhì)產(chǎn)生，這是由于黃酒中含有多種有機酸，儲存過程中，醇類物質(zhì)就會與有機酸發(fā)生酯化反應(yīng)，由于新生成的這種酯類物質(zhì)都具有各自的特殊香氣，所以經(jīng)一定時間儲存的酒大都變得格外香醇。

不同陳釀年份黃酒酒樣中揮發(fā)性風味物質(zhì)熱圖分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著年份的增加，黃酒中的乙醇以及少量高級醇在陳釀過程中與酒中的有機酸發(fā)生酯化反應(yīng)，促使酯類物質(zhì)的含量也不斷增加，從而使得黃酒更加具有濃郁的香氣。其中，乙酯類為黃酒中最主要的酯類物質(zhì)，本研究中所檢測出的乙酯類物質(zhì)有苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、2-羥基苯甲酸乙酯等，對酒體香氣和品質(zhì)起著決定性作用[17]。

圖2 不同陳釀年份黃酒酒樣中揮發(fā)性風味物質(zhì)熱圖分析Fig.2 Heat map analysis of volatile flavor substances in Huangjiu samples of different aging years

醇類物質(zhì)隨著年份的增加，整體呈下降趨勢，其主要原因同樣是由于醇類物質(zhì)與酸類發(fā)生酯化反應(yīng)[18]。本實驗中主要檢測出的醇類物質(zhì)主要為苯乙醇，苯乙醇是黃酒中的主要醇類物質(zhì)，呈玫瑰花香，具有清甜蜜樣的香氣，與醛、酯類組分融合可以形成協(xié)調(diào)而又細膩的黃酒香氣，給人以柔和、優(yōu)雅、愉悅的感覺[19]。

黃酒中還存在少量醛類物質(zhì)，醛類物質(zhì)隨著年份的增加，整體呈上升趨勢，這與江偉等[20-21]研究結(jié)果相似。其中苯甲醛為黃酒中的主要醛類物質(zhì)，具有一種令人感到愉悅的杏仁氣味。另外，本實驗中檢出的酸類、萜類物質(zhì)、酚類化合物以及酮類化合物種類雖然較少，但其同樣是黃酒揮發(fā)性風味物質(zhì)的重要組成成分，可以決定黃酒的風格特征和品質(zhì)差異。

2.2 陳釀年份對黃酒中氨基酸的影響

黃酒中氨基酸主要來自于原料及微生物的代謝作用，氨基酸賦予黃酒較高的營養(yǎng)價值，并且黃酒中很多味道來自游離氨基酸[22-24]。根據(jù)ZHAO C等[25-26]的方法可將呈味氨基酸分為鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸以及咸味氨基酸，其中鮮味氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸；甜味氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；苦味氨基酸包括組氨酸、賴氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸；咸味氨基酸包括半胱氨酸、甲硫氨酸。該研究從6種不同年份的黃酒中共檢測出7種必需氨基酸，分別為蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸。不同陳釀年份對黃酒中游離氨基酸含量的影響見圖3。

由圖3可知，6種不同年份的黃酒中共檢出16種游離氨基酸，包括7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸，其氨基酸總含量為2 802.62～3 984.85 mg/L。由圖3（a）可知，不同年份黃酒中各氨基酸含量不盡相同，14年陳黃酒樣品中丙氨酸與甘氨酸含量較高；12年陳黃酒樣品中丙氨酸、亮氨酸含量較高；10年陳黃酒樣品中丙氨酸、甘氨酸含量較高；8年陳黃酒樣品中丙氨酸、精氨酸含量較高；4年陳黃酒樣品中丙氨酸、亮氨酸含量較高；3年陳黃酒樣品中丙氨酸、亮氨酸含量較高。由此可以看出，丙氨酸為黃酒中主要游離氨基酸。必需氨基酸中，苯丙氨酸、亮氨酸的含量最高。3年陳、4年陳、8年陳黃酒中苯丙氨酸的含量高于亮氨酸，亮氨酸含量于2012年后急速增長，此時亮氨酸的含量高于苯丙氨酸，后又急速下降，苯丙氨酸的含量再次高于亮氨酸。

圖3 不同陳釀年份對黃酒酒樣中氨基酸含量的影響Fig.3 Effect of different aging years on the amino acid contents in Huangjiu samples

由圖3（b）可知，6個樣品中的非必需氨基酸在陳釀3～12年間整體呈上升趨勢，其中精氨酸含量呈無規(guī)律變化。由此可發(fā)現(xiàn)隨著陳釀時間的增長，在一定時間范圍內(nèi)，游離氨基酸的含量呈上升趨勢，一旦時間過長，游離氨基酸的含量也會隨之下降。且無論在哪個年份中，黃酒中的甜味氨基酸和苦味氨基酸占比較大，而咸味氨基酸占比很小。

由圖3（c）可知，非必需氨基酸含量遠高于必需氨基酸含量，且氨基酸總量隨著陳釀年份的增加整體呈上升趨勢，于2010年后急速下降；并且必需氨基酸含量占氨基酸總含量的35%左右，李華等[28]通過采用氨基酸自動分析儀對黃酒糟的氨基酸組成進行研究發(fā)現(xiàn)，黃酒糟的必需氨基酸含量為111.7 g/kg，占氨基酸總量的36.60%，其結(jié)果與本實驗結(jié)果相似；而田翔等[9]則發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃酒中必需氨基酸占總游離氨基酸含量的38.68%、51.07%、46.13%和48.39%。其原因可能是由于黃酒的產(chǎn)地、釀造原料以及發(fā)酵過程的不同或釀造過程中蛋白質(zhì)分解差異有關(guān)。

3 結(jié)論

該文研究了不同陳釀年份江浙黃酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)和氨基酸的變化。通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對不同儲存年份黃酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析，共鑒定出28種揮發(fā)性風味成分，分別為酯類13種、醇類4種、醛類5種、酮類2種、其他物質(zhì)4種，主要揮發(fā)性風味化合物由苯甲醛、苯乙醇、丁二酸二乙酯、2-甲基-1-丁醇、癸醛等；其中，醇類物質(zhì)隨著年份的增加而逐漸減少，酯類化合物隨著年份的增加而增加。通過全自動氨基酸分析儀檢測了6個不同陳釀年份黃酒樣品中16種游離氨基酸，其氨基酸總含量為2 802.62～3 984.85 mg/L，其中包括7種必需氨基酸以及9種非必需氨基酸，并且必需氨基酸含量占氨基酸總含量的35%左右。通過實驗發(fā)現(xiàn)，3～12年陳釀的黃酒中，隨著陳釀年份的增長，游離氨基酸含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，而12年陳釀后，游離氨基酸含量急速下降。