虞子青， 張二荃

(北京生命科學(xué)研究所， 北京 102206)

1 生物節(jié)律

1.1 生物節(jié)律概述

地球以24 h為周期自轉(zhuǎn)，產(chǎn)生了每天的晝夜交替，從而使地面上的光照、溫度等環(huán)境也產(chǎn)生24 h為周期的規(guī)律變化。為了適應(yīng)這種周期性的環(huán)境波動(dòng)，地球上的生物進(jìn)化出了晝夜節(jié)律[1]。內(nèi)源性的生物節(jié)律最早出現(xiàn)在25億年前的藍(lán)細(xì)菌中[2]，并作為一種較為保守的生命活動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制廣泛存在于各種生物中。一般情況下，與外在環(huán)境一致的生物節(jié)律會(huì)使生物更加適應(yīng)環(huán)境，獲得進(jìn)化上的優(yōu)勢(shì)。目前，越來越多的人從事晝夜顛倒的工作，由于活動(dòng)時(shí)間與內(nèi)源性生物節(jié)律和外界環(huán)境不符而導(dǎo)致的睡眠紊亂和代謝疾病發(fā)病率越來越高[3]。睡眠時(shí)間不足是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)病的因素之一，睡眠時(shí)相的改變會(huì)導(dǎo)致生物節(jié)律的改變。長(zhǎng)期的內(nèi)源性生物節(jié)律與外界環(huán)境和行為節(jié)律的不同步，會(huì)導(dǎo)致代謝狀態(tài)不良和心腦血管疾病患病概率上升[4]。

從每個(gè)節(jié)律基因的表達(dá)水平，到體溫、心跳和活動(dòng)等生理指標(biāo)都呈周期性變化，這些變化可以用正弦曲線近似地描述。因此，可以用相位(phase)、振幅(amplitude)、周期(period)等3個(gè)參數(shù)來描述生物節(jié)律(Fig.1)[5]。

Fig.1 Three parameters to describe circadian clock Since the expression levels of circadian genes and many physiological indicators oscillate in a sine-like pattern, circadian rhythm is always described by 3 parameters: amplitude, phase, and period

20世紀(jì)70年代，隨著Konopka和Benzer等[6]在果蠅中發(fā)現(xiàn)了可以改變生物節(jié)律周期的遺傳突變株P(guān)eriod(Per)，人們逐漸意識(shí)到生物節(jié)律是由一系列基因控制的。在哺乳動(dòng)物中，光線從視網(wǎng)膜傳入產(chǎn)生生物節(jié)律的中樞，視交叉上核(suprachiasmatic nuclei，SCN)，從而完成外界光線環(huán)境對(duì)生物體內(nèi)源生物節(jié)律的“校準(zhǔn)”和同步化。視交叉上核又將該信號(hào)傳遞到其他腦區(qū)以及外周器官，使得各個(gè)器官以統(tǒng)一的節(jié)律進(jìn)行各自的生命活動(dòng)[7]。

1.2 轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路

大多數(shù)情況下，生物節(jié)律是在轉(zhuǎn)錄層面上的周期性調(diào)控，生物鐘基因組成了一個(gè)轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路(transcriptional-translational feedback loop，TTFL)。核心生物鐘基因由bHLH (basic helix-loop-helix) -PAS (PER-ARNT-SIM)家族轉(zhuǎn)錄因子、酪蛋白激酶和一些孤兒核受體組成，這些轉(zhuǎn)錄因子可以識(shí)別生物鐘基因啟動(dòng)子上的E-box、D-box或視黃酸受體相關(guān)孤兒受體結(jié)合元件(retinoic acid receptor-related orphan receptor binding element，RRE)等元件。在哺乳動(dòng)物中，最核心的環(huán)路由轉(zhuǎn)錄激活因子(circadian locomotor output cycles kaput，Clock)和Bmal1(brain and muscle Arnt-like 1，又稱aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1或Arntl1)，以及轉(zhuǎn)錄抑制因子Per(period)和Cry(cryptochrome)組成。Clock和Bmal1形成異源二聚體，結(jié)合在包括Per和Cry等基因啟動(dòng)子的E-box元件上，促進(jìn)這些基因的表達(dá)；隨著Per和Cry蛋白質(zhì)的積累，它們又可以反過來結(jié)合Clock-Bmal1二聚體，從而抑制轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，減少自身的表達(dá)，形成負(fù)反饋。

除此之外，Rev-erb和Ror的表達(dá)也受到Clock-Bmal1復(fù)合物的調(diào)控，而Rev-Erb和ROR蛋白質(zhì)又能通過RRE調(diào)節(jié)Clock和Bmal1的轉(zhuǎn)錄。DBP(D-box binding protein)本身受E-box調(diào)控，E4BP4(E4 promoter-binding protein 4)受RRE調(diào)控，這二者又可以通過D-box調(diào)節(jié)Per的表達(dá)。如此，便形成了3個(gè)環(huán)環(huán)相扣、互相影響的轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路(Fig.2)。

Fig.2 Interlocking loops of mammalian circadian components The core loop is composed of Clock-Bmal1 and Per-Cry. Transcription activators (RORs and DBP) and repressors (Rev-ERBs and E4BP4) synergistically regulate the expression of Clock, Bmal1, and Per. Adapted from Zhang et al[8]

隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的生物鐘相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，上百個(gè)基因可以通過各種與核心生物鐘環(huán)路直接或間接的相互作用參與到生物節(jié)律的調(diào)控中，這也表明，許多調(diào)控其他生命活動(dòng)的蛋白質(zhì)受生物節(jié)律的調(diào)控，也反過來影響著生物節(jié)律[8]。

2 環(huán)境對(duì)生物節(jié)律的影響

2.1 光照對(duì)節(jié)律的給時(shí)者效應(yīng)

環(huán)境中的光信號(hào)經(jīng)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的感光換能后，通過視網(wǎng)膜-下丘腦束傳遞給視交叉上核，使中樞生物鐘與外界光照節(jié)律同步；視交叉上核再將節(jié)律信息傳遞到身體各組織器官，使機(jī)體各部分作為一個(gè)有機(jī)的整體產(chǎn)生有節(jié)律的生理活動(dòng)與行為[9]。雖然進(jìn)食、藥物、運(yùn)動(dòng)、睡眠-覺醒周期都可以影響生物節(jié)律的同步化[10]，但光照仍然是節(jié)律系統(tǒng)最初級(jí)的給時(shí)者(zeitgeber)[11]。

視網(wǎng)膜本身也是一個(gè)有節(jié)律的器官。視網(wǎng)膜的節(jié)律使我們?cè)?4 h內(nèi)感受到變化超過1* 106倍的光強(qiáng)范圍，可以為每一種光照狀態(tài)調(diào)整合適的視覺靈敏度[12]。在視交叉上核病變或視神經(jīng)截?cái)嗟膭?dòng)物中，視桿細(xì)胞的外截視盤脫落節(jié)律和血清素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(aralkylamine N-acetyltransferase，AANAT)mRNA的晝夜節(jié)律依然存在，這意味著視網(wǎng)膜的節(jié)律可能不受節(jié)律中樞視交叉上核控制[13]。視網(wǎng)膜會(huì)影響視交叉上核的節(jié)律。去除視網(wǎng)膜會(huì)擾亂MAPK的磷酸化的節(jié)律，感光細(xì)胞的脫落會(huì)導(dǎo)致視交叉上核cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)在夜間的磷酸化水平升高[14]。

在光線激活視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞后，谷氨酸是在這個(gè)光誘導(dǎo)過程中發(fā)揮主要作用的信號(hào)分子。谷氨酸與其受體結(jié)合，引起視交叉上核神經(jīng)元的鈣離子內(nèi)流。第二信使?jié)舛鹊脑黾訉?dǎo)致了一系列信號(hào)通路的激活，包括鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)、神經(jīng)元一氧化氮合酶、cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)。這一系列的信號(hào)導(dǎo)致了CREB的磷酸化，磷酸化的CREB結(jié)合在節(jié)律基因Per和Cry啟動(dòng)子的cAMP應(yīng)答元件上，導(dǎo)致這些基因的轉(zhuǎn)錄被激活，從而實(shí)現(xiàn)光線對(duì)節(jié)律基因的調(diào)控[12, 15, 16]。

除了正常的晝夜交替會(huì)“校準(zhǔn)”我們的節(jié)律之外，短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間的光刺激都會(huì)對(duì)正常的節(jié)律產(chǎn)生影響。光刺激在某些時(shí)候?qū)τ谏锕?jié)律的相位無任何作用，但在某些時(shí)間點(diǎn)的光刺激會(huì)導(dǎo)致節(jié)律相位的提前或滯后——這也是相位響應(yīng)曲線(phase response curve，PRC)的定義[17, 18]。不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)于光照刺激不同的響應(yīng)，其實(shí)就起到了將內(nèi)源性生物節(jié)律轉(zhuǎn)換成被光同步化過后的真實(shí)節(jié)律的作用。實(shí)際上，在完全黑暗(constant darkness，DD)實(shí)驗(yàn)條件下，在某時(shí)間點(diǎn)給予小鼠1個(gè)或者2個(gè)光脈沖刺激，就能根據(jù)受到刺激的時(shí)間誘導(dǎo)出新的相位[19]。

持續(xù)光照條件(constant light，LL)會(huì)破壞小鼠個(gè)體的晝夜節(jié)律。例如，處在恒定光照環(huán)境下的小鼠會(huì)表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)減少、節(jié)律周期變長(zhǎng)，直到無節(jié)律的表型。雖然恒定的光照會(huì)使視交叉上核的細(xì)胞去同步化，從而導(dǎo)致節(jié)律紊亂，但是這種情況下細(xì)胞內(nèi)部的節(jié)律不會(huì)被破壞，單個(gè)細(xì)胞的節(jié)律基因表達(dá)還是正常的[20]。

將恒定光照下的小鼠放回恒定黑暗的環(huán)境，小鼠行為以及基因表達(dá)水平的節(jié)律都會(huì)迅速得到恢復(fù)，這意味著真正的內(nèi)在節(jié)律被光照掩蓋了[21]。因此，短時(shí)間的脈沖光刺激會(huì)改變節(jié)律基因的表達(dá)，從而影響相位，長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)光刺激會(huì)擾亂細(xì)胞之間的同步化耦合，但是目前的機(jī)制尚不清楚。

2.2 氧氣對(duì)節(jié)律的影響——缺氧通路與生物鐘環(huán)路的相互作用

氧氣是氧化磷酸化過程中最終的電子受體，可產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)?；钚匝蹙哂休^高的反應(yīng)活性，可破壞大分子，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或細(xì)胞死亡。因此，進(jìn)化使得所有現(xiàn)存的生物都有一個(gè)維持氧穩(wěn)態(tài)的系統(tǒng)，其主要分子機(jī)制在于缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)的氧化和降解[22]。在正常氧氣水平下，PHD家族脯氨酸羥化酶能利用氧氣將HIF-α中的1個(gè)特定脯氨酸殘基羥基化，VHL(von Hippel-Lindau )蛋白與羥基化的HIF-α結(jié)合，招募泛素連接酶，并介導(dǎo)HIF-α的降解。HIF-1α抑制因子(FIH1)也會(huì)利用氧羥基化HIF-1α上的天冬酰胺殘基，抑制其與共激活蛋白質(zhì)的相互作用[23, 24]。

與大多數(shù)節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子一樣，HIF家族的蛋白質(zhì)(HIF-1/2 α/β)也含有bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域，可以介導(dǎo)異源二聚體和DNA的結(jié)合[25]。在缺氧條件下，HIF-α蛋白不會(huì)被羥基化，因此較為穩(wěn)定，可以與Arnt(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，又稱HIF-1β)形成異源二聚體，然后與和E-box序列相似的缺氧應(yīng)答元件(hypoxia-response elements，HREs)結(jié)合，招募p300/CBP促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄[26]。

在過去的幾十年中，大量研究表明，氧氣水平或者說缺氧的狀態(tài)，會(huì)影響生物節(jié)律；反之，缺氧誘導(dǎo)因子也受到生物節(jié)律的調(diào)控[27]。在缺氧條件下，斑馬魚中的某些節(jié)律基因，例如Clock和Per1表達(dá)水平會(huì)顯著改變，且在長(zhǎng)期暴露在缺氧條件下會(huì)使斑馬魚生物節(jié)律的振幅減弱，在小鼠成纖維細(xì)胞中也觀察到了類似的結(jié)果[28]；長(zhǎng)時(shí)間低氧環(huán)境的暴露也會(huì)顯著增加小鼠大腦內(nèi)的Clock和Per1蛋白質(zhì)水平[29]。另外，有對(duì)于大鼠和小鼠等模式生物的研究表明，急性暴露于缺氧環(huán)境中，會(huì)削弱體溫節(jié)律的振幅?？傮w來看，缺氧通路的激活會(huì)減弱生物節(jié)律。在離體細(xì)胞中加入模擬缺氧環(huán)境的化合物，例如DMOG等，也可以看到熒光素酶報(bào)告基因顯示出的細(xì)胞節(jié)律性的降低。激素水平、酸堿平衡、心腦血管相關(guān)指標(biāo)等生理指標(biāo)的節(jié)律性在低氧環(huán)境下也會(huì)顯著性減弱[30]。

由于生物鐘和缺氧狀態(tài)是相互影響的，而且這2種調(diào)控機(jī)制都是基于轉(zhuǎn)錄的，因此，生物鐘蛋白質(zhì)極有可能與缺氧相關(guān)蛋白質(zhì)存在直接的相互作用，并可以協(xié)同調(diào)節(jié)生命活動(dòng)。最初，人們利用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)來觀察Clock和HIF-1α在抗利尿激素基因轉(zhuǎn)錄激活中的協(xié)同作用[31]，并通過熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)來證明Bmal1和Bmal2(又稱Arntl2)會(huì)與缺氧因子形成異源二聚體[32, 33]；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也證明，Epas1(也稱作HIF-2α)和Bmal1共同激活了Pai1基因的轉(zhuǎn)錄[34]。這些實(shí)驗(yàn)都未直接看到二者的直接的協(xié)同作用，但也提示我們，除了2個(gè)通路之間的相互影響外，節(jié)律蛋白質(zhì)可能與缺氧因子確實(shí)存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。然而，仍需要更多的研究來證實(shí)這一假設(shè)。

直到2017年，生物節(jié)律與缺氧信號(hào)通路在分子水平直接的相互作用才受到廣泛關(guān)注。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP-seq)表明，超過三分之一的HIF-1α結(jié)合的基因是與Bmal1重合的，免疫共沉淀等一系列的生化實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，HIF-1α與Bmal1之間存在直接的相互作用[30]。另外，同年另一項(xiàng)研究表明，小鼠血液和組織中的氧氣含量也有節(jié)律；在培養(yǎng)的細(xì)胞中可以用節(jié)律性的氧氣濃度變化來重置細(xì)胞的節(jié)律，部分節(jié)律基因會(huì)響應(yīng)氧氣濃度的變化而改變表達(dá)模式，而這種改變也依賴于HIF-1α[28]。

結(jié)構(gòu)決定功能，相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或許意味著在功能上也會(huì)有所交叉。Clock、Bmal1等生物鐘蛋白質(zhì)和缺氧誘導(dǎo)因子都屬于bHLH-PAS家族的轉(zhuǎn)錄因子，都有著可以和DNA結(jié)合的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)，2個(gè)串聯(lián)的PAS結(jié)構(gòu)域 (PAS-A和PAS-B)，以及一段結(jié)構(gòu)多變的轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(TAD或TRD)。這2個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域，都是由5個(gè)反向平行的β折疊以及數(shù)個(gè)α螺旋構(gòu)成的[35, 36]，是形成異源二聚體時(shí)負(fù)責(zé)與另外的轉(zhuǎn)錄因子相互作用的接觸面[37, 38]。

根據(jù)異源二聚體的聚合形式，bHLH-PAS家族蛋白質(zhì)可以被分成2類。其中1類包括3種缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α)，芳烴受體(AHR)，芳烴受體抑制蛋白(AHRR)，4種神經(jīng)元PAS蛋白(Npas1, Npas2, Npas3, Npas4)，2種Sim蛋白(Sim1, Sim2)，和生物鐘蛋白Clock。另1類包括Arnt，Arnt2，Arntl1，Arntl2[39]。這兩類蛋白質(zhì)之間可以形成異源二聚體。例如目前已經(jīng)解出晶體結(jié)構(gòu)的生物鐘核心環(huán)路里的轉(zhuǎn)錄激活因子Clock-Bmal1二聚體，以及在缺氧調(diào)控通路中的HIF-1α/2α-Arnt二聚體。目前，雖然并未解出缺氧誘導(dǎo)因子和Bmal的異源二聚體結(jié)構(gòu)，但相似的結(jié)構(gòu)域排布以及一些生化實(shí)驗(yàn)提供二者存在直接相互作用的線索，還是為接下來純化并解出HIF-Bmal復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)提供了希望。

2.3 環(huán)境溫度對(duì)節(jié)律的影響

理論上，反應(yīng)溫度會(huì)決定化學(xué)反應(yīng)的速率。然而，對(duì)于從簡(jiǎn)單到復(fù)雜的各種生物節(jié)律系統(tǒng)來說，溫度的變化并不會(huì)改變周期，這被稱為“溫度補(bǔ)償效應(yīng)”[40]。溫度的改變不影響周期的長(zhǎng)短，并不意味著溫度對(duì)于生物節(jié)律毫無影響。除恒溫脊椎動(dòng)物外，環(huán)境溫度循環(huán)是生物體內(nèi)晝夜節(jié)律系統(tǒng)非常普遍的誘導(dǎo)線索。在植物、昆蟲和鳥類中，溫度也有可能成為除光線之外的給時(shí)者[41]。

在鏈孢菌中，溫度的高低會(huì)影響生物鐘蛋白Frq的表達(dá)量。因此，溫度的變化可以表現(xiàn)為節(jié)律蛋白質(zhì)的絕對(duì)數(shù)量，從而確定當(dāng)前的時(shí)間[42]。擬南芥的離體組織中，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用節(jié)律是獨(dú)立的，但地上部分的組織和地下部分的組織都可以單獨(dú)響應(yīng)環(huán)境溫度信號(hào)的周期性變化，以維持其溫度補(bǔ)償效應(yīng)[43]。在果蠅中，溫度會(huì)影響生物鐘蛋白Per的磷酸化和穩(wěn)定性以及Per基因mRNA的剪切；轉(zhuǎn)錄組分析也表明，果蠅的一部分基因轉(zhuǎn)錄會(huì)受到溫度的調(diào)控。人們認(rèn)為，果蠅中節(jié)律基因的表達(dá)實(shí)際上是光線和溫度共同控制的[44]。

恒溫的哺乳動(dòng)物中，環(huán)境溫度只能算是一種非常弱的給時(shí)者，與光照相比未見那么重要。但是哺乳動(dòng)物的生物節(jié)律系統(tǒng)其實(shí)也保留了一部分對(duì)環(huán)境溫度的敏感度，這種敏感度使得環(huán)境因素的變化在核心體溫節(jié)律中發(fā)揮一種“中介”的作用，讓機(jī)體潛在的節(jié)律和生活環(huán)境同步[41]。

將大鼠放在30 ℃環(huán)境中4周，就可以觀察到大鼠體溫節(jié)律的振幅下降[45]；狐猴放置在較低的環(huán)境溫度中，則會(huì)增加一天之內(nèi)體溫節(jié)律的振幅[46]。然而,對(duì)于哺乳動(dòng)物個(gè)體來講，一般很難判斷由環(huán)境溫度改變而引起的節(jié)律變化究竟是由于溫度直接對(duì)節(jié)律的影響，還是溫度對(duì)體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)有所影響，從而影響了核心體溫的節(jié)律或者其他生命活動(dòng)節(jié)律的振幅。

但是,對(duì)于離體的哺乳動(dòng)物組織來說，變化的環(huán)境溫度確實(shí)可以誘導(dǎo)出不同相位的生物節(jié)律。因?yàn)椋梢暯徊嫔虾蓑?qū)動(dòng)的一天之內(nèi)的體溫的變化節(jié)律，對(duì)于外周器官來講就是一個(gè)非常好的同步化信號(hào)。這樣由體溫節(jié)律驅(qū)動(dòng)的系統(tǒng)需要滿足2個(gè)條件：1是視交叉上核本身不能對(duì)這種微小的體溫波動(dòng)過于敏感，2是外周組織的節(jié)律能在正常生理狀態(tài)下的體溫波動(dòng)范圍內(nèi)對(duì)溫度的變化產(chǎn)生響應(yīng)。有一項(xiàng)研究將視交叉上核、垂體和肺在36 ℃下離體培養(yǎng)，并分別規(guī)律地給予時(shí)長(zhǎng)為1 h和6 h, 38.5 ℃熱刺激，以Per2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因(Per2-luciferase)發(fā)出的熒光信號(hào)作為節(jié)律性的輸出。結(jié)果顯示，視交叉上核的節(jié)律并未受到熱刺激的影響，而垂體和肺都在2種熱刺激之間表現(xiàn)出了不同的相位。加入河豚毒素阻斷鈉離子通道，視交叉上核節(jié)律對(duì)于溫度變化的抵抗就會(huì)消失；加入熱休克蛋白(heat shock protein)抑制劑KNK437阻斷熱休克反應(yīng)通路，則會(huì)讓視交叉上核失去溫度補(bǔ)償效應(yīng)[47]。這些結(jié)果表明，進(jìn)化上古老的溫度重置節(jié)律的反應(yīng)在恒溫動(dòng)物上同樣適用，可以增強(qiáng)內(nèi)部晝夜節(jié)律同步。

3 極晝極夜下的生物節(jié)律

3.1 研究概述

生物節(jié)律最基礎(chǔ)的給時(shí)者是光線的晝夜交替，而在北極圈和南極圈內(nèi)，極晝極夜存在的時(shí)間隨緯度升高而延長(zhǎng)。在南極和北極極點(diǎn)，1年中有一半的時(shí)間是極晝，一半時(shí)間是極夜；而在北極圈或南極圈(北緯或南緯66.5°)，只有夏至日和冬至日會(huì)出現(xiàn)完全的極晝和極夜。因此，在極圈內(nèi)棲息的生物，1年中會(huì)有一段時(shí)間缺乏光線對(duì)節(jié)律的誘導(dǎo)。然而，即使在極晝極夜期間，溫度或其他氣候條件也會(huì)隨時(shí)間有規(guī)律地變化，人們可能會(huì)觀察到由于溫度、食物、或非極晝極夜期間微弱的光線對(duì)內(nèi)源性節(jié)律的掩蔽效應(yīng)。北極的候鳥在極晝期間活動(dòng)是有節(jié)律的，南極原住民阿德利企鵝(Pygoscelisadeliae)在冬天也會(huì)保持進(jìn)食的節(jié)律[48]，北極地松鼠(Urocitellusparryii)在夏天能保持每天處于地面之上活動(dòng)節(jié)律[49, 50]。

雖然對(duì)于動(dòng)物活動(dòng)的觀察顯示，在極晝極夜的情況下部分生物還是保持了節(jié)律性，但不能因此推斷極晝極夜不影響內(nèi)源的節(jié)律。在極圈內(nèi)的不同緯度棲息的種群，在1年中不同的時(shí)期，也有可能具有不同的節(jié)律表型。例如，在79°N的緯度，全年檢測(cè)北極馴鹿(Rangifertarandus)的活動(dòng)性以及心跳、瘤胃溫度等生理指標(biāo)，會(huì)發(fā)現(xiàn)在極晝極夜期間，活動(dòng)性節(jié)律喪失，生理指標(biāo)的內(nèi)源性節(jié)律也大幅減弱，這意味著北極馴鹿會(huì)在極晝極夜期間會(huì)失去節(jié)律[51]；而在70°N，會(huì)由于這個(gè)緯度即使在“極夜”期間，也會(huì)有微弱的光線，導(dǎo)致其實(shí)并不存在真正的“極夜”，因此，在極夜期間也能保持晝夜節(jié)律[52]。

3.2 北極馴鹿的節(jié)律基因突變

一項(xiàng)研究對(duì)比了78°N和70°N的北極馴鹿(78°N的為Rangifertarandusplatyrhynchus，簡(jiǎn)稱SR；70°N的為R.tarandustarandus，簡(jiǎn)稱NR)的生物節(jié)律相關(guān)表型。這2種北極馴鹿都可以在1年中觀察到相對(duì)活躍與相對(duì)不活躍的次晝夜節(jié)律。然而，NR的節(jié)律是由光照周期控制的，SR幾乎不被光照控制。SR對(duì)光照的反應(yīng)、晝夜節(jié)律和同步化的社會(huì)活動(dòng)都很弱[53]。

2019年的一項(xiàng)研究揭示了這種區(qū)別的分子機(jī)制。正如前文所說，光信號(hào)誘導(dǎo)生物節(jié)律需要谷氨酸與受體結(jié)合，改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而導(dǎo)致下游信號(hào)通路的激活，引起CREB的磷酸化，再激活包括核心節(jié)律基因Per、Cry的部分節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄。通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)對(duì)馴鹿的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)與該通路相關(guān)的基因(Per2,Noct,Gria1,Grin2b,Grin2c,Itpr3,Adcy5,Nos1ap)在功能結(jié)構(gòu)域存在突變，4個(gè)基因(Adcy2,Adcy8,Calml4,Camk2)還顯示出了快速的進(jìn)化。Per2基因P1172 T的突變，使得Per2蛋白無法與Cry1蛋白有效結(jié)合，從而喪失了生物鐘核心環(huán)中的負(fù)反饋抑制作用，這是導(dǎo)致北極馴鹿喪失內(nèi)源性節(jié)律的主要原因。Gria1和Gria2基因編碼的是谷氨酸受體，是將光信號(hào)從視網(wǎng)膜傳遞到視交叉上核產(chǎn)生節(jié)律的關(guān)鍵。Itpr3編碼了鈣離子通道，Adcy、Camk2、Calmk4、Nos1ap則編碼了負(fù)責(zé)CREB磷酸化的蛋白質(zhì)?？傮w看來，在生物節(jié)律被光線同步化的信號(hào)通路中，每個(gè)環(huán)節(jié)都有基因在無節(jié)律的北極馴鹿中出現(xiàn)了突變與進(jìn)化(見Fig.3)[54]。

Fig.3 Mutations of the circadian rhythm genes and pathways in the reindeer Light regulates the molecular clockwork in reindeer SCN neurons. G, G protein; P, phosphorus; nNOS, neuronal nitric oxide synthase; ER, endoplasmic reticulum. Red, specific variant genes; blue, rapidly evolving genes. Adapted from Lin et al[54]

對(duì)于食草動(dòng)物來說，北極是1個(gè)十分極端的環(huán)境。1年當(dāng)中初級(jí)產(chǎn)量很低，只有在地面無雪、溫度相對(duì)較高的夏季，食草動(dòng)物才會(huì)獲得食物來源。北極的食草動(dòng)物依靠夏季積累身體的脂肪，為漫長(zhǎng)的寒冬提供能量?jī)?chǔ)備。因此，在極晝期間放棄晝夜節(jié)律、保持高度活躍、最大限度攝取能量的個(gè)體，會(huì)在自然選擇中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，這也是大量生物鐘基因在北極馴鹿中發(fā)生正向選擇的動(dòng)力。

3.3 極晝極夜對(duì)人類節(jié)律的影響

對(duì)于在南極和北極進(jìn)行科考工作的人來說，極晝和極夜也是影響晝夜節(jié)律，影響睡眠、代謝、情緒健康和工作效率的一大障礙。研究?jī)蓸O地區(qū)人類的晝夜節(jié)律出現(xiàn)的問題并想法改善，是十分有應(yīng)用價(jià)值的。

人們將冬季光線不足引起的心理障礙稱為季節(jié)性情緒失調(diào)(seasonal affective disorder，SAD)，而給予更長(zhǎng)時(shí)間的燈光來模擬夏季長(zhǎng)時(shí)間的光照則可以緩解這一癥狀。在兩極地區(qū)工作的人，在漫長(zhǎng)的極夜期間也會(huì)出現(xiàn)類似的情況。另外，對(duì)于極地工作人員尿液中褪黑素代謝物(6-sulfatoxymelatonin，aMT6s)的測(cè)量，以及對(duì)于睡眠-覺醒節(jié)律的監(jiān)測(cè)表明，在極夜的情況下，生物節(jié)律相位會(huì)推遲約1.5 h，且睡眠質(zhì)量會(huì)變差[55, 56]。2006年的一項(xiàng)研究表明，若將光照在4～5個(gè)周的周期內(nèi)用標(biāo)準(zhǔn)白光和富藍(lán)光的燈泡交替進(jìn)行，就可以顯著緩解由于極夜帶來的情緒和睡眠問題[21, 57]。

長(zhǎng)時(shí)間的黑暗環(huán)境下，生物體表現(xiàn)出的是其內(nèi)源性節(jié)律，在長(zhǎng)時(shí)間無光照進(jìn)行同步化的情況下，內(nèi)源性節(jié)律的周期并不是嚴(yán)格的24 h，因此相位可能逐漸發(fā)生偏移；而持續(xù)的光照會(huì)使哺乳動(dòng)物的生物鐘神經(jīng)元去同步化，從而導(dǎo)致行為上節(jié)律的喪失[20]。在極晝的環(huán)境下，若不對(duì)光照條件加人工干預(yù)，則會(huì)產(chǎn)生比極夜更加嚴(yán)重的影響。一項(xiàng)在加拿大軍事基地(位于北緯82.5°)開展的研究表明，由于士兵需要在極晝期間的夜晚時(shí)間在戶外值班，長(zhǎng)時(shí)間的光照信號(hào)抑制了松果體產(chǎn)生褪黑素，導(dǎo)致睡眠總時(shí)長(zhǎng)與同年冬季相比有明顯的下降，并出現(xiàn)入睡困難和認(rèn)知功能下降等癥狀；在值班結(jié)束光照條件允許休息情況下，士兵們?nèi)胨щy的現(xiàn)象仍然存在，無法得到充分的休息。該研究在2012年和2014年進(jìn)行了2次實(shí)驗(yàn)，由于2012年夏季的平均光照強(qiáng)度高于2014年夏季，士兵們?cè)?012年夏季的睡眠質(zhì)量明顯差于2014年。在2012年夏季，給予士兵褪黑素治療，主觀報(bào)告的入睡難易程度得到明顯的改善，但實(shí)際測(cè)量的睡眠質(zhì)量并無明顯區(qū)別[58]。

雖然隨著可穿戴式測(cè)量設(shè)備的普及，可以更加便捷地獲得人類受試者的睡眠、體溫、心率、活動(dòng)和血壓等長(zhǎng)期記錄節(jié)律的數(shù)據(jù)，但對(duì)于內(nèi)源性節(jié)律(例如生物鐘基因的表達(dá)和激素的分泌等)的測(cè)量仍無便捷的方法；另外，在兩極的極端環(huán)境下，開展生理和生化實(shí)驗(yàn)，尤其是針對(duì)人類受試者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是非常困難的。盡管可以在低緯度地區(qū)模擬極晝極夜的環(huán)境進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，目前的研究也仍然受到測(cè)量手段的限制，無法深入研究?jī)?nèi)源性節(jié)律的變化；另外，模擬環(huán)境光源與自然光源在波長(zhǎng)和光強(qiáng)上都有一定的差距，能否在低緯度地區(qū)較為準(zhǔn)確地模擬極晝極夜環(huán)境，從而得出科學(xué)合理的結(jié)論，仍有待商榷。通過高通量測(cè)序和一系列分子生物學(xué)手段逐步了解兩極的極端環(huán)境對(duì)動(dòng)物的自然選擇規(guī)律，對(duì)如何開展人類的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以及人類應(yīng)當(dāng)如何調(diào)整以適應(yīng)極地環(huán)境會(huì)提供一些啟示。

4 高海拔地區(qū)的生物節(jié)律

4.1 高海拔地區(qū)的生物節(jié)律研究概述

不同于極晝極夜帶來的光照條件變化對(duì)生物節(jié)律直接的影響，高原地區(qū)低氧、氣候多變、晝夜溫差大等特殊的自然環(huán)境，以及其特殊的生態(tài)結(jié)構(gòu)，使得高原地區(qū)的部分生物進(jìn)化出了獨(dú)特的晝夜節(jié)律。青藏高原、安第斯高原、埃塞俄比亞高原是最大的3個(gè)具有長(zhǎng)期居住人群的高海拔地區(qū)[59]，不少?gòu)倪M(jìn)化角度探索人類對(duì)于高海拔環(huán)境適應(yīng)的研究都會(huì)對(duì)比這3個(gè)地區(qū)的高原原住民具有的跟缺氧通路相關(guān)的基因多態(tài)性；這些高原上常見的哺乳動(dòng)物的行為和生理指標(biāo)也經(jīng)常是研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。

對(duì)于缺氧環(huán)境的適應(yīng)性以及生物節(jié)律的改變，3個(gè)地區(qū)的高原原住民的表型似乎不盡相同。安第斯高原居民的血紅蛋白濃度和血紅蛋白氧飽和度的百分比高于相同海拔的青藏高原居民。并有證據(jù)表明，埃塞俄比亞高原居民在這2方面與平原居民無區(qū)別。低氧介導(dǎo)的晝夜節(jié)律變化被認(rèn)為是高海拔低地居民睡眠片段化和睡眠質(zhì)量差的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，而埃塞俄比亞高原居民的睡眠質(zhì)量顯著優(yōu)于青藏高原居民和安第斯高原居民[59, 60]。

雖然目前的研究鎖定了HIF、VEGF、EPO等缺氧響應(yīng)基因以及血氧飽和度、血紅蛋白濃度等生理指標(biāo)在高原原住民當(dāng)中的進(jìn)化和自然選擇，然而，現(xiàn)有研究的問題是，基因多態(tài)性、生理上對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)、生物節(jié)律(包括體溫、睡眠等指標(biāo))的改變，幾乎都是分離的。若一直以人類或某些在高原地區(qū)棲息但難以捕捉、飼養(yǎng)和操作的野生動(dòng)物為對(duì)象展開研究，便會(huì)只能從現(xiàn)象上解釋現(xiàn)象，而很難把分子水平的進(jìn)化與生理水平的改變聯(lián)系起來，得出一個(gè)從基因到表型的完整結(jié)論。

4.2 高海拔地區(qū)生物潛在影響生物鐘的缺氧相關(guān)基因突變

由于眾多研究表明，生物鐘環(huán)路和缺氧信號(hào)通路存在功能上的和蛋白質(zhì)相互作用層面上的交叉，缺氧信號(hào)通路相關(guān)的基因突變很可能也會(huì)影響到生物節(jié)律。為了適應(yīng)高海拔地區(qū)的缺氧環(huán)境，多種生物在進(jìn)化過程中具有了與缺氧相關(guān)的獨(dú)特的表型，然而，不同高海拔地區(qū)的生物對(duì)于缺氧環(huán)境的適應(yīng)而做出的進(jìn)化也有所不同，例如青藏高原居民與安第斯山脈居民，在包括氧氣輸送過程的許多生理特征中有很大的數(shù)量差異。近10年來，隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在不同高原地區(qū)的各種哺乳動(dòng)物為了適應(yīng)缺氧環(huán)境而自然選擇出的基因多樣性逐漸被揭示。

對(duì)于安第斯高原居民的基因組分析顯示，至少有40個(gè)與缺氧通路以及缺氧相關(guān)的基因與高海拔環(huán)境的自然選擇相關(guān)[60]。而對(duì)于埃塞俄比亞高原居民來說，有更多發(fā)生在非典型的缺氧相關(guān)的基因上的自然選擇，而其中部分基因，就是既能調(diào)控缺氧相關(guān)基因的表達(dá)，又參與到生物鐘環(huán)路里的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子。DEC2(bHLHe41)就是其中之一[61]。HIF1a-ARNT蛋白二聚體是缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵激動(dòng)因子，而DEC2可以通過與HIF1a-ARNT相互作用，來抑制VEGF的轉(zhuǎn)錄。而DEC2又參與到許多生物鐘基因，或與睡眠、覺醒相關(guān)的神經(jīng)肽(例如食欲肽(orexin))的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中[62, 63]，在DEC2基因上的自然選擇或許就會(huì)帶來生物節(jié)律方面的改變。另一個(gè)在埃塞俄比亞高原居民中發(fā)現(xiàn)可能與缺氧適應(yīng)性和生物節(jié)律都相關(guān)的基因是ARNT2，正如前文所說，該基因也屬于bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子，存在和核心節(jié)律蛋白質(zhì)相互作用的可能。

對(duì)于青藏高原的人類及馬、狗等其他哺乳動(dòng)物來說，Epas1基因表現(xiàn)出最強(qiáng)的正向選擇的特征[64, 65]。在藏馬中，Epas1的2個(gè)錯(cuò)義突變有可能會(huì)與促進(jìn)血液循環(huán)的生理參數(shù)，以及缺氧條件下氧氣運(yùn)輸和消耗的血液密切相關(guān)。通過蛋白質(zhì)誘變的功能驗(yàn)證表明，這些突變?cè)黾恿薊pas1的穩(wěn)定性和對(duì)Arnt的異源二聚體親和性[66]。另一項(xiàng)研究中，人們首先測(cè)量了來自西藏和中國(guó)低海拔地區(qū)的鄉(xiāng)村狗的血紅蛋白水平，并發(fā)現(xiàn)兩組之間的血紅蛋白水平非常相似，這表明藏狗可能與藏人有相似的適應(yīng)策略。通過全基因組測(cè)序方法，確定了Epas1和Hbb是青藏高原缺氧適應(yīng)的候選基因。種群遺傳分析表明，西藏的人與狗之間存在顯著的趨同現(xiàn)象[67, 68]。Epas1蛋白與核心節(jié)律蛋白Bmal1存在相互作用，Epas1-Bmal1復(fù)合物在胚胎發(fā)育、軟骨生成中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[69]。影響Epas1基因表達(dá)量和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的突變極有可能通過其與Bmal1的相互作用，對(duì)生物節(jié)律產(chǎn)生一定的影響。

4.3 高原鼠兔的節(jié)律

除了南極北極之外，青藏高原被稱為地球上的“第三極”。高原鼠兔在青藏高原從海平面上隆起之前就已經(jīng)棲息于此地，因此，高原鼠兔的進(jìn)化過程會(huì)在一定程度上代表哺乳動(dòng)物逐漸適應(yīng)高原環(huán)境的過程。由于青藏高原是世界上海拔最高的高原，氧氣含量低；又因?yàn)楦咴笸檬乔嗖馗咴蠑?shù)量最多的哺乳動(dòng)物，說明它們是最適應(yīng)該地區(qū)生態(tài)特征的哺乳動(dòng)物[70]，它們常年生活在低溫、低氧的極端環(huán)境中，是研究低氧適應(yīng)的理想動(dòng)物模型。研究高原鼠兔的生物節(jié)律或許有助于理解高原哺乳動(dòng)物在低氧環(huán)境下的節(jié)律狀況，以及通過缺氧信號(hào)通路與生物鐘環(huán)路的相互作用，來解釋高原上的哺乳動(dòng)物為了適應(yīng)缺氧環(huán)境而在進(jìn)化上做出的改變。

有生態(tài)學(xué)研究對(duì)高原鼠兔進(jìn)行錄像，然后分析其活動(dòng)，認(rèn)為高原鼠兔屬于夜伏晝出的晝行性動(dòng)物，并且其活動(dòng)節(jié)律隨季節(jié)變化而不同[71]；又有研究表明，高原鼠兔的體溫和活動(dòng)是無晝夜節(jié)律的[70]。因此在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，人們對(duì)于高原鼠兔的節(jié)律性未達(dá)成統(tǒng)一的認(rèn)知。雖然活動(dòng)節(jié)律可以在很大程度上反映生物體的節(jié)律，但是在野生的環(huán)境下，活動(dòng)節(jié)律會(huì)受到光線、天氣、捕食者活動(dòng)等多方面因素的干擾，無法準(zhǔn)確反映出生物個(gè)體內(nèi)在的節(jié)律。因此，在冬季、春季和夏季分別在青藏高原捕捉了野生的高原鼠兔，并在位于青海省的實(shí)驗(yàn)室中(此處氧氣含量約為平原地區(qū)的60%)使用遙感發(fā)射機(jī)系統(tǒng)(telemetric transmitter system)同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)高原鼠兔在12 h燈光-12 h黑暗，以及全黑暗情況下的體溫節(jié)律和活動(dòng)節(jié)律，以全面探究高原鼠兔拋開外界環(huán)境影響后的內(nèi)在節(jié)律。結(jié)果表明，大于80%的高原鼠兔是無內(nèi)源性的生物節(jié)律的(或節(jié)律極弱)，而在相同環(huán)境下飼養(yǎng)超過20代的大鼠仍然保留了很強(qiáng)的生物節(jié)律。我們進(jìn)一步提取了無節(jié)律和少數(shù)有節(jié)律的高原鼠兔的成纖維細(xì)胞，并采用Per2-luciferase記錄細(xì)胞的節(jié)律，發(fā)現(xiàn)體溫活動(dòng)無節(jié)律的高原鼠兔細(xì)胞在離體狀態(tài)下仍然是無節(jié)律的，有節(jié)律的高原鼠兔細(xì)胞是有節(jié)律的，活動(dòng)和體溫的記錄與離體細(xì)胞的節(jié)律吻合，表明高原鼠兔或許從基因?qū)用姘l(fā)生了某些改變，導(dǎo)致從分子水平失去了內(nèi)源性的生物節(jié)律，而不是由于細(xì)胞或器官之間對(duì)于外界光線的感知和同步化出現(xiàn)問題而導(dǎo)致的無節(jié)律[72]。

雖然，一般認(rèn)為生物鐘能夠幫助生物體預(yù)測(cè)每天的溫度和食物來源隨時(shí)間的變化，以最大程度地節(jié)省能量來適應(yīng)晝夜交替的環(huán)境，但是在青藏高原的極端環(huán)境中，氣候變化無常，幾分鐘之內(nèi)的溫度變化就可以達(dá)到20 ℃；又由于高原鼠兔是青藏高原幾乎其他所有哺乳動(dòng)物的食物，天敵眾多，用內(nèi)源性生物鐘過于規(guī)律地“預(yù)測(cè)”晝夜的環(huán)境變化對(duì)于高原鼠兔來說反而成了可能致命的缺點(diǎn)。因此，在自然選擇中，不同于平原上的大多數(shù)生物，反而是無節(jié)律的高原鼠兔占據(jù)了優(yōu)勢(shì)。

4.4 Epas1剪接異構(gòu)體對(duì)高原鼠兔生物節(jié)律的影響

前文提到在我們的研究中，大多數(shù)高原鼠兔的內(nèi)源性節(jié)律是紊亂的。因此，我們克隆了高原鼠兔的核心節(jié)律基因，但發(fā)現(xiàn)其功能完全正常；對(duì)高原鼠兔進(jìn)行全基因組測(cè)序，也未發(fā)現(xiàn)核心節(jié)律基因特異性的突變。

考慮到在青藏高原的哺乳動(dòng)物大多數(shù)都是通過缺氧誘導(dǎo)因子及其下游調(diào)控的基因的進(jìn)化實(shí)現(xiàn)對(duì)高原缺氧環(huán)境的適應(yīng)，而缺氧誘導(dǎo)因子又可能與節(jié)律蛋白質(zhì)相互作用，從而影響生物節(jié)律，我們對(duì)這些可能存在物種特異性突變的基因進(jìn)行了深入的序列比對(duì)。在大多數(shù)高原鼠兔中，Epas1蛋白存在一段特異性的長(zhǎng)度為24個(gè)氨基酸的插入，這是由于在Epas1基因第14、15個(gè)外顯子之間存在1個(gè)G>A突變，導(dǎo)致mRNA剪切位點(diǎn)發(fā)生改變。有趣的是，在有節(jié)律的高原鼠兔中，同時(shí)存在2種Epas1基因，一種是帶有特異性突變和插入的“長(zhǎng)”的Epas1(L-Epas1)，一種是和其他哺乳動(dòng)物一致的“短”的Epas1(S-Epas1)(見Fig.4)。L-Epas1在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(global protein stability，GPS)中表現(xiàn)出顯著高于其他物種Epas1(包括高原鼠兔S-Epas1)的穩(wěn)定性。在小鼠的視交叉上核注射病毒過表達(dá)L-Epas1可以擾亂小鼠核心體溫的生物節(jié)律，而在無節(jié)律的鼠兔成纖維細(xì)胞中用shRNA敲降該L-Epas1可以顯著恢復(fù)細(xì)胞節(jié)律。

Fig.4 Multiple Epas1 splice variants differentially regulate pika rhythmicity A sequence alignment identified a unique insertion (in red) between Exon14 and Exon15 in the Plateau Pika Epas1 protein. The Plateau Pika-specific Epas1 insert identified is indicated with red. RT-PCR results showing that rhythmic pikas had both short and long isoform Epas1 sequences, and genomic PCR showing they are heterozygous at the G/A site. Adapted from Liu et al [72]

EMSA實(shí)驗(yàn)表明，Epas1和Bmal1可以形成異源二聚體，結(jié)合在節(jié)律基因啟動(dòng)子的E-Box元件上；而熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果表明，Epas1-Bmal1對(duì)于E-Box的激活能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Clock-Bmal1。免疫共沉淀的結(jié)果表明，L-Epas1和S-Epas1與Bmal1的結(jié)合能力并無差別，但S-Epas1由于不穩(wěn)定，或許無法在體內(nèi)生理?xiàng)l件下與Bmal1形成穩(wěn)定的二聚體。穩(wěn)定的L-Epas1蛋白與Bmal1形成二聚體后占據(jù)了本應(yīng)是Clock-Bmal1的位置，又無法有效激活下游基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致高原鼠兔的節(jié)律紊亂(見Fig.5)。

Fig.5 Work model for Plateau Pika L-Epas1 to disrupt circadian clock In low altitude mammals, the Epas1 protein is soon degraded after its translation because of its instability. However, in plateau pika, the stabilized L-Epas1 can accumulate and dimerize with Bmal1 to form a heterodimer, whose trans-activation ability is lower than Clock-Bmal1, resulting in a decreased regulation of Clock-Bmal1 at E-box loci, and thus disrupt the circadian rhythm

該特異性的點(diǎn)突變不僅使得大多數(shù)高原鼠兔喪失了節(jié)律，通過將高原鼠兔L-Epas1基因敲入小鼠基因組，我們發(fā)現(xiàn)，這還提升了小鼠對(duì)于低氧環(huán)境的耐受能力，在低氧條件下體重的損失、心血管受到的損傷均顯著低于野生型小鼠[72]。

因此，這種穩(wěn)定的Epas1突變體有可能是高原鼠兔在青藏高原漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中，被自然選擇留下，既能適應(yīng)高原變幻無常的天氣和隨處可見的天敵，又能適應(yīng)高原低氧環(huán)境的突變，這種看似反常的無節(jié)律反而成了高原鼠兔適應(yīng)極端生存環(huán)境的關(guān)鍵。

5 沙漠中的晝夜節(jié)律

在干旱的沙漠中，動(dòng)物通常面臨著極其惡劣的生存環(huán)境。與天氣變化無常、幾分鐘之內(nèi)氣溫變化可高達(dá)20 ℃的高原不同，沙漠中白天炎熱晚上寒冷。沙漠中白天的平均氣溫為38 ℃，夜晚的平均氣溫則可以低至-3.9 ℃，一天之內(nèi)的溫差可以高達(dá)30 ℃。除了要適應(yīng)白天黑夜的光線變化外，沙漠中的動(dòng)物還需要及時(shí)調(diào)整自己的狀態(tài)，來應(yīng)對(duì)巨大的晝夜溫差，因此，沙漠動(dòng)物必須具有很好的生物節(jié)律，環(huán)境溫度成了許多在沙漠中生存的動(dòng)物形成晝夜節(jié)律的主要線索。

沙漠甲蟲(TrigonoscelisgigasReitt)是一種在生態(tài)學(xué)和空間生物學(xué)中研究晝夜節(jié)律用的模式生物。野外觀察其節(jié)律，可以發(fā)現(xiàn)沙漠甲蟲具有早晚2個(gè)活動(dòng)高峰。由于白天氣溫極高，沙漠甲蟲會(huì)鉆入很深的沙土中，等到傍晚降臨、氣溫下降時(shí)，沙漠甲蟲又會(huì)回到地面活動(dòng)[73]。然而，在沙土中，是沒有光線這個(gè)給時(shí)者的，而且溫度也是恒定的(所以才會(huì)用來“避暑”)，因此，沙漠甲蟲回到地面的行為是由內(nèi)源性節(jié)律決定的。沙漠甲蟲早晨和傍晚的活動(dòng)有可能是由2個(gè)單獨(dú)的節(jié)律發(fā)生器所控制(類似于果蠅中的“晨細(xì)胞”和“昏細(xì)胞”分別控制果蠅天亮前和天黑前的活動(dòng)高峰)，這2種節(jié)律發(fā)生器雖然可以在黑暗條件下保持較長(zhǎng)時(shí)間(30～40 d)的自主節(jié)律，仍是需要定期地被外界環(huán)境同步化，否則2個(gè)活動(dòng)高峰最終會(huì)在70～80 d后逐漸由于相位移動(dòng)而沖突，導(dǎo)致沙漠甲蟲個(gè)體的活動(dòng)失去節(jié)律[74]。

沙漠中常見的沙漠鬣蜥(Dipsosaurusdorsalis)[75]、格氏懼蝎(Pandinusgregoryi)、斑馬扁石蝎(Hadogenesbicolor)[76]等，都被發(fā)現(xiàn)具有較好的節(jié)律性。

有研究測(cè)試了沙漠中的山羊的生物節(jié)律。在持續(xù)黑暗和溫度恒定的環(huán)境下，山羊的內(nèi)源性體溫和活動(dòng)節(jié)律分別以25.3 h和25 h為周期。若以24 h為周期的溫度變化在全黑暗條件下誘導(dǎo)，山羊的體溫和活動(dòng)也會(huì)呈現(xiàn)和溫度變化一致的、以24 h為周期的節(jié)律。若將誘導(dǎo)的溫度變化規(guī)律進(jìn)行顛倒，山羊的活動(dòng)和體溫變化相位也會(huì)隨之顛倒。褪黑素分泌的節(jié)律也會(huì)以相同的規(guī)律被溫度變化周期所誘導(dǎo)，在溫度降低時(shí)，褪黑素就會(huì)開始分泌[77]。在單峰駱駝中，人們也做過類似的研究，得出了相同的結(jié)論。然而，若在12 h光照-12 h黑暗的條件下進(jìn)行該研究，則大多數(shù)駱駝的節(jié)律還是以光照為準(zhǔn)[78]。這也進(jìn)一步說明，在哺乳動(dòng)物中，雖然環(huán)境溫度的調(diào)節(jié)也很重要，但光線仍是占據(jù)了生物節(jié)律的誘導(dǎo)的主要地位。

6 “星辰大?！薄蛭粗獏^(qū)域的生物節(jié)律進(jìn)發(fā)

6.1 深海中的生物節(jié)律

海洋可分為上層(海平面下0～200 m)、中層(海平面下200～1 000 m)、深層(海平面下1 000～4 000 m)、深淵(海平面下4 000～6 000 m)和超深淵(海平面6 000 m以下)幾個(gè)區(qū)域，而地球表面超過70%區(qū)域都是深度超過200 m米的海洋。由于海水的折射和吸收作用，在深層及以下區(qū)域都檢測(cè)不到光線的存在，而在上層和中層，也只有波長(zhǎng)為480 nm的藍(lán)光可以毫無變化地存在于海水中[79]。因此，在陸地上最常見的晝夜節(jié)律誘導(dǎo)因素，在海洋中幾乎是缺失的。然而，在海洋中，也存在著如內(nèi)潮和慣性流等以天或半天為周期變化的潮汐節(jié)律(因此分為全日潮和半日潮)。這些潮汐會(huì)使水中的浮游生物和硫化物、甲烷等化學(xué)物質(zhì)隨著水流被搬運(yùn)到其他區(qū)域，從而產(chǎn)生規(guī)律的濃度的變化，這對(duì)于海洋生物來講是最直接的“給時(shí)者”[80]。

隨著近幾年深海觀測(cè)站的發(fā)展，人們更加直接地觀測(cè)到海洋中生物運(yùn)動(dòng)的節(jié)律，也能結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)來分析海洋中生物節(jié)律基因的進(jìn)化與表達(dá)情況。2011年，2個(gè)深海觀測(cè)站在大西洋和東北太平洋建立并運(yùn)行，重點(diǎn)關(guān)注熱液噴口生態(tài)。2個(gè)生態(tài)模塊共同記錄了23天(2011年10月7日至30日)的圖像和環(huán)境變量，以及長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月(2011年10月至2012年6月)的環(huán)境變量?；趫D像分析評(píng)價(jià)了群落動(dòng)態(tài)，揭示了動(dòng)物群和環(huán)境的時(shí)間變化節(jié)律。太平洋和大西洋熱液噴口之間的潮汐節(jié)律發(fā)生有6 h的滯后，這與2個(gè)噴口之間的地理距離和時(shí)間延遲相對(duì)應(yīng)[80]。2020年，人們對(duì)大西洋中脊1 688米深處的熱液噴口進(jìn)行了觀測(cè)，記錄到以約12 h為周期變化的壓強(qiáng)和海水溫度，同時(shí)對(duì)該區(qū)域的貽貝(Bathymodiolusazoricus)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，檢測(cè)到了具有周期為10.4～14.4 h，以及20～24.8 h的節(jié)律基因。同時(shí)，在貽貝中，也存在傳統(tǒng)節(jié)律基因Clock，Per，Cry1等的同源基因，但這些基因在野生和實(shí)驗(yàn)室條件下，都并未真正地表現(xiàn)出與傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物或昆蟲生物鐘基因類似的節(jié)律性[81]。

除浮游生物和最常見的硫化物之外，珊瑚礁上的環(huán)境二氧化碳分壓也會(huì)發(fā)生晝夜節(jié)律性波動(dòng)。在一項(xiàng)對(duì)于常見的巖礁魚類(Acanthochromispolyacanthus和Amphiprionpercula)的研究中，在CO2分壓恒定與呈節(jié)律性波動(dòng)的情況下，巖礁魚節(jié)律基因表達(dá)及整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)模式有明顯的區(qū)別；不同CO2分壓下的節(jié)律基因表達(dá)也會(huì)有所不同。節(jié)律性波動(dòng)CO2水平也是誘導(dǎo)海洋生物節(jié)律的因素之一[82]。近年來，CO2排放逐漸增加，已經(jīng)達(dá)到了可以使海洋酸化的程度，海洋生物的生理狀況也會(huì)因此受到影響。海洋酸化和變暖顯著影響了貽貝的代謝(清除率、耗氧率、氨排泄率、O:N比、ATP含量、丙酮酸激酶活性和代謝相關(guān)基因表達(dá))，導(dǎo)致能量供應(yīng)不足(ATP在體內(nèi)含量)。此外，暴露于酸化和變暖的環(huán)境中，貽貝的節(jié)律(心率的節(jié)律以及Per2，Cry1和Bmal1的表達(dá)節(jié)律)和神經(jīng)遞質(zhì)的分泌(乙酰膽堿酯酶活性和體內(nèi)乙酰膽堿、γ-氨基丁酸和多巴胺含量)顯著被破壞[83]。測(cè)量在不同CO2暴露水平下橄欖沙鱸幼魚(Paralichthysolivaceus)血漿中Cry1和Per2的水平變化，以及褪黑素分泌的變化，可以發(fā)現(xiàn)，CO2暴露會(huì)使生物節(jié)律產(chǎn)生相位后移和相位逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[84]。由此可見，海水酸化對(duì)于海洋生物的節(jié)律會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，這會(huì)嚴(yán)重影響海洋生物的生存，對(duì)海洋生態(tài)平衡產(chǎn)生威脅。

6.2 太空中的生物節(jié)律

近年來，隨著我國(guó)航空航天技術(shù)的發(fā)展和空間站的建造，太空上的生活逐漸受到越來越多人的關(guān)注，而研究太空中的生物節(jié)律，對(duì)宇航員提高睡眠質(zhì)量、維持健康的身體狀態(tài)具有重要意義。早在1976年，一項(xiàng)在空間實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的研究就表明，飛行中會(huì)出現(xiàn)快速動(dòng)眼睡眠提高的現(xiàn)象[85]；1993年，人們?cè)谝凰臆壍里w行器上進(jìn)行了一項(xiàng)評(píng)估睡眠和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的研究。在軌道上，24 h的給時(shí)者影響減弱，這可能導(dǎo)致晝夜節(jié)律相位延遲，并有可能過渡到只由內(nèi)源性生物鐘控制的自由運(yùn)行的晝夜節(jié)律。這一點(diǎn)和太空任務(wù)的特定壓力源可能會(huì)導(dǎo)致超睡眠調(diào)節(jié)的改變，以及睡眠時(shí)長(zhǎng)和質(zhì)量的降低。在執(zhí)行任務(wù)期間，記錄了睡眠和體溫，并通過情緒問卷對(duì)白天的警覺性進(jìn)行主觀評(píng)定。為了進(jìn)行比較，在空間任務(wù)之前測(cè)量了相同的參數(shù)。與之相比，在太空中體溫和警覺性的晝夜節(jié)律延遲，睡眠時(shí)間更短，更容易受干擾；睡眠結(jié)構(gòu)明顯改變，在太空中快速眼動(dòng)潛伏期較短[85, 86]。2012年，人們將研究生物鐘常用的模式生物脈胞菌帶上了太空。雖然部分菌株的晝夜節(jié)律可以保持和在地球上一致，但許多樣品出現(xiàn)了節(jié)律減弱，甚至節(jié)律喪失的情況[87]。除光照外，太空中的微重力環(huán)境對(duì)晝夜節(jié)律也可能產(chǎn)生影響。在飛行任務(wù)中，恒河猴的體溫節(jié)律振幅降低和相位改變，在實(shí)驗(yàn)室的微重力環(huán)境模擬研究中，大鼠的體溫和活動(dòng)節(jié)律也隨著重力的變化而變化，但這種變化并不是呈線性相關(guān)的。處于模擬失重環(huán)境中的小鼠和細(xì)胞的節(jié)律基因Bmal1的表達(dá)相位和振幅同樣會(huì)發(fā)生改變[88]。目前，光線是太空中最容易誘導(dǎo)航天員節(jié)律的因素，因此，有研究通過不同光強(qiáng)[89]和周期[90]的光線下人類的睡眠節(jié)律以及褪黑素分泌的節(jié)律性，發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)都會(huì)被不同的光照條件所誘導(dǎo)和同步化。然而,直到近幾年，雖然測(cè)量手段和準(zhǔn)確度在不斷優(yōu)化，也根據(jù)先前的經(jīng)驗(yàn)對(duì)宇航員進(jìn)行了光照治療和褪黑素干預(yù)等措施來試圖改善宇航員的睡眠和晝夜節(jié)律，但并未見明顯的效果；在太空中進(jìn)行的研究也仍停留在檢測(cè)睡眠、心率、警覺度等行為和生理指標(biāo)。理解人體在太空中發(fā)生的變化仍然還有較長(zhǎng)的路要走。在未來的研究中，應(yīng)當(dāng)建立更可靠的動(dòng)物模型，進(jìn)行更加深入和全面的研究；在調(diào)整空間站環(huán)境時(shí)，從光照、重力、作息時(shí)間等多個(gè)方面全面模擬地球環(huán)境，考慮環(huán)境對(duì)生物節(jié)律直接和間接的影響，而不是單純改變直接影響晝夜節(jié)律的光照和作息等因素，可能會(huì)對(duì)于改善航天員的晝夜節(jié)律有所幫助。

7 問題與展望

本文總結(jié)了光線、氧氣含量、外界溫度這3種環(huán)境因素對(duì)生物節(jié)律的影響，并以兩極地區(qū)、高原、沙漠、深海和太空這幾種極端環(huán)境為例，綜述了環(huán)境對(duì)生物活動(dòng)節(jié)律和內(nèi)源性節(jié)律的影響，以及極端環(huán)境長(zhǎng)期對(duì)節(jié)律相關(guān)表型和基因的自然選擇。晝夜變換的光線是生物節(jié)律產(chǎn)生的基礎(chǔ)，也是可以最廣泛地調(diào)節(jié)并同步化從個(gè)體到各個(gè)器官組織節(jié)律的因素。對(duì)于大多數(shù)生物而言，喪失節(jié)律性的光照條件會(huì)導(dǎo)致睡眠、代謝、激素分泌等生理功能發(fā)生紊亂，不利于生存。在極夜期間給予一點(diǎn)“骨架性”的短暫光刺激便可以改善晝夜節(jié)律。而這種環(huán)境也通過基因突變逐漸選擇出了本身就無節(jié)律的個(gè)體，這樣的個(gè)體可以更加適應(yīng)無光照節(jié)律的生存環(huán)境。氧氣是地球上絕大多數(shù)生物生存所必需的，高原上的低氧環(huán)境選擇出了缺氧通路具有突變的個(gè)體，從而降低了心肺功能在低氧條件下受到的損傷。缺氧誘導(dǎo)因子本身就與生物節(jié)律通路相互作用密切，受到生物節(jié)律的調(diào)控同時(shí)也影響著生物節(jié)律。因此，相關(guān)的突變必然會(huì)間接影響到節(jié)律功能。另外，由于高原上天氣變化無常，過于規(guī)律的晝夜節(jié)律也不利于生存，這導(dǎo)致了無節(jié)律的高原鼠兔在青藏高原的極端環(huán)境下，得以大規(guī)模繁殖和正常存活。溫度作為不可忽視的外界環(huán)境條件，對(duì)晝夜節(jié)律也有一定的誘導(dǎo)作用。與前2種晝夜節(jié)律帶來的生存壓力的極端情況相比，在沙漠中，規(guī)律的晝夜節(jié)律可以幫助生物預(yù)測(cè)巨大的晝夜溫差，從而及時(shí)調(diào)整自己的狀態(tài)來迎接炎熱或寒冷。

在各種極端環(huán)境下，生物節(jié)律是否有利于生存是不確定的。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段的普及，可以更好地對(duì)極端環(huán)境下生存的生物進(jìn)行基因和分子層面的研究，找到它們適應(yīng)極端環(huán)境的機(jī)制。自然選擇雖然有時(shí)并未直接作用于典型的生物節(jié)律基因，但可能通過某些信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制間接作用于生物節(jié)律環(huán)路。從生物節(jié)律的角度思考生物對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)，可以為處在極端環(huán)境中的工作人員如何調(diào)節(jié)身體狀況，以更好地適應(yīng)環(huán)境提供新的思路。另外，目前常用的模式生物都是平原地區(qū)常見的物種，缺乏在極端環(huán)境下的模式生物，這導(dǎo)致很多研究只能停留在生態(tài)學(xué)或野生動(dòng)物行為學(xué)的觀察方面，準(zhǔn)確性和可重復(fù)性不高。更重要的是，無法進(jìn)行更加精細(xì)的研究來檢測(cè)基因和分子水平上的變化。若能找到既適應(yīng)了當(dāng)?shù)丨h(huán)境，又便于操作的極端環(huán)境下的模式生物，或許可以更加方便地進(jìn)行深入研究，可以為人類在極端環(huán)境下的某些疾病的發(fā)生機(jī)制與預(yù)防治療提供重要參考。