楊睿鵬, 安 寧, 單樹花, 史江穎, 李漢卿, 賀水玲, 李卓玉
(山西大學生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室, 太原 030006)
乳腺癌(breast cancer)是威脅女性健康最常見的癌癥之一。據統(tǒng)計,在全球范圍內,乳腺癌患者占各類女性癌癥的30%,由乳腺癌引起的死亡率約占女性死因的15%[1]。臨床上,根據激素受體雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progestogen receptor, PR)和人表皮生長因子(human epidermal growth factor receptor-2,HER2),乳腺癌可分為luminal ER陽性和PR陽性,又能細分為luminal A型、luminal B型、HER2陽性型和三陰性型[2]。乳腺癌靶向治療憑借其特異性高、靶向性強的特點,已經被廣泛認為是一種新興的治療策略,尤其是針對HER2陽性和三陰性乳腺癌[3-4]。近年來,由于其高效、低毒和經濟等特點,從植物中挖掘抗腫瘤天然藥物越來越受到研究者的關注。目前,已經被成功開發(fā)并應用于臨床的一線藥物有紫杉醇、長春新堿和依立替康等。已有研究表明,從植物中提取多酚類物質具有多種生理活性功能,例如:張等人[5]報道了從茶中提取的多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等多種活性;葡萄籽多酚也被報道具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎殺菌、保護心腦血管等作用[6]。一致的是,在不同的活性植物源多酚中都發(fā)現了阿魏酸是其中最常見的活性化合物之一[7]。
阿魏酸(ferulic acid, FA,C10H10O4)是普遍存在于植物中的一種酚類化合物,分子量194.184。課題組前期研究發(fā)現,從谷加工成米過程中,脫下的副產品谷糠中提取的多酚類物質具有顯著的抗炎和抗腫瘤活性[8],且谷糠多酚中的活性物質主要是阿魏酸[9]。進一步的研究證實,阿魏酸具有抑制結腸癌細胞增殖的活性。在本研究中,繼續(xù)探討了阿魏酸抑制乳腺癌細胞的生理活性。選用人乳腺癌細胞系MCF-7和小鼠乳腺癌細胞系4T1,通過Pull-down實驗確定了阿魏酸在腫瘤細胞中的潛在靶點PYCR1, 酶活力檢測結果進一步證實,阿魏酸通過結合PYCR1引起其酶活性降低,從而抑制乳腺癌細胞的增殖。通過分析人類癌癥數據庫(TCGA)證實,在乳腺癌患者中,PYCR1異常表達并伴有更差的不良預后。這些提示我們,阿魏酸可作為靶向PYCR1治療乳腺癌的天然候選藥物。
阿魏酸;改良型RPMI-1640 培養(yǎng)基;無支原體胎牛血清;噻唑藍(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO);銀染試劑盒;胰蛋白酶;青鏈霉素(100X);福林酚試劑;結晶紫。
本研究選用了人源乳腺癌細胞系MCF-7和小鼠源乳腺癌細胞系4T1作為研究對象,細胞株購自中科院細胞庫。MCF-7用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基,4T1細胞用含10% FBS的1640完全培養(yǎng)基。所有細胞在5% CO2,37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。當細胞生長達到90%時進行細胞傳代,傳代過程中使用胰酶進行消化,用含胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的培養(yǎng)基中和消化反應。
取對數期細胞制備成懸液,計數并使終濃度為6 000個/100 μL,每個孔內加100 μL細胞懸液置于細胞培養(yǎng)箱過夜,待細胞貼壁,分別用0.15、0.3、0.6 mg/mL阿魏酸處理細胞48 h。處理結束,換用100 μL新培養(yǎng)液,再加入20 μL MTT(5 mg/mL),37 ℃避光4 h;孵育結束,吸出孔內的液體,加入150 μL DMSO,震蕩10 min,測量570 nm處的吸光度并計算細胞存活率;
取生長狀態(tài)良好的細胞,消化成單細胞懸液并計數,以每孔5 000個細胞接種于24孔板中,使細胞均勻分布,37 ℃過夜培養(yǎng)。加入不同濃度的阿魏酸處理細胞。連續(xù)處理6 d,棄去上清,用冷PBS清洗3次,并加入300 μL 4℃預冷的甲醇固定細胞30 min。固定結束,吸除甲醇,加入0.1%的結晶紫溶液處理15 min,吸除多余溶液并烘干,在顯微鏡下拍照并記錄。
根據之前的報道,進行了阿魏酸與細胞總蛋白質結合的實驗并做了適當調整[10]。具體步驟如下:取2個1.5 mL干凈EP管。其中,一管加入2 mg阿魏酸,然后每管加入100 μL的乙醚,輕輕搖勻,揮發(fā)掉管中乙醚;收集對數期生長的乳腺癌細胞MCF-7和4T1,加入適量的細胞裂解液于冰上裂解30 min, 然后,在4 ℃,12 000 r/min條件下離心15 min,收集上清獲得蛋白質提取液;在上述EP管中分別加入等量的蛋白質提取液后封口,在4 ℃條件下使用垂直混合儀過夜,孵育結束后離心(4 ℃,12 000 r/min,15 min)棄上清,沉淀用PBS清洗2次,制備成蛋白質樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,使用快速銀染試劑盒并按照說明書進行銀染操作;觀察并標記差異條帶,割膠保存差異條帶并進行后續(xù)鑒定分析。
由上海中科新生命生物科技有限公司提供質譜鑒定服務。首先將凝膠進行還原和烷基化處理,即加入10 mmol/L二硫蘇糖醇還原蛋白質,再加入55 mmol/L碘乙酸銨烷基化,最后加入胰蛋白酶(質量比1∶50)在37 ℃ 條件下,酶解20 h。酶解產物經脫鹽后凍干,復溶于0.1%甲酸溶液中,使用液相色譜-串聯質譜技術(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry LC-MS/MS)(nanoLC-QE)進行質譜分析(上樣緩沖液A液為0.1%甲酸的水溶液, B液為0.1%甲酸的乙腈水溶液)。通過全掃描采集多肽碎片的質量電荷比圖譜,隨后將獲得的原始文件用Proteome Discoverer1.4軟件檢索在線蛋白質數據庫Uniprot,最后得到鑒定的蛋白質結果。搜庫參數為:Enzyme: Trypsin; Databaseuniprot_Homo_sapiens_ 194324_20210106;Fixed modifications: Carbamidomethyl (C); Dynamical modifications: Oxidation (M); Phospho (ST);Phospho (Y);GlyGly (K);Acetyl (K);Acetyl (Protein N-term); Max Missed Cleavages: 2; Filter by Peptide Confidence=High。
分別從pubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) 下載SDF格式的FA結構文件和Protein Data Bank(PDB, https://www.rcsb.org)數據庫下載PDB格式的PYCR1結構文件。使用AutoDock Vina軟件分別對FA和PYCR1進行去水、加氫和結構優(yōu)化處理,并保存為PDBQT文件。進一步采用AutoDock Vina軟件進行FA和PYCR1的分子對接,設置格點間隔值。設置Grid參數:center_x = 8.177,center_y = 44.722,center_z = 13.231,size_x = 92.15,size_y = 92.15,size_z = 82.45。運行程序模擬對接并保存對接結果。比較篩選結合能最低的結合構象,并保存為PDBQT文件。最后通過PyMOL軟件對結合構象進行卡通(cartoon)展示并生成圖片。
對PYCR1的基因表達分析采用在線分析工具GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)。選擇“SingleGene Analysis”,選擇Boxplot, 設定基因名 =PYCR1, Log2FC = 1,p-value = 0.01, Datasets = BRCA, 在線生成并導出PYCR1基因在乳腺癌患者和健康對照個體中差異表達的箱線圖。選擇Boxplot生成PYCR1在不同腫瘤分級中的差異表達的小提琴圖。生存分析使用在線工具Kaplan-Meier Plotter (http://kmplot.com/analysis/)。選擇“Breast cancer”,進入“KM Plotter”, 設定搜索條件Gene symbol=PYCR1,其余選項設置為默認,在線繪圖并導出生存分析結果圖。
PYCR1具有噻唑烷-4-羧酸脫氫酶活性,催化噻唑烷-4-羧酸的脫氫反應,同時將輔酶Ⅰ(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)轉化為還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)。酶活性檢測采用試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司),并按照廠家說明書操作。具體步驟如下,取對數期生長的細胞,消化成單細胞懸液,以每皿106個細胞,接種于35 mm培養(yǎng)皿,37 ℃過夜培養(yǎng),待細胞貼壁后加入不同濃度的阿魏酸處理24 h。處理結束后每皿加入1 mL酶提取液,超聲破碎后12 000g,4 ℃離心并收集上清。將每104個細胞,每min產生1nmol NADH定義為1個酶活力單位,通過測定450 nm下吸光值增加率來檢測酶的活性。
進行3 次以上獨立的重復實驗,數據由Origin 8.0 作圖,數據圖中用誤差棒表示標準差,SPSS17.0 對數據進行統(tǒng)計分析,單因素方差分析采用t檢驗,*P<0.05,**P<0.01 表示具有統(tǒng)計學意義。
為了確定阿魏酸對乳腺癌的影響,使用不同濃度的阿魏酸處理人乳腺癌細胞MCF和小鼠乳腺癌細胞4T1。Fig.1A和B 的MTT結果顯示,隨著阿魏酸的濃度增加,乳腺癌細胞的存活率降低,且阿魏酸抑制MCF-7細胞存活的活性更強。SPSS擬合結果顯示,阿魏酸對MCF-7的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)為0.529 mg/mL, 對4T1的IC50值為0.631 mg/mL(Table 1)。為了進一步確定阿魏酸對細胞增殖的影響,本文進行了克隆形成實驗,分別用不同濃度的阿魏酸處理4T1和MCF-7細胞。結果顯示,阿魏酸呈劑量依賴式抑制乳腺癌細胞的增殖。當FA濃度達到0.6 mg/mL時,細胞集落形成能力被明顯抑制(Fig.1C)。綜上所述,這些結果表明,阿魏酸在體外可以有效抑制乳腺癌細胞的增殖。
Fig.1 Detecting the inhibitory effects of ferulic acid on breast cancer cells (A, B) Human MCF-7 and mouse 4T1breast cancer cells (6 × 103 cells/well) were plated into 96 wells and the cells were exposed for increasing concentration of ferulic acid for 48 hours, respectively. (C)The colony-formation assay was used to test the inhibition of FA. Cells were treated with 0, 0.15, 0.3, 0.6 mg/mL FA for 6 days and the results showed that FA could decrease colonyformation of MCF-7 and 4T1.Data were presented as the means ± SD (n ≥ 5) and analyzed by ordinary one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparisons. P< 0.05 was considered to be significant
Table 1 IC50values of FA on MCF-7 and 4T1 cells lines
阿魏酸對MCF-7的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)為0.529 mg/mL, 對4T1的IC50值為0.631 mg/mL(Table 1)
由于小分子物質靶向腫瘤細胞的特點,為進一步通過尋找阿魏酸的作用靶點,揭示其抑制乳腺癌細胞增殖的分子機制。結果正如Fig.2A和Pull-down結果所述,通過阿魏酸與細胞總蛋白質提取液共孵育,對孵育后的結合物進行凝膠電泳SDS-PAGE和快速銀染。正如Fig.2B結果顯示,與對照組相比,阿魏酸與蛋白質共孵育后,在30~35 kD之間出現了明顯的差異條帶。隨后,通過LC-MS-MS(nanoLC-QE)檢測, 并將檢測結果與uniprot_Homo_sapiens_194324_20210106蛋白質數據庫進行比對分析,篩選到了吡咯啉-5-羧酸還原酶1(pyrroline-5-carboxylate reductase,PYCR1),該蛋白質的分子量為33.4 kD。進一步結果(Fig.2C)顯示,4T1細胞中用于定性PYCR1的肽段有15條,共檢測到128個氨基酸 (amino acid, AA),占PYCR1全部319個AA的40.13%;MCF-7細胞中用于定性PYCR1的肽段有6條,共檢測到69個AA,占總序列的21.63%(Fig.2D)。Fig.2C 和 D分別展示了4T1細胞和MCF-7細胞中PYCR1代表性肽段的二級質譜圖。Fig.2E為該分子的3D結構圖。
Fig.2 PYCR1 is one of the targets of FA in breast cancers (A)The pull-down assay was performed to find the target. Crystals of FA (2 mg) were dissolved with 100 μL diethyl ether in an EP tube, volatilized the diethyl ether to attach FA to the tube wall. FA was incubated with protein lysates overnight, then the mixture was centrifuged and collected, and the deposition was washed with PBS for three times. Then the mixture was separated on a 10% SDS-PAGE and stained with silver staining. The differential band was cut and analyzed using LC-MS/MS spectrometer by Shanghai Applied Protein Technology Co Ltd. (B)The representative images of silver staining gels. The markedly differential candidate protein was PYCR1.Two independent experiments were performed with consistent results.(C)Representative images of the secondary mass spectrometry of peptide fragments and the identified amino acid sequences in 4T1 cells. (D) Representative images of the secondary mass spectrometry of peptide fragments and the identified amino acid sequences in MCF-7 cells. (E)3D Structure diagram of the PYCR1 complex
為了解阿魏酸和PYCR1的結合方式,本文采用AutoDock Vina 軟件模擬阿魏酸和PYCR1的分子對接過程,結果正如Fig.3A所示,分子對接模擬完成,本文使用PyMOL對結果進行分析并可視化展示。結果顯示,PYCR1與阿魏酸分子存在直接相互作用。阿魏酸分子通過與PYCR1蛋白質上的246 位谷氨酸和 251精氨酸發(fā)生直接的相互作用。由于PYCR1的主要功能是催化脯氨酸的生物合成,同時可以將NAD轉化為NADH。因此,本文進一步通過檢測NADH的產生評估了阿魏酸對PYCR1酶活力的影響,結果正如Fig.3 B和C所示,阿魏酸對PYCR1酶活性的抑制效應存在濃度依賴性,且當阿魏酸濃度達到0.6 mg/mL 時,MCF-7和4T1細胞中PYCR1的催化活性分別降低69.73%和64.65%。以上結果說明,阿魏酸通過和PYCR1發(fā)生直接相互作用從而抑制其酶活性。
Fig.3 FA bindsPYCR1 to suppress its catalytic activity in breast cancer cells (A)Binding model of FA-PYCR1. The left panel is the global view of the entire PYCR1 structure. The right panel is the focused view of FA in the binding site (FA in green). (B,C)The PYCR1enzyme activity was detected using a PYCR1 kit. Data were presented as the means ± SD (n ≥ 5) and analyzed by ordinary one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparisons. P< 0.05 was considered to be significant
PYCR1作為催化脯氨酸生物合成的一種還原酶,同時參與維持細胞內氧化還原電位和線粒體完整性,已經被報道在多種腫瘤組織中高表達。為了確定PYCR1表達和乳腺癌的關系,本文進一步分析了人類腫瘤基因圖譜(TCGA)數據庫中PYCR1和乳腺癌的相關關系。Fig.4A納入1 085名乳腺癌患者和291名健康對照人群的PYCR1基因表達分析。結果顯示,與健康個體相比,乳腺癌患者體內PYCR1的表達量明顯升高。值得注意的是,PYCR1基因表達水平在乳腺癌發(fā)展的不同階段未見顯著性差異(Fig.4B)。同時,Fig.4C也表明,PYCR1高表達與乳腺癌患者的不良預后高度正相關。這些結果進一步說明,PYCR1可以作為乳腺癌治療的一個潛在靶標候選。
Fig.4 Over-expression of PYCR1 was observed in the human breast cancer in TCGA data set (A) PYCR1 protein expression in normal tissues and breast cancers. (B) PYCR1 expression in different histological grades of breast cancers. (C) The survival rate was analyzed and compared between patients with low (n = 2466) and high (n = 2463) levels of PYCR1 in breast cancer samples. Log-rank test, P< 0.0001
近年來,隨著醫(yī)學和分子生物學的發(fā)展,腫瘤的發(fā)生機制和發(fā)展過程逐漸被揭示,這促進了抗腫瘤靶點的尋找及相應的治療手段的快速發(fā)展。受到紫杉醇在抗癌研究中取得的重大成功的啟發(fā),越來越多研究者聚焦于從天然物質中獲得有效成分。托泊替康(topotecan)、多西他賽(docetaxel)、泰索帝(taxotere)等抗腫瘤藥物的相繼問世,使得肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌等發(fā)病率較高的腫瘤治療取得了良好的效果。針對乳腺癌的靶向治療,20世紀90年代,從紅豆杉中提取的紫杉醇通過誘導和促進微管蛋白的聚合和裝配,使微管處于動態(tài)平衡狀態(tài),從而抑制細胞的有絲分裂和腫瘤細胞增殖,已在臨床上成為治療乳腺癌、宮頸癌和卵巢癌的首選特效化療藥[11]。針對乳腺癌對激素的依賴性,研究發(fā)現一種非甾體類藥物他莫昔芬(Tamoxifen)可以經口服進入體內,并由肝代謝活化,形成一種ER的競爭性抑制劑,通過與雌激素競爭結合ER,阻止E2與ER的結合,干擾并阻斷E2依賴性的乳腺癌生長[12-13]。這些發(fā)現進一步提示,對于乳腺癌的治療,新的抗腫瘤靶點的尋找和相應的靶向藥物的研發(fā),對于提高乳腺癌治療效率和改善患者預后有非常重要的臨床意義。
基于上述研究,課題組長期致力于尋找天然作物谷子中的抗腫瘤活性成分。前期研究發(fā)現,谷糠中提取的結合態(tài)多酚具有良好的抑制結腸癌細胞生長和逆轉細胞化療耐藥的能力。通過LC-TOF-MS系統(tǒng)鑒定出谷糠多酚中的活性抗腫瘤藥物為阿魏酸和對香豆酸,且阿魏酸的抗腫瘤活性更高[9]。已有研究報道,阿魏酸具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤的藥理活性[14-16]。但PYCR1是否作為FA的潛在靶點之一尚未見報道。本研究通過乳腺癌細胞發(fā)現了FA和PYCR1的直接作用,并進一步闡明了FA結合后對PYCR1的影響。
PYCR1在細胞的正常生理功能和各種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[17-18]。以往的研究報道,PYCR1與多種癌癥例如前列腺癌、淋巴癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關[19-21]。最近,又有文獻報道,PYCR1可以作為疾病診斷和治療的靶點。臨床上,PYCR1的上調與腫瘤患者的性別、年齡和臨床分型等因素相關[22]。因此,靶向PYCR1有可能作為乳腺癌患者的潛在治療策略之一。我們發(fā)現,來源于植物中天然小分子物質阿魏酸可以在乳腺癌細胞中靶向PYCR1,引起其酶活性降低,從而抑制乳腺癌細胞的存活和增殖。然而,為了明確FA靶向PYCR1誘導乳腺癌細胞死亡的分子機制,進一步的研究是有必要的。同時,有研究報道稱,PYCR1與上皮間質轉化(EMT)密切相關[23],而EMT在乳腺細胞的侵襲性轉移過程中扮演了重要角色[24]。因此,通過進一步的研究揭示阿魏酸對乳腺癌細胞的侵襲和轉移是我們接下來的興趣方向之一。值得注意的是,本文目前的研究聚焦于阿魏酸對人乳腺癌細胞MCF-7和小鼠乳腺癌細胞4T1的影響,因此,未來對于阿魏酸的抗乳腺癌效應需要納入更多的腫瘤細胞以進一步評估。同時,建立動物乳腺癌模型,從而最大程度模擬阿魏酸在體內的抗腫瘤功效也是我們未來需要解決的問題之一??傊疚牡难芯堪l(fā)現,天然小分子化合物阿魏酸通過直接結合乳腺癌細胞的受體PYCR1,從而抑制腫瘤細胞的惡性增殖,為乳腺癌的靶向治療提供了新的理論基礎,對于天然綠色、低毒高效的活性抗腫瘤藥物開發(fā)提供了新思路。