楊 磊，許 偉，顏子怡，鄭 清，帥晨宇，邵 榮，吳夢霖，施曉龍

（鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051）

低聚木糖作為腸道益生菌的“優(yōu)質(zhì)糧食”，在選擇性刺激腸道益生菌增殖的同時，特異性抑制腸道致病菌的生長，調(diào)整腸道微環(huán)境、增強宿主免疫力和健康水平，有助于國民大健康的實現(xiàn)[1-4]，因而低聚木糖高效制備對于大健康行業(yè)和農(nóng)林廢棄資源的高附加值利用至關(guān)重要。近年來，低聚木糖系列產(chǎn)品的開發(fā)和推廣在飼料添加劑、食品添加劑、化妝品和醫(yī)療保健品等領域已初具規(guī)模。低聚木糖作為木聚糖高值化加工的主流產(chǎn)品，可通過化學、物理和生物酶法實現(xiàn)低聚木糖的高效制備。基于阿拉伯木聚糖的分子結(jié)構(gòu)解析，其水解酶系主要涵括木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等，其中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶作為關(guān)鍵水解酶極為重要[5-7]。相比于同質(zhì)木聚糖而言，阿拉伯木聚糖類異質(zhì)雜多糖因受支鏈結(jié)構(gòu)空間位阻的影響，木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶間協(xié)同作用對于阿拉伯低聚木糖的高效制備極為重要[8-9]。YANG L等[10]研究表明，半乳甘露聚糖主鏈上的半乳糖支鏈取代度與甘露聚糖酶水解效率呈現(xiàn)負相關(guān)性，半乳糖苷酶可有效提升甘露聚糖酶酶水解效率。在阿拉伯木聚糖定向水解過程中，利用阿拉伯糖苷酶有選擇去除阿拉伯木聚糖的支鏈結(jié)構(gòu)，對于木聚糖酶水解效率和阿拉伯低聚木糖得率的提高意義深遠[10-11]。

目前，生物酶的制備多采用產(chǎn)酶菌株篩選、底物特異性誘導和工程菌的可控改造等技術(shù)加以實現(xiàn)，其中以基因工程菌的可控改造技術(shù)研究最為廣泛[12-14]。基因工程菌的構(gòu)建多以大腸桿菌（Escherichia coli）和畢赤酵母（Pichia pastoris）為目的基因載體，但大腸桿菌或畢赤酵母次級代謝產(chǎn)物的生物安全性和基因工程菌的傳代穩(wěn)定性，是限制其在食品工業(yè)大規(guī)模應用的限制因素[15-18]。里氏木霉（Trichoderma reesei）作為合成木聚糖水解酶系的主要菌株，利用底物誘導可實現(xiàn)木聚糖水解酶的高效制備，因而，誘導底物的篩選成為實現(xiàn)阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶協(xié)同制備的關(guān)鍵[19-22]。車前草作為中草藥資源在我國應用歷史悠遠，車前子殼為大粒車前草或平車前草的成熟種皮，細胞壁包含10%～30%親水性阿拉伯木聚糖，具有殺菌消炎、調(diào)節(jié)免疫和改善便秘等生理活性。研究表明，車前子殼中包含62.5%的阿拉伯木聚糖，其化學結(jié)構(gòu)為β-1,4-糖苷鍵形成的木聚糖主鏈，在其主鏈上隨機進行阿拉伯糖（arabinose，Ara）或木糖（xylopyranose，Xyl）取代，阿拉伯糖與木糖的摩爾比為0.41∶1.00[11]。因此，本研究以車前子殼作為誘導底物，利用單因素試驗和響應面試驗系統(tǒng)優(yōu)化里氏木霉（Trichoderma reesei）液態(tài)發(fā)酵條件，以期實現(xiàn)阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶的協(xié)同制備，為阿拉伯木聚糖資源的高效生物煉制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和材料

里氏木霉（Trichoderma reesei）NL03：南京林業(yè)大學生物化工研究所；車前子殼：廣州福芯堂生物科技有限公司，機械粉碎后，過100目篩，其中阿拉伯木聚糖含量為（62.58±0.29）%，水分含量為（7.37±0.27）%。

1.1.2 化學試劑

玉米芯木聚糖（堿法提取木聚糖，含水量（10.47±0.19）%）：江蘇康維生物科技有限公司；微晶纖維素（平均聚合度為117，粒度50 μm，含水量（5.47±0.21）%）：美國Sigma公司；硫酸銨、尿素、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、無水氯化鈣、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、偏重亞硫酸鈉、檸檬酸、木糖、葡萄糖、苯酚、對硝基苯酚、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、大豆蛋白胨：上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷（p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranosid，pNPA）：上海源葉生物科技有限公司。試驗所用化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：車前子殼10.00 g、葡萄糖1.00 g、磷酸二氫鉀20.00 g、尿素3.00 g、無水硫酸鎂1.50 g、硫酸銨14.00 g、氯化鈣4.00 g、FeSO4·7H2O 5.00 mg、MnSO4·7H2O 1.60 mg、ZnSO4·7H2O 1.40 mg、CoCl22.00 mg，充分溶解于蒸餾水后，加入1 mol/L檸檬酸緩沖液50 mL，蒸餾水定容至1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

TU-1950紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SHA-A恒溫振蕩水浴鍋：上海精密儀器儀表有限公司；Direct-QTM5超純水系統(tǒng)：美國密理博公司；AEL-200電子分析天平：日本島津公司；Allegra X-64R臺式高速冷凍離心機：美國貝克曼公司；THZ-300C恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)酶發(fā)酵液的制備

在產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎上，將里氏木霉孢子懸浮液（孢子數(shù)量為2.0×107CFU/mL）按10%（V/V）的接種量加入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于170 r/min搖床中培養(yǎng)，產(chǎn)酶溫度第1天設定為30 ℃，第2天將溫度調(diào)整至28 ℃，培養(yǎng)時間為5.0 d，得到產(chǎn)酶發(fā)酵液。

1.3.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素試驗

采用單因素試驗依次探討誘導物種類（車前子殼、玉米芯木聚糖、微晶纖維素、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖），初始pH值（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0），培養(yǎng)時間（1.0 d、2.0 d、3.0 d、4.0 d、5.0 d），底物質(zhì)量濃度（以車前子殼絕干質(zhì)量計）（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L）和碳氮比（0.7∶1.0、1.0∶1.0、1.3∶1.0、1.6∶1.0、1.9∶1.0）對木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶產(chǎn)酶效果的影響。每個單因素條件設置3個重復，將產(chǎn)酶發(fā)酵液于-4 ℃條件下5 000 r/min離心30 min，收集上清液測定木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶酶活。

1.3.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，選取碳氮比（A）、培養(yǎng)時間（B）和底物質(zhì)量濃度（C）三個主要影響因素，以木聚糖酶活力（Y1）和阿拉伯糖苷酶活力（Y2）為響應值，根據(jù)Design-Expert 8.0.7軟件中Box-Behnken試驗設計原理進行3因素3水平響應面試驗，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1，共設計17個組合，包括5個中心試驗組和12個非中心試驗組。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 分析方法

（1）木聚糖酶活力的測定

0.9mL的1.0%樺木木聚糖底物溶液，50 ℃預熱5 min，加入0.1 mL適當稀釋的產(chǎn)酶上清液，于50 ℃條件下反應30 min，立即加入3.0 mL DNS試劑終止反應，隨后沸水浴中處理5 min，冷卻后定容至25 mL，充分搖勻，于波長550 nm處測定反應混合物的吸光度值，并根據(jù)吸光度值與還原糖的相關(guān)關(guān)系，計算反應生成的還原糖含量。

木聚糖酶酶活定義：在上述反應條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol木糖所需木聚糖酶的酶量為一個酶活單位（IU/mL）[23]。

（2）阿拉伯糖苷酶活力的測定

0.1mL適當稀釋的產(chǎn)酶上清液和0.9 mL 1 mmol/L pNPA溶液于50 ℃保溫10 min，立即加入2.0 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應，加入10 mL蒸餾水，充分搖勻，于波長400 nm處測定反應混合物的吸光度值，并依據(jù)吸光度值與對硝基苯酚的線性相關(guān)關(guān)系，計算反應生成的對硝基苯酚的含量。

阿拉伯糖苷酶酶活定義：在上述反應條件下，每分鐘水解pNPA釋放1 μmol對硝基苯酚所需阿拉伯糖苷酶的酶量為一個酶活單位（IU/mL）[24]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均重復測定3次，采用Design-Expert 8.0.7軟件分析響應面試驗。采用SPSS19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表示為“平均值±標準差”（X±S）。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基誘導碳源的確定

以里氏木霉為產(chǎn)酶菌種，分別研究以玉米芯木聚糖、微晶纖維素、車前子殼、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖（添加量為10 g/L）為誘導碳源，對木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶合成效能的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，以微晶纖維素（水不溶性）、半乳甘露聚糖（水溶性）和葡甘露聚糖（水溶性）為誘導底物時，里氏木霉分泌阿拉伯糖苷酶的能力較弱，僅分別為（0.11±0.01）IU/mL、（0.11±0.02）IU/mL和（0.10±0.01）IU/mL。里氏木霉所分泌的阿拉伯糖苷酶為誘導酶，只有在以包含阿拉伯糖支鏈的木聚糖存在時，才可誘導阿拉伯糖苷酶的合成[25]。以玉米芯木聚糖（水不溶性）為產(chǎn)酶誘導底物時，產(chǎn)酶發(fā)酵液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力分別為（3.18±0.23）IU/mL和（0.48±0.03）IU/mL。張曉娜等[26]研究表明，在玉米芯木聚糖主鏈上有不同程度的阿拉伯糖殘基取代，經(jīng)堿液提取所得木聚糖包含少量的阿拉伯糖支鏈，這也是玉米芯木聚糖可以誘導里氏木霉分泌阿拉伯糖苷酶的原因。以車前子殼（部分水溶性）為誘導底物時，發(fā)酵液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力最高，分別為（4.47±0.11）IU/mL和（1.47±0.06）IU/mL。因此，選擇車前子殼作為最適誘導碳源。

圖1 不同碳源對木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the xylanase and arabinosidase activities

2.1.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值的確定

培養(yǎng)基初始pH值可通過改變微生物細胞膜表面電荷和膜的通透性阻礙微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響菌體生物量和產(chǎn)酶效力[27]。此外，發(fā)酵液pH值如超出生物酶的最適pH范圍，將會導致酶蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和酶活力降低。不同產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值對里氏木霉誘導木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶合成的影響見圖2。由圖2可知，當初始pH值為5.0時，里氏木霉培養(yǎng)液中木聚糖酶活力和阿拉伯糖苷酶活力均達到最高值，分別為（4.4±0.11）IU/mL和（1.47±0.06）IU/mL。當發(fā)酵液初始pH值處于強酸性條件下（pH=1.0），發(fā)酵液中木聚糖酶活力降低較多，僅為（0.96±0.05）IU/mL，而培養(yǎng)基初始pH值在5.0～9.0條件下，木聚糖酶活力分別為（4.47±0.11）IU/mL、（4.18±0.05）IU/mL和（3.31±0.11）IU/mL。結(jié)果表明，里氏木霉源木聚糖酶在弱酸和弱堿性環(huán)境均體現(xiàn)良好的穩(wěn)定性。當產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為5.0和7.0時，產(chǎn)酶液中阿拉伯糖苷酶活力均為（1.47±0.06）IU/mL，阿拉伯糖苷酶活力均高于其他初始pH值組。因此，最適培養(yǎng)基初始pH值為5.0。

圖2 不同初始pH值對木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影響Fig.2 Effect of different initial pH on the xylanase and arabinosidase activities

2.1.3 培養(yǎng)時間的確定

產(chǎn)酶發(fā)酵的初始階段主要為里氏木霉利用培養(yǎng)基中葡萄糖完成自身生物量的增長，隨著葡萄糖消耗殆盡，里氏木霉為滿足自身生長的需要，逐漸分泌車前子殼多糖相關(guān)水解酶，實現(xiàn)車前子殼多糖的降解，為里氏木霉提供可直接代謝的碳源物質(zhì)。培養(yǎng)時間在2～4 d內(nèi)，里氏木霉分泌的車前子殼多糖水解酶會逐漸積累，但是培養(yǎng)時間過長導致培養(yǎng)環(huán)境的惡化，會導致酶蛋白的失活，最終呈現(xiàn)酶活力下降的現(xiàn)象。里氏木霉以10 g/L車前子殼為誘導底物，培養(yǎng)基初始pH值為5.0下，探究培養(yǎng)時間對木聚糖酶和阿拉伯糖酶合成情況的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中木聚糖酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當培養(yǎng)時間為4～5 d時，木聚糖酶活力由（4.47±0.11）IU/mL降低至（3.70±0.08）IU/mL；而阿拉伯糖苷酶活力由（1.47±0.06）IU/mL稍微提升至（1.50±0.05）IU/mL，增加幅度較小。因此，最適培養(yǎng)時間為4 d。

圖3 不同的培養(yǎng)時間對木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影響Fig.3 Effect of different culture time on the xylanase and arabinosidase activities

2.1.4 產(chǎn)酶培養(yǎng)基中底物濃度的確定

車前子殼經(jīng)水浸泡展現(xiàn)出較大的黏度，因而車前子殼濃度對于里氏木酶發(fā)酵產(chǎn)酶的影響是不可忽略的因素。車前子殼濃度較高，導致整個產(chǎn)酶體系黏度較大，影響傳質(zhì)效率和溶解氧指數(shù)，從而限制菌體增殖和生物酶合成。車前子殼質(zhì)量濃度對木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶合成的影響見圖4。由圖4可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，產(chǎn)酶上清液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力大體呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。當車前子殼質(zhì)量濃度由10 g/L增加至25 g/L時，木聚糖酶活力由（4.47±0.11）IU/mL增加至（5.16±0.38）IU/mL，木聚糖酶活力的增加幅度較小。當車前子殼質(zhì)量濃度為10 g/L、15 g/L和20 g/L時，阿拉伯糖苷酶活力分別為（1.47±0.06）IU/mL、（3.67±0.08）IU/mL和（5.16±0.38）IU/mL。當車前子殼質(zhì)量濃度為25 g/L時，產(chǎn)酶發(fā)酵液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力分別為（5.16±0.38）IU/mL和（5.55±0.22）IU/mL，相較于車前子殼質(zhì)量濃度為20 g/L無明顯提升。因此，最適車前子殼質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖4 不同底物質(zhì)量濃度對木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影響Fig.4 Effect of different substrate mass concentration on the xylanase and arabinosidase activities

2.1.5 產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳氮比的優(yōu)化

以車前子殼為誘導底物，硫酸銨和尿素按照初始培養(yǎng)基中的比例組成混合碳源，并將碳氮比分別設定為0.7∶1.0、1.0∶1.0、1.3∶1.0、1.6∶1.0和1.9∶1.0，配制成產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在170 r/min條件下培養(yǎng)4 d，研究碳氮比對里氏木霉分泌木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶能力的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著碳氮比的增加，培養(yǎng)基中氮源物質(zhì)的質(zhì)量濃度由46.63 g/L降低至17.17 g/L，產(chǎn)酶液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力逐漸增加。當碳氮比為0.7∶1.0時，產(chǎn)酶培養(yǎng)基滅菌后呈現(xiàn)固體凝膠狀態(tài)，里氏木霉無法在該培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)酶，因而未能在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中檢測到酶活。當碳氮比由1.0∶1.0增加至1.6∶1.0時，產(chǎn)酶液中木聚糖酶活力和阿拉伯糖苷酶活力分別由（4.93±0.14）IU/mL和（4.14±0.07）IU/mL增加至（10.59±0.33）IU/mL和（8.99±0.05）IU/mL。碳氮比進一步由1.6∶1.0增加至1.9∶1.0，產(chǎn)酶液中木聚糖酶活力和阿拉伯糖苷酶活力增長幅度較少。結(jié)果表明，碳氮比較低時，里氏木霉因氮源濃度過高導致生物量激增和碳源消耗過快，不利于生物酶的合成。因此，最適碳氮比為1.6∶1.0。

圖5 不同的碳氮比對木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影響Fig.5 Effect of different carbon and nitrogen ratio on the xylanase and arabinosidase activities

2.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化的響應面試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，分別選取碳氮比（A）、培養(yǎng)時間（B）和底物質(zhì)量濃度（C）三個自變量，以木聚糖酶活力（Y1）和阿拉伯糖苷酶活力（Y2）為響應值，應用Design Expert 8.0.7對產(chǎn)酶條件進行響應面試驗，Box-Behnken試驗設計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表3可知，一次項A對木聚糖酶活力的影響顯著（P＜0.05），二次項A2、B2、C2對木聚糖酶活力的影響極顯著（P＜0.01），其他項均不顯著（P＞0.05）。二次項A2、B2對阿拉伯糖苷酶活力的影響顯著（P＜0.05），二次項C2對阿拉伯糖苷酶活力的影響極顯著（P＜0.01），其他項均不顯著（P＞0.05）。另外，對表2結(jié)果進行二元多項式回歸擬合分析，得到多元擬合方程，Y1=11.41+0.30A-0.020B+0.22C+0.15AB+0.17AC+0.19BC-2.90A2-2.86B2-3.16C2，模型P值＜0.000 1，該擬合模型達到極顯著水平（P＜0.01），決定系數(shù)R2=0.993 8，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.985 8，表明擬合方程與測定值擬合度較好，模型設計合理；由F值可知，各因素對木聚糖酶活力的影響順序為：碳氮比（A）＞底物質(zhì)量濃度（C）＞培養(yǎng)時間（B）。Y2=10.79+0.40A+0.11B+0.49C+0.19AB+0.61AC+0.40BC-1.06A2-1.10B2-1.70C2，模型P值為0.014 1，該擬合模型達到顯著水平（P＜0.05），決定系數(shù)R2=0.884 3，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.735 5，表明模型擬合度良好。由F值可知，各因素對阿拉伯糖苷酶活力的影響順序為：底物質(zhì)量濃度（C）＞碳氮比（A）＞培養(yǎng)時間（B）。

表2 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

經(jīng)模型預測，當碳氮比（A）為1.62∶1.0、培養(yǎng)時間（B）為4.0 d和底物質(zhì)量濃度（C）為20.40 g/L時，木聚糖酶活力和阿拉伯糖苷酶活力預測值分別為11.40 IU/mL、10.87 IU/mL。

為了便于實際操作，將最優(yōu)產(chǎn)酶條件修正為：初始pH值5.0、底物質(zhì)量濃度20 g/L、培養(yǎng)時間4.0 d、碳氮比1.6∶1.0。在此最優(yōu)產(chǎn)酶條件下進行3次平行驗證試驗，結(jié)果顯示，木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶活力平均實際值分別為（11.42±0.15）IU/mL、（10.83±0.08）IU/mL。上述結(jié)果與模型預測值基本一致，因此證實該模型可精準預測里氏木霉利用車前子殼的實際木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的合成情況。

3 結(jié)論

本研究里氏木霉以車前子殼為誘導碳源，以單因素試驗和響應面試驗對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，以期確定木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的最佳誘導條件。確定最佳產(chǎn)酶條件：以車前子殼為碳源，初始pH 5.0、培養(yǎng)時間4.0 d、底物質(zhì)量濃度20 g/L、碳氮比1.6∶1.0，在此優(yōu)化條件下，木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的活力可達最大值，分別為（11.42±0.15）IU/mL和（10.83±0.08）IU/mL，是優(yōu)化前的2.55倍和7.37倍。該研究可為車前子源阿拉伯低聚木糖的定向酶水解制備奠定酶學基礎。