楊育賓， 黃衛(wèi)人， 陳 巍

(1)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，廣東， 汕頭 515041；2)深圳市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)臨床應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣東， 深圳 518036)

鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effect nuclease，TALEN)是兩類可編程的作用于基因組編輯的核酸酶。ZFN[1]和TALEN[2]是由序列非特異性DNA核酸酶結(jié)構(gòu)域融合序列特異性DNA識別結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的模塊化蛋白質(zhì)。特異性的DNA識別結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建是極費(fèi)時(shí)間與資金的[3]。近年來，新型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于組分簡單、靶向性高、對靶基因的編輯效率高等特點(diǎn)，逐漸成為臨床醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的基因編輯工具。通過對sgRNA的簡單編碼，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對不同靶標(biāo)的編輯，極大程度拓展了應(yīng)用范圍。但單一的CRISPR系統(tǒng)只可實(shí)現(xiàn)對靶基因的敲除，難以滿足實(shí)際研究中對基因雙向調(diào)控的需求。對CRISPR元件的功能進(jìn)行改造，拓展使用范圍和減少應(yīng)用限制已成為日益關(guān)注的重點(diǎn)。本文對CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用與其系統(tǒng)元件改造后在基因編輯、活體細(xì)胞成像、降低應(yīng)用障礙等方面的研究進(jìn)展和前景做簡要闡述。

1 CRISPR系統(tǒng)基因編輯的原理

細(xì)菌在漫長的自然演化過程中為適應(yīng)噬菌體類型的多態(tài)性，廣泛產(chǎn)生了多種噬菌體抵抗機(jī)制。其中，CRISPR/Cas系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas)是細(xì)菌具有的獲得性免疫防御系統(tǒng)，可幫助細(xì)菌抵抗外源核酸以及噬菌體的入侵[4]。CRISPR的結(jié)構(gòu)中包含了短的部分回文結(jié)構(gòu)的重復(fù)DNA序列。重復(fù)序列并非連續(xù)而是存在一定的間隔，最終形成了交替重復(fù)元素的直接重復(fù)序列(21～48 bp)和可變序列(26～72 bp，即間隔體)的基因座結(jié)構(gòu)[5]。CRISPR/Cas系統(tǒng)根據(jù)效應(yīng)器模塊設(shè)計(jì)的原則可分為兩類，第一類為多亞基效應(yīng)復(fù)合物，第二類為單蛋白質(zhì)效應(yīng)模塊[6]。一般而言，不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制基本類似。獲得性免疫防御系統(tǒng)的激活一般分3步進(jìn)行：(1)適應(yīng)。在該過程中，入侵的外源核酸或噬菌體DNA的原間隔鄰近序列被識別，識別后在CRISPR陣列前端(富含AT和啟動子的前導(dǎo)序列以及重復(fù)序列間)將新的間隔序列進(jìn)行位點(diǎn)特異性的整合；(2)crRNA的成熟。當(dāng)相同的外源核酸或噬菌體再度入侵時(shí)，對應(yīng)的CRISPR陣列被激活，產(chǎn)生前體的crRNA(pre-crRNA)被加工為成熟的crRNA；(3)干擾。crRNA與對應(yīng)的Cas蛋白形成Cas-crRNA復(fù)合物識別并降解外源核酸或噬菌體。本文主要關(guān)注于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的相應(yīng)研究。

在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，成熟的crRNA與反式激活的crRNA(tracrRNA)結(jié)合形成sgRNA。sgRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合物。Cas9蛋白在sgRNA的導(dǎo)向作用下通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合到靶標(biāo)處。隨后，Cas9蛋白識別靶基因的PAM序列(protospacer adjacent motif, PAM)，并在靶基因的PAM上游的第3個(gè)堿基開始切割靶標(biāo)DNA，產(chǎn)生雙鏈斷裂位點(diǎn)(double strand breaks, DSBs)。DSBs的產(chǎn)生誘發(fā)機(jī)體內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制。這種修復(fù)機(jī)制可分為同源重組修復(fù)(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。其中，同源重組修復(fù)可精確地插入目的片段，但需要提供外源的DNA修復(fù)模板，且該修復(fù)機(jī)制的發(fā)生頻率低(Fig.1)。生物體內(nèi)更傾向于發(fā)生非同源末端連接修復(fù)，該修復(fù)過程中堿基的插入或缺失是隨機(jī)的，改變了靶基因原先的核苷酸序列[7]。基于該特性，CRISPR/Cas系統(tǒng)可用于基因編輯，建立多種細(xì)胞系及動物模型[8]，或生產(chǎn)更為廣泛的基因修改動物等[9]。

Fig.1 Schematic diagram of the cas9 system’s action principle and repair principle

2 活細(xì)胞染色體成像技術(shù)的應(yīng)用與改進(jìn)

生物體應(yīng)對外界刺激所進(jìn)行的基因表達(dá)調(diào)控會引發(fā)染色質(zhì)動態(tài)空間結(jié)構(gòu)的變化，這種變化反映基因組的時(shí)空調(diào)節(jié)，在控制生物體的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化和發(fā)育中發(fā)揮直接作用。構(gòu)建可時(shí)實(shí)檢測染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)變化的工具，能極大促進(jìn)對基因表達(dá)的物理調(diào)節(jié)和相互作用的認(rèn)知[10]，更好的了解疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

早期的研究表明，通過設(shè)計(jì)特異性DNA熒光探針，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)多個(gè)基因組位點(diǎn)的可視化檢測，獲得了一些關(guān)于基因組結(jié)構(gòu)的最早見解[11]。但DNA熒光原位雜交存在著許多缺點(diǎn)[12]。原位雜交技術(shù)需要對細(xì)胞進(jìn)行固定，再經(jīng)過加熱和甲酰胺變性來實(shí)現(xiàn)熒光探針與靶點(diǎn)的結(jié)合，因此該方法不適用于活體細(xì)胞成像。且變性條件會引發(fā)基因組結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致研究結(jié)果的可靠性存疑?；贑RISPR系統(tǒng)的靶向性和能用sgRNA的簡單重編程進(jìn)行改變的特性，開始對CRISPR組分進(jìn)行重編程，在不破壞基因組結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過輸入熒光信號獲得靶點(diǎn)可視化的輸出結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了對活細(xì)胞時(shí)實(shí)成像。2013年，Chen等[13]開創(chuàng)性地將dCas9用于基因組成像，通過將dCas9與核定位序列和eGFP標(biāo)簽的融合，實(shí)現(xiàn)在適量的sgRNA表達(dá)后動態(tài)顯示活細(xì)胞中的端粒。這種基于對CRISPR組分進(jìn)行重編程的思維，極大擴(kuò)展了CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用。但只是將dCas9與熒光蛋白質(zhì)融合進(jìn)行活體細(xì)胞成像，在實(shí)際應(yīng)用中依舊存在著較大的障礙。首先，CRISPR系統(tǒng)本身具有脫靶效應(yīng)，確保熒光信號代表的位點(diǎn)是靶點(diǎn)而非脫靶位點(diǎn)是應(yīng)用該工具的前提。其次，核質(zhì)中游離的dCas9熒光融合蛋白質(zhì)，一些細(xì)胞中的自發(fā)熒光及核仁中與核糖體RNA非特異結(jié)合所富集的dCas9熒光融合蛋白等背景信號都會影響信噪比，干擾結(jié)果的判讀。最后，靶向非重復(fù)的序列區(qū)域時(shí)，為了獲得足夠的檢測信號，通常需要大量sgRNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，增大成像難度。

隨著研究的不斷進(jìn)展，上述難題也逐步得到解決。檢測是否產(chǎn)生脫靶效應(yīng)的最有效的方法是標(biāo)記多個(gè)成像組件，然后檢查多色共定位，從而排除脫靶誤讀[14, 15]。Cas9-sgRNA支架的四環(huán)和3′-末端區(qū)域已被證明非常易于修飾，可應(yīng)用為添加熒光蛋白質(zhì)進(jìn)行多色標(biāo)記的手柄[16]。降低背景信號的干擾可通過減少游離的Cas9熒光融合蛋白質(zhì)和增加sgRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。多西環(huán)素誘導(dǎo)啟動子門控的dCas9 mRNA系統(tǒng)能人為控制Cas9熒光融合蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。而對于sgRNA，莖環(huán)基序的穩(wěn)定以及多個(gè)導(dǎo)向表達(dá)結(jié)構(gòu)的修飾會增強(qiáng)sgRNA表達(dá)[17]。實(shí)際上，游離的Cas9熒光融合蛋白質(zhì)是導(dǎo)致背景信號過強(qiáng)的主要原因，通過熒光標(biāo)記sgRNA可除去Cas9熒光融合蛋白質(zhì)的干擾?；谠摾砟?，Wang等[18]采用cy3標(biāo)記了sgRNA。該研究發(fā)現(xiàn)，在非靶標(biāo)處95%的sgRNA被體內(nèi)的核酸酶降解，而靶標(biāo)處形成的cas9-gRNA-DNA三元復(fù)合物保護(hù)了sgRNA，使得靶標(biāo)處信號穩(wěn)定且持久，信噪比高于Cas9-egfp成像系統(tǒng)4倍以上。非重復(fù)基因組區(qū)域的活細(xì)胞成像，通常需要轉(zhuǎn)染多達(dá)26～36個(gè)不同的sgRNAs。為了降低非重復(fù)組區(qū)域的成像難度，Qin等[19]構(gòu)建了含有多達(dá)16個(gè)MS2結(jié)合模塊的工程化sgRNA支架，通過增加單個(gè)sgRNA的熒光標(biāo)記量來放大熒光信號。該工程化的成像系統(tǒng)能夠使用單個(gè)sgRNA對低重復(fù)序列的區(qū)域進(jìn)行多色標(biāo)記，而在非重復(fù)序列的區(qū)域僅需4個(gè)sgRNA即可進(jìn)行成像。

3 CRSPR系統(tǒng)基因編輯功能的應(yīng)用與改進(jìn)

CRISPR基因編輯功能為臨床上腫瘤分子機(jī)制的研究、癌癥免疫療法的發(fā)展以及遺傳疾病等難治性疾病的治療開創(chuàng)了新的方案。對比于DNA識別結(jié)構(gòu)域構(gòu)建困難的ZFN和TALEN核酸酶，CRISPR系統(tǒng)可通過簡單的sgRNA重構(gòu)來靶向不同的目的基因，能更加方便快捷地進(jìn)行靶基因的編輯。但CRISPR系統(tǒng)在編輯目的基因時(shí)產(chǎn)生的DSBs會引發(fā)體內(nèi)易錯(cuò)的非同源末端連接修復(fù)，從而可能引入致病突變，在應(yīng)用CRISPR基因編輯功能同時(shí)，若能通過改進(jìn)CRISPR系統(tǒng)來降低其DSBs產(chǎn)生，將能使之更加安全地應(yīng)用于臨床治療中。

3.1 CRISPR基因編輯功能的應(yīng)用

CRISPR系統(tǒng)是臨床研究中應(yīng)用最為廣泛的基因編輯工具之一，CRISPR強(qiáng)大的基因編輯功能在篩選關(guān)鍵基因、癌癥免疫療法以及遺傳疾病的治療等方向都展現(xiàn)出巨大的價(jià)值。

CRISPR/Cas9篩選可有效地解碼生物學(xué)系統(tǒng)的功能，是發(fā)現(xiàn)癌癥治療新靶點(diǎn)和識別基因與表型相關(guān)性的強(qiáng)大基因組學(xué)工具。通過構(gòu)建sgRNA慢病毒文庫，將之以較低的感染度感染穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的細(xì)胞，而后使之暴露于設(shè)計(jì)的干擾下，即可高通量、快速地檢測細(xì)胞群體中特定基因敲除的表型效應(yīng)[20]。CRISPR篩選在臨床研究中一般有2種用途：(1)通過測序不同轉(zhuǎn)染時(shí)間段細(xì)胞中sgRNA的豐度，即可識別基因型特異性的脆弱性，用以篩選獲得細(xì)胞生長必須的關(guān)鍵基因(Fig.2A)。這些“必需”基因可能成為潛在的藥物靶點(diǎn)。因?yàn)?，它們的功能缺失?dǎo)致生存能力降低[21]。(2)CRISPR篩選還會得出在不同的轉(zhuǎn)錄背景下，相同基因的擾動可能帶來的差異化結(jié)果，這種現(xiàn)象被稱為合成致死性(Fig.2B)。簡而言之，一個(gè)細(xì)胞能夠補(bǔ)償基因A或B的功能改變，但如果基因A和B同時(shí)改變，則無法存活，這種基因間相互作用的關(guān)系稱為合成致死性。轉(zhuǎn)化為癌癥生物學(xué)，這表明特定腫瘤抑制因子的丟失或癌基因的激活，會導(dǎo)致以往生長非必需的基因表達(dá)成為必需。一項(xiàng)臨床研究證明了這一概念。該研究表明，BRCA基因突變的乳腺癌對多聚ADP核糖聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerase ，PARP)抑制劑具有更高的敏感性[22]。與此類似，Shen等[23]使用雙敲除篩選方法對73個(gè)癌癥基因進(jìn)行配對篩選，發(fā)現(xiàn)了許多已知(例如BRCA-PARP)和未知的合成致死相互作用，其中一些相互作用可以在體外用對應(yīng)的功能抑制藥物進(jìn)行組合模擬。合成致死關(guān)系的探究為精準(zhǔn)基因治療提供了理論基礎(chǔ)，也為精準(zhǔn)藥物治療提供了參考建議。

Fig.2 Diagram of CRISPR screening (A) CRISPR screening identifies key genes；(B) Diagram of synthetic lethality

癌癥免疫療法是臨床上最為基礎(chǔ)且常用的癌癥治療方法之一。近年來，隨著CRISPR基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展，癌癥免疫療法更側(cè)重于T細(xì)胞受體編輯療法(genetically modified T-cell receptor therapy，TCR)和嵌合抗原受體T細(xì)胞療法(chimeric antigen receptor T cell therapy，CAR-T)。在機(jī)體內(nèi)，癌癥細(xì)胞通過過度表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子來逃逸免疫細(xì)胞的殺傷作用。已有研究表明，通過對T細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)分子受體進(jìn)行編輯，能發(fā)揮良好的腫瘤殺傷作用甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受性[24]。但TCR療法在編輯體內(nèi)分子受體時(shí)，需克服內(nèi)源性已有的TCR分子與外源編輯的TCR分子間配對形成異二聚體、內(nèi)源性TCR分子競爭結(jié)合CD3分子干擾受編輯的TCR表達(dá)等難題。解決上述問題最有效的方法是引入TCR分子的同時(shí)敲除內(nèi)源性的TCR，即在引入TCR分子的同時(shí)，轉(zhuǎn)染靶向內(nèi)源性TCR-β鏈的CRISPR慢病毒[25]。而在CAR-T療法中，CRISPR系統(tǒng)可以將特異性的CAR靶向T細(xì)胞受體，使T細(xì)胞表達(dá)特異性的CAR。編輯后的CAR-T細(xì)胞在體外進(jìn)行增殖培養(yǎng)，最后將之回注于患者體內(nèi)，增強(qiáng)患者機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答[26, 27]。而在遺傳疾病的治療中，CRISPR系統(tǒng)較常用于異常分子的敲除與突變區(qū)域的切割。例如，在β-地中海貧血和鐮刀狀細(xì)胞貧血癥2種遺傳病中，編碼血紅蛋白的基因單堿基突變使得β-珠蛋白的表達(dá)缺失，進(jìn)而導(dǎo)致貧血。之前的研究顯示，γ-珠蛋白與β-珠蛋白的功能相似，而BCL11A轉(zhuǎn)錄因子可以抑制γ-珠蛋白的表達(dá)。這表明，BCL11A分子的敲除或能逆轉(zhuǎn)珠蛋白表達(dá)缺失誘發(fā)的貧血。Frangoul等[28]研究驗(yàn)證了該理論的可行性。其研究結(jié)果表明，在BCL11A分子敲除后，患者不再需要通過依賴傳統(tǒng)的輸血來治療β-地中海貧血和鐮刀狀細(xì)胞貧血癥。

3.2 基因編輯功能在臨床應(yīng)用研究中的改造

由CRISPR系統(tǒng)的工作原理可知，Cas9的基因編輯系統(tǒng)在插入和缺失目的基因時(shí)通常會產(chǎn)生DSBs。DSBs引發(fā)了生物體內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，且該修復(fù)機(jī)制更傾向于非同源末端連接修復(fù)，導(dǎo)致堿基的插入與缺失是隨機(jī)的。不可忽視的是，絕大多數(shù)致病性等位基因來自特定的插入、刪除或堿基替換。由此可知，在使用Cas9系統(tǒng)時(shí)可能會引入致病突變[29]。能否對CRISPR元件進(jìn)行重編程，使之更精確地操縱基因是近年來臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

dCas9蛋白的出現(xiàn)為CRISPR系統(tǒng)的改造打開了突破口。通過對Cas9結(jié)構(gòu)域的改造，使之喪失內(nèi)切酶活性，保留sgRNA導(dǎo)向的靶向性。利用該特性，將修飾后的dCas9蛋白(dead Cas9, dCas9)和腺嘌呤脫氨酶進(jìn)行融合。通過dCas9的靶向性，成功實(shí)現(xiàn)了在靶點(diǎn)處不造成DNA雙鏈斷裂的情況下，將A-T堿基對置換為G-C堿基對，該堿基編輯器被稱為腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editors, ABE)[30]。基于相似的原理，將失去活性的dCas9蛋白與胞嘧啶脫氨酶融合，也會實(shí)現(xiàn)在不產(chǎn)生DSBs的情況下將C-G堿基對替換為T-A堿基對。但由于體內(nèi)存在著尿嘧啶DNA糖基化酶，該酶可識別錯(cuò)配的U-G錯(cuò)配，從而通過堿基切除修復(fù)的途徑將U逆轉(zhuǎn)為C。故而對比腺嘌呤堿基編輯器，胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editors, CBE)[31]需要在融合蛋白質(zhì)上再加入尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑(uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI)。單堿基編輯器的出現(xiàn)，不僅為CRISPR系統(tǒng)在臨床上針對遺傳疾病治療提供了新的曙光，也說明了對CRISPR系統(tǒng)的改造在實(shí)際研究應(yīng)用上的可行性。舉例而言，在遺傳性耳聾中，有80%是隱性遺傳突變，需要精確的位點(diǎn)編輯才可使之恢復(fù)正常的生理功能。2018年，Liu等[32]團(tuán)隊(duì)基于單堿基編輯的CRISPR技術(shù)，運(yùn)用AAV載體裝載分為兩部分的單堿基編輯器(AAV的運(yùn)載能力限制，需將單堿基編輯器拆分為Cas9及sgRNA)，而后2種AAV載體共同轉(zhuǎn)染同一細(xì)胞。研究結(jié)果顯示，兩部分的單堿基編輯器能在體內(nèi)重新結(jié)合并靶向到特異部位，且?guī)缀鯚o能檢測到的脫靶現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)中原本完全喪失聽覺的小鼠可對響亮的聲音做出反應(yīng)，表明小鼠至少已經(jīng)恢復(fù)了部分聽力。該單堿基編輯技術(shù)成功地于體外細(xì)胞研究中找到隱性突變位點(diǎn)并修復(fù)，在整體研究中通過對單堿基編輯器的重新設(shè)計(jì)再現(xiàn)體外細(xì)胞研究結(jié)果，證明了AAV載體能有效遞送CRISPR系統(tǒng)，也為隱性遺傳疾病的治療提供了新思路。

通過對Cas9蛋白的改造，CRISPR系統(tǒng)不僅適用于靶基因的敲除，也可以利用不同機(jī)制對靶基因的表達(dá)進(jìn)行雙向調(diào)控。實(shí)際上，不止單堿基編輯器能在不產(chǎn)生DSBs的情況下對目的基因進(jìn)行編輯，CRISPRi[33]、CRISPRa[34, 35]、CRISPRon[36]和CRISPRoff[37]技術(shù)同樣也可以達(dá)到相同的目的。有趣的是，無論是單堿基編輯器還是上述的4個(gè)延伸的CRISPR基因編輯技術(shù)，其原理都是類似的，都是基于對dCas9蛋白的改造實(shí)現(xiàn)的。不同之處在于dCas9蛋白所融合的蛋白組件不同。其中，CRISPRi、CRISPRa是與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合，從而分別削弱或增強(qiáng)目的基因的表達(dá)。而CRISPRon、CRISPRoff技術(shù)則是分別與去甲基化酶和甲基化酶融合，從而在表觀層面影響基因的表達(dá)。然而，現(xiàn)有研究對sgRNA的改造更注重于其結(jié)構(gòu)與長度的改變對靶向效率的影響[38]。也有相關(guān)的研究在sgRNA上引入適體核酸組件作為開關(guān)，通過調(diào)節(jié)sgRNA的活性從而調(diào)控Cas9活性，實(shí)現(xiàn)人為控制CRISPR系統(tǒng)對靶基因編輯的時(shí)空調(diào)節(jié)[39]。

對CRISPR系統(tǒng)的模塊進(jìn)行改造不單能改進(jìn)其功能，還會優(yōu)化其效能。受限于Cas9系統(tǒng)的靶標(biāo)為DNA，導(dǎo)致人們未能及時(shí)關(guān)注到單堿基編輯器是否會對RNA產(chǎn)生脫靶編輯，Grünewald等[40]率先在細(xì)胞層面檢測了單堿基編輯器的RNA的脫靶編輯效應(yīng)。不容樂觀的是，該研究結(jié)果顯示，BE堿基編輯器會在人類細(xì)胞中導(dǎo)致廣泛的RNA胞嘧啶脫氨，頻率為0.07%～100%，涉及到38%～58%的表達(dá)基因。而ABE單堿基編輯系統(tǒng)也存在相似的RNA脫靶編輯效應(yīng)。面對單堿基編輯器導(dǎo)致RNA層面的脫靶效應(yīng)弊端，Grünewald等對胞嘧啶脫氨酶進(jìn)行改造，保留了單堿基編輯器對目的基因的編輯效能，顯著減少RNA脫靶編輯，為單堿基編輯系統(tǒng)的優(yōu)化指出了方向。隨著研究的進(jìn)展，人們不再滿足單堿基編輯器較低的編輯效率和編輯窗口，Zhang等[41]開發(fā)了雙堿基編輯器，該研究將胞嘧啶脫氨酶hAID-腺嘌呤脫氨酶-Cas9n融合在一起，實(shí)現(xiàn)在同一基因上單獨(dú)的C>T和A>G，或者二者的同時(shí)進(jìn)行。Grünewald等[42]將腺苷脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶分別融合到Cas9切口酶的N-端和C-端，開發(fā)了一種可同時(shí)引入A>G和C>T替換的雙堿基編輯器。目前，更多的雙堿基編輯器也在開發(fā)應(yīng)用中。隨著研究的深入，堿基編輯器或能為治療遺傳疾病、癌癥等難治性疾病開創(chuàng)新的治療途徑。

4 CRISPR系統(tǒng)的局限及其優(yōu)化改造

CRISPR/Cas系統(tǒng)在進(jìn)行基因編輯時(shí)存在著脫靶編輯，PAM區(qū)識別限制以及遞送困難等障礙，能否通過改造CRISPR元件來減少實(shí)際應(yīng)用中的障礙是臨床研究中亟待解決的問題之一。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌的一種獲得性的免疫防御系統(tǒng)，在對外源DNA的清除過程中為保證較高清除率，系統(tǒng)本身就存在一定的錯(cuò)配忍受性。且哺乳動物細(xì)胞基因組大小遠(yuǎn)超細(xì)菌，這意味著，在使用CRISPR系統(tǒng)用于哺乳動物基因編輯時(shí)脫靶概率的相應(yīng)提升[43]。隨著對CRISPR系統(tǒng)的了解，發(fā)現(xiàn)對Cas9蛋白或sgRNA的優(yōu)化或改造可有效減少脫靶編輯。對Cas9蛋白的優(yōu)化的主要方式為設(shè)計(jì)其類似物或者對其進(jìn)行改造。Kleinstiver 等[44]團(tuán)隊(duì)通過編輯spCas9蛋白與非靶基因結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，構(gòu)建了增強(qiáng)型特異性的蛋白變體“eSpCas9”，該變體的脫靶性相較于原蛋白質(zhì)得到顯著降低。而對sgRNA的改造主要針對GC含量、長度及化學(xué)修飾等方式來降低脫靶率，用已有相關(guān)的數(shù)據(jù)算法來預(yù)測sgRNA的脫靶率，并給出sgRNA設(shè)計(jì)的較優(yōu)序列[43]。

此外，Cas9蛋白在發(fā)揮核酸內(nèi)切酶功能時(shí)，還需識別靶序列的PAM，因此CRISPR系統(tǒng)并非能自由編輯所有序列，可被編輯的序列必須存在PAM區(qū)。令人振奮的是，Kleinstiver等[45]團(tuán)隊(duì)對SpCas9進(jìn)行升級改造，使之成為了幾乎不受PAM限制的變體蛋白SpRY，其可識別的PAM序列為NRN和NYN，顯著擴(kuò)展了CRISPR系統(tǒng)的編輯窗口。CRISPR系統(tǒng)在基因療法中的病毒遞送載體通常為低免疫原性的腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)，但AAV載體的裝載能力是有限的。SpCas9的氨基酸長度為1 368，而在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的saCas9的氨基酸長度僅為1 058，更適合包裝成AAV病毒。尋找長度更短，分子量更小的Cas9蛋白類似物，是解決CRISPR系統(tǒng)遞送困難的方案之一，但不改變spCas9原有功能的條件下對其進(jìn)行截短可能也是潛在的優(yōu)化方式。

5 問題與展望

CRISPR基因編輯系統(tǒng)對了解生物體內(nèi)關(guān)鍵基因功能，潛在藥物靶點(diǎn)的篩選以及不同基因轉(zhuǎn)錄背景下基因表達(dá)的聯(lián)系等研究具有巨大的價(jià)值。隨著對CRISPR組分結(jié)構(gòu)和功能的解析，基于CRISPR系統(tǒng)的改造研究也在不斷深化。通過對Cas9蛋白的改造，CRISPR系統(tǒng)不再只能實(shí)現(xiàn)基因敲除，其還能在轉(zhuǎn)錄層面以及表觀遺傳調(diào)控水平實(shí)現(xiàn)對靶基因的雙向調(diào)控，甚至能用于活體細(xì)胞成像。CRISPR系統(tǒng)的改造也顯著降低了其原先脫靶率高、遞送困難等應(yīng)用障礙。但將CRISPR系統(tǒng)真正轉(zhuǎn)化到實(shí)際生產(chǎn)與臨床應(yīng)用時(shí)，仍需關(guān)注到改造后的系統(tǒng)是否存在新的以往未知的安全性隱患，系統(tǒng)本身已知的風(fēng)險(xiǎn)是否可被接受，實(shí)際的研究能否做到透明公開，是否通過了倫理審查等。隨著研究的不斷深化進(jìn)展，CRISPR系統(tǒng)的改造也會不斷深化，進(jìn)而反哺和推動臨床醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用的發(fā)展。