王麗蓉，杜 萌，易 丹，王 博，楊鑫光，李 毅*

(1 青海民族大學(xué) 青海省特色經(jīng)濟(jì)植物高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，蘭州 730070；3 青海民族大學(xué) 青藏高原生態(tài)環(huán)境研究所，西寧 810007；4 青海民族大學(xué) 青藏高原資源化學(xué)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007；5 青海民族大學(xué) 土地資源勘測(cè)與規(guī)劃實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007；6 青海民族大學(xué) 青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007)

油菜素內(nèi)脂(brassolidin，BR)是植物特有的類固醇激素[1]，它在調(diào)節(jié)植物的細(xì)胞伸長(zhǎng)與分裂、發(fā)育、感光、衰老以及抗逆性等方面起著重要作用[2-6]。BR信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)始于BR與細(xì)胞質(zhì)膜上受體蛋白的結(jié)合，通過磷酸化反應(yīng)將信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)，繼而細(xì)胞內(nèi)BR通路上的負(fù)調(diào)控蛋白被抑制，同時(shí)正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子BRI1-EMS-suppressor 1(BES1)被激活并進(jìn)入細(xì)胞核中與其他轉(zhuǎn)錄因子以及輔酶因子結(jié)合，作用于靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控[6]。研究表明能被BES1調(diào)控的基因有5 000～8 000種[6-9]，其中大部分被誘導(dǎo)，少部分被抑制，被誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子區(qū)包含一個(gè)E-Box (CANNTG)結(jié)構(gòu)域，而被抑制基因的包含一個(gè)BR響應(yīng)元件BRRE [CGTG(T/C)G][6-7]。BES1除參與BR通路的調(diào)控活動(dòng)外，還參與多種應(yīng)激活動(dòng)，并在不同植物中呈現(xiàn)出多樣化的功能[6-7,10-15]。隨著研究的不斷拓展，BES1及其家族已從越來越多的物種中被鑒定出來。目前從擬南芥、玉米、小麥、番茄、大白菜、甘藍(lán)型油菜、馬鈴薯和棉花中分別鑒定出8、11、15、9、15、29、9和22個(gè)BES1家族成員[16-23]。這些BES1與BZR1、BEH1～BEH4同源，均具有一個(gè)高度保守的非典型堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(bHLH)，是典型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。然而無論是直系還是旁系同源成員在結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、作用機(jī)制以及脅迫下的表達(dá)模式上均存在差異[6,12,16-23]。

干旱和鹽脅迫是植物在生長(zhǎng)發(fā)育中最常遇到的非生物脅迫。一些學(xué)者對(duì)BES1與耐旱或耐鹽性的關(guān)系展開了研究：在棉花幼苗中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下BES1能響應(yīng)外源噴施的油菜素內(nèi)酯，并能提高棉花的抗旱能力[24]；在馬鈴薯的研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)馬鈴薯的SlBZR1D基因能夠增強(qiáng)擬南芥轉(zhuǎn)基因株對(duì)BR的響應(yīng)并能提高轉(zhuǎn)基因株的耐鹽性，還發(fā)現(xiàn)SlBZR1D對(duì)馬鈴薯植株的耐鹽性具有正向調(diào)控作用[19]。另外，研究者們還對(duì)BES1在干旱或鹽脅迫下的作用機(jī)制展開了研究，其中包括BES1可調(diào)控獨(dú)腳金內(nèi)酯主導(dǎo)的擬南芥對(duì)干旱的轉(zhuǎn)錄記憶[25]；一些學(xué)者還對(duì)BES1協(xié)調(diào)BR誘導(dǎo)的生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆的平衡機(jī)制展開了研究，發(fā)現(xiàn)BES1與WRKY協(xié)作可抑制干旱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)；TINY聯(lián)合TINY2/3可通過與BES1發(fā)生拮抗作用來協(xié)調(diào)生長(zhǎng)與脅迫響應(yīng)[6]；BES1在干旱中可通過DSK2調(diào)控的選擇性自噬作用被降解，從而抑制BR調(diào)控的生長(zhǎng)[6]；RD26可通過抑制BES1的活性來提高對(duì)干旱的響應(yīng)[6]。此外，目前對(duì)BES1在干旱或鹽脅迫下表達(dá)模式的報(bào)道較多，并且不同植物、不同成員對(duì)脅迫的響應(yīng)存在差異：在干旱處理下，茶樹的CsBES1-2～CsBES1-9的表達(dá)量顯著提高[16]；小麥的3個(gè)成員BES1d1、2、3在PEG或者干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)，而剩余成員無響應(yīng)[18]；在棉花中，BR誘導(dǎo)的GhBES1在干旱脅迫下能夠快速表達(dá)[22]；在楊樹中，PeBZR1在干旱脅迫下被抑制，但在鹽脅迫下表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定[22]；馬鈴薯的9個(gè)BES1成員中，StBES1-2、6、8均能受到干旱誘導(dǎo)而上調(diào)，8個(gè)StBES1成員能受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，而StBES1-4、StBES1-7和StBES1-9分別在干旱和鹽脅迫下表達(dá)下調(diào)[22]；辣椒的BES1基因則對(duì)鹽脅迫誘導(dǎo)不敏感[26]。BES1在不同植物中對(duì)干旱和鹽脅迫不同的響應(yīng)模式證明BES1成員在耐旱和耐鹽過程中發(fā)揮多種不同的作用。

白刺，又名唐古特白刺(Nitrariatangutorum)，為蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(Nitraria)第三紀(jì)孑遺灌木，在中國主要分布于西北干旱半干旱地區(qū)以及東部沿海鹽漬化地區(qū)[27]。白刺被譽(yù)為沙漠櫻桃，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和飼用價(jià)值，還可為中藥鎖陽提供寄居環(huán)境，因此它具有很高的經(jīng)濟(jì)開發(fā)潛力[28-30]。除此之外白刺還具有很強(qiáng)的耐干旱、鹽堿以及防風(fēng)固沙的能力，是中國荒漠半荒漠地區(qū)群落的建群種[31]。目前，對(duì)白刺的抗逆機(jī)理從表型和分子層面展開了一系列研究[31-41]，其中，抗逆分子機(jī)理研究主要是對(duì)一些抗逆基因如14-3-3、NtCBL1等在干旱或鹽脅迫下表達(dá)特征的分析[36-37]，或者對(duì)一些抗逆基因如NHX、CIPK11等的生理功能驗(yàn)證的研究[38-39]；另外還有一些研究是基于大數(shù)據(jù)組學(xué)對(duì)白刺群體基因或代謝物在干旱或鹽脅迫下的變化規(guī)律展開的研究[40-41]，本實(shí)驗(yàn)室已測(cè)的白刺在干旱脅迫和鹽脅迫下混合樣品的三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)：SAMN16709478)中就發(fā)現(xiàn)了一批BES1的轉(zhuǎn)錄本，說明白刺的BES1在干旱或鹽脅迫下會(huì)表達(dá)，它們可能在白刺耐干旱或耐鹽過程中發(fā)揮作用。如上文所述，BES1轉(zhuǎn)錄子家族在植物耐干旱和耐鹽中發(fā)揮重要作用并且功能多樣[1,3,7,16,22]，白刺作為耐干旱和鹽堿的代表性植物對(duì)其BES1基因的研究十分必要。以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)(SMRT)為代表的三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，在測(cè)序深度和精度上均優(yōu)于二代技術(shù)，它能提供更為準(zhǔn)確和豐富的物種基因組背景信息[42]。本研究以白刺全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，首先鑒定出BES1轉(zhuǎn)錄因子家族成員，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)它們的理化性質(zhì)及功能，分析它們的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；利用熒光定量PCR分析家族基因在不同脅迫下的表達(dá)模式，以期為后續(xù)深入研究白刺BES1家族成員的功能以及白刺耐干旱或耐鹽等抗逆分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

白刺果實(shí)于2019年8月采自青海省格爾木市諾木洪農(nóng)場(chǎng)，經(jīng)揉搓清洗后獲得實(shí)驗(yàn)所需種子，之后將種子冷藏于4 ℃?zhèn)溆?。?dāng)年10月，種子用75%酒精浸泡30 s后用無菌水清洗3遍，種于裝有河沙(清洗并高溫消毒)的小花盆中。播種后，將花盆置于培養(yǎng)間培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照18 h，黑暗6 h，白天溫度(26±1)℃，夜晚溫度(22±1)℃，相對(duì)濕度60%～70%。每3 d向花盆底部托盤中灌入蒸餾水至沙子完全浸濕。

2個(gè)月后選取生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的白刺幼苗并移至1/2霍格蘭(Hoagland)營(yíng)養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件同上，水中全天充氧。適應(yīng)培養(yǎng)3 d后，將材料移至用營(yíng)養(yǎng)液配制的處理液中進(jìn)行脅迫處理。干旱脅迫用不同濃度(10%和30%)PEG營(yíng)養(yǎng)液模擬，處理2、12、24 h后取樣；鹽脅迫用2個(gè)濃度(200和450 mmol/L)NaCl營(yíng)養(yǎng)液，處理2、12、24和48 h后取樣，每3株苗為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，收集全部葉片后迅速放入液氮中，之后放入-80 ℃冰箱保存待用。以營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的植株為對(duì)照(即處理 0 h)。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

1.2.1 家族成員鑒定利用本實(shí)驗(yàn)室已獲取的白刺三代轉(zhuǎn)錄組的注釋信息初篩得到了24條BES1家族轉(zhuǎn)錄本序列，除去重復(fù)序列后，用DNAMAN V6.0 將轉(zhuǎn)錄本序列翻譯成氨基酸序列并放入Pfam(http://pfam.xfam.org/)在線軟件和NCBI的CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析[16]，通過與2個(gè)數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，去除不含有BES1_N保守結(jié)構(gòu)域的序列，之后利用本地的CDS(Coding Sequence)數(shù)據(jù)庫和ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線軟件共同預(yù)測(cè)白刺BES1蛋白序列CDS的完整性，去除不完整的序列，最終序列鑒定為白刺N(yùn)tBES1蛋白序列[43]。

1.2.2 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析利用ExPASy在線程序ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析白刺N(yùn)tBES1序列的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)和親疏水性[16]；利用在線軟件PSORT(http://www.psort.org/)預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位；利用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過在線工具NetPhos3.1Servert(/www.cbs.dud/servicesNetPhos/)對(duì)蛋白的磷酸化位點(diǎn)蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)和酪氨酸(Y)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[43]。

1.2.3 保守基序及保守結(jié)構(gòu)域的分析利用DNAMAN V6.0對(duì)白刺的NtBES1氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，獲得BES1_1保守序列。利用在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/)分析蛋白序列的保守基序motif[44]，經(jīng)驗(yàn)證基序最多值設(shè)置為10，其余為默認(rèn)值，利用TBtools工具對(duì)導(dǎo)出的MEME文本結(jié)果進(jìn)行分析并繪制保守基序圖[3]。

1.2.4 進(jìn)化樹的構(gòu)建基于上述多序列比對(duì)后的氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件[44]，采用鄰接法(bootstrap 1 000)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹；用相同方法建立白刺與擬南芥(8條)、水稻(6)、玉米(11條)等物種BES1氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 熒光定量PCR總RNA按RNAprep Pure Plant Kit RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，北京)的說明在低溫?zé)o菌條件下提取。cDNA利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa北京寶生物公司，北京)合成，反轉(zhuǎn)錄過程按照說明進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄程序：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(37 ℃，15 min)；反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)(85 ℃，5 s)；4 ℃保存。利用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa北京寶生物公司，北京)進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。使用ABI Stepone Plus熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific 公司，新加坡)檢測(cè)樣品的CT值。首先將cDNA稀釋至1/10原濃度備用，qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×conc.) 10 μL，cDNA模板2.5 μL，正反向引物各0.8 μL(10 μmol/L)，ddH2O 5.5 μL，ROX 0.4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)，設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。特異性引物由Primer在線軟件(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)設(shè)計(jì)，特異性引物序列如表1所示。內(nèi)參基因?yàn)镋F1α基因。預(yù)實(shí)驗(yàn)以CK、30% PEG-2 h和450 mmol/L NaCl-24 h的RNA為模板，分析各個(gè)基因引物的溶解曲線及CT值，選取表達(dá)量相對(duì)較高的成員進(jìn)行后續(xù)分析。利用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因在不同處理中的相對(duì)表達(dá)量[16]。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 The primers used in qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010和SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。One-way ANOVA單因素方差分析方法用于分析不同處理間的差異顯著性[36]。

2 結(jié)果與分析

2.1 家族成員及其理化性質(zhì)

通過篩選、鑒定，從白刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共獲得7條均具有完整CDS的BES1序列，命名為NtBES1-1～NtBES1-7。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示(表2)：白刺的7條NtBES1蛋白序列的氨基酸數(shù)目在86 aa(NtBES1-4)～422 aa(NtBES1-6)之間，分子量在9.75 kD(NtBES1-4)～47.53 kD(NtBES1-6)之間，理論等電點(diǎn)在5.29(NtBES1-5)～10.22(NtBES1-4)之間，不穩(wěn)定指數(shù)范圍在34.88(NtBES1-1)～75.02(NtBES1-7)之間。平均親水系數(shù)均為負(fù)值，表明這些蛋白均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示NtBES1-6定位在細(xì)胞質(zhì)中，其余的成員均被定位在細(xì)胞核中。

表2 白刺N(yùn)tBES1基因家族成員理化性質(zhì)Table 2 The physic-chemical characters of NtBES1 family members in N. tangutorum

對(duì)7個(gè)NtBES1蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有蛋白中絲氨酸的數(shù)目最多，酪氨酸數(shù)目最少。NtBES1-4中的每類氨基酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)目均是最少的，總共有9個(gè)磷酸化位點(diǎn)，NtBES1-2中的最多，有45個(gè)，且最多的是絲氨酸，NtBES1-6中具有最多的酪氨酸(表3)。

表3 白刺N(yùn)tBES1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of NtBES1 protein phosphorylation sites in N. tangutorum

2.2 保守結(jié)構(gòu)

對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所有的序列均具有完整bHLH結(jié)構(gòu)的BES1_N保守結(jié)構(gòu)域(圖1)[3]。保守基序分析結(jié)果顯示，NtBES1家族成員共包含10種基序，每個(gè)成員所含基序的數(shù)量和種類存在一定的差異但是至少包含一個(gè)Motif1(BES1_N結(jié)構(gòu)域)。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)GroupI、GroupⅡ和GroupⅢ中的蛋白在保守基序組成上存在明顯差異，而同一組成員的基序組成十分相似(圖2，B)：GroupI的3個(gè)蛋白(NtBES1-2、NtBES1-3、NtBES1-7)均含有Motif6、Motif8、Motif9、Motif7和Motif10；GroupⅢ的3個(gè)蛋白(NtBES1-1、NtBES1-5、NtBES1-6)均含有Motif5且至少包含一個(gè)糖基水解酶保守結(jié)構(gòu)域(Glyco_hydro_14，Motif2或Motif3)。

圖1 白刺N(yùn)tBES1家族蛋白的BES1_N 結(jié)構(gòu)域Fig.1 The BES1_N domain of NtBES1 family proteins in N. tangutorum

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

基于白刺和擬南芥等8種植物的BES1蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 3)分為三組，分組結(jié)果與它們單獨(dú)分組(圖2，A)的基本一致：Group A對(duì)應(yīng)GroupⅠ；GroupⅠ和NtBES1-4被聚在另外一大組Group B中，在組內(nèi)NtBES1-4又單獨(dú)成一支。物種間相似度高的成員組合包括：NtBES1-2與AtBES1-4，NtBES1-3與AtBES1-1、AtBES1-7，NtBES1-7與MtBES1-8，NtBES1-5與AtBES1-8，NtBES1-1、NtBES1-6與CaBES1-2和SIBES1-1。被聚類的三組中僅有Group C中沒有分布NtBES1的任何成員，分布的物種均為單子葉植物的成員：ZmBES1-6、OsBES1-6、CaBES1-8以及SIBES1-8，這些家族成員可能是單子葉植物和雙子葉植物分化后在單子葉植物中進(jìn)化出的。

圖2 白刺N(yùn)tBES1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(A)及保守基序分析(B)Fig.2 Phylogenetic relationship of NtBES1 proteins in N. tangutorum (A) and conserved motif analysis(B)

Nt.白刺；At.擬南芥；SI.番茄；Cs.黃瓜；Ca.辣椒；Mt.蒺藜苜蓿；Os.水稻；Zm.玉米；Si.谷子圖3 白刺與其他物種BES1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Nt.Nitraria tangutorum；At.Arabidopsis thaliana；SI.Solanum lycopersicum；Cs.Cucumis sativus；Ca.Capsicum annuum；Mt.Medicago truncatula；Os.Oryza sativa；Zm.Zea mays；Si.Setaria italicaFig.3 Phylogenetic relationship in BES1 proteins between N. tangutorum and other species

2.4 功能注釋及解析

對(duì)7個(gè) NtBES1成員在公共數(shù)據(jù)庫(COG、KEGG、GO)中的注釋結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NtBES1在COG中被注釋到2個(gè)功能類中；KEGG注釋顯示NtBES1參與2條通路活動(dòng)；NtBES1在GO中被注釋到3個(gè)功能類中，其中“生物學(xué)過程”(Biological Process)共有13個(gè)亞類，“細(xì)胞成分”(Cellular Component)有3個(gè)亞類，“分子功能”(Molecular Function)有3個(gè)亞類。對(duì)各數(shù)據(jù)庫中的所有注釋進(jìn)行歸納分析，NtBES1的功能可被分為16種(表4)。除了NtBES1-1、NtBES1-5外，其余成員均參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控；NtBES1-3和NtBES1-4的功能與其他基因的功能差異最大且NtBES1-3注釋到最多的功能；NtBES1-1、NtBES1-3、NtBES1-6均參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程；NtBES1-3參與生物脅迫防御活動(dòng)；NtBES1-1、NtBES1-5、NtBES1-6參與糖類代謝，其中NtBES1-5是“淀粉和蔗糖代謝”KEGG通路中的基因；另外還有3個(gè)成員參與“植物激素信號(hào)”KEGG通路中油菜素內(nèi)酯素介導(dǎo)的信號(hào)通路。

表4 白刺N(yùn)tBES1家族基因功能注釋匯總Table 4 Summary of functional annotation of NtBES1 family genes of N. tangutorum

2.5 脅迫下的表達(dá)分析

白刺的自然生境特征以干旱和鹽堿為主，為探索NtBES1家族基因在白刺應(yīng)對(duì)干旱和鹽堿脅迫中的作用，利用熒光定量PCR對(duì)NtBES1基因家族成員在干旱和鹽堿脅迫下的表達(dá)特征進(jìn)行分析。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取表達(dá)水平相對(duì)較高的基因NtBES1-2、NtBES1-4和NtBES1-6用于表達(dá)模式分析。

如圖4所示，在不同濃度PEG處理下，NtBES1-2、NtBES1-4、NtBES1-6在各時(shí)間段均有表達(dá)。其中，NtBES1-2和NtBES1-6有相似的表達(dá)模式：在低濃度處理下表達(dá)均下調(diào)；高濃度處理早期(2 h)表達(dá)顯著上調(diào)至最高，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量降低且低于對(duì)照(0 h)。NtBES1-4有不同的表達(dá)模式：不論是高濃度還是低濃度處理，在干旱刺激之初均顯著上調(diào)；之后在低濃度處理下，12 h時(shí)出現(xiàn)顯著下調(diào)且低于對(duì)照，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，在24 h時(shí)又顯著增加至最高；而在整個(gè)高濃度脅迫過程中隨時(shí)間推移表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后減少的模式，2 h時(shí)表達(dá)量最高。

如圖5所示，在不同濃度NaCl處理下，3個(gè)基因的表達(dá)量總體均上調(diào)，其中，低濃度處理的表達(dá)量在脅迫初期(2 h)開始顯著增加；高濃度處理的在脅迫中、后期(12 h、24 h)才開始顯著增加，且在脅迫后期(24 h)增加至最高，但是每個(gè)基因的表達(dá)特征又存在一定差別。NtBES1-2在低濃度處理下，表達(dá)量整體呈現(xiàn)先增加后減少的模式，2 h的表達(dá)量最高，是對(duì)照組(0 h)的8.4倍；在高濃度處理下呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，48 h的表達(dá)量上調(diào)至最高，是對(duì)照組(CK)的4.5倍。NtBES1-4在低濃度處理下表達(dá)模式與NtBES1-2類似，高濃度處理下在24 h時(shí)的表達(dá)量顯著增加為對(duì)照組的13.9倍，其余處理下較對(duì)照無顯著變化。NtBES1-6在低濃度處理下2 h后表達(dá)量顯著上調(diào)且之后相對(duì)平穩(wěn)；在高濃度處理下總體呈現(xiàn)先增加后減少的模式，24 h表達(dá)量最高，是對(duì)照組的8.6倍。

不同小寫字母表示不同處理時(shí)間差異顯著(P<0.05)，下同。圖4 不同濃度PEG處理下白刺N(yùn)tBES1轉(zhuǎn)錄因子家族基因的相對(duì)表達(dá)水平Bars marked with different normal letters showed significant difference at the 0.05 level;the same as belowFig.4 Relative expression levels of three representative genes of N. tangutorum NtBES1 transcription factor family under different concentrations of PEG

圖5 不同濃度NaCl處理下白刺N(yùn)tBES1轉(zhuǎn)錄因子家族代表基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of three representative genes of N. tangutorum NtBES1 transcription factor family under different concentrations of NaCl

3 討 論

生物在進(jìn)化中不斷淘汰不適應(yīng)環(huán)境的基因，進(jìn)而得以適應(yīng)環(huán)境，這種適應(yīng)最終依賴于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一[45]，本研究對(duì)NtBES1家族蛋白的分析結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)NtBES1蛋白結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一。BES1轉(zhuǎn)錄因子的bHLH結(jié)構(gòu)域包含兩段高度保守且功能不同的序列：N端序列的主要功能是與目標(biāo)DNA的E-box或BRRE序列相結(jié)合，C端序列的主要功能是與其他蛋白結(jié)合，并啟動(dòng)調(diào)控過程，進(jìn)而調(diào)控多種生理活動(dòng)[6]。保守結(jié)構(gòu)分析顯示所有的NtBES1均包含bHLH完整的兩端結(jié)構(gòu)，這是NtBES1調(diào)控功能發(fā)揮的基礎(chǔ)。另外，GroupⅢ 中的3個(gè)蛋白中均發(fā)現(xiàn)了糖基水解酶保守基序，結(jié)合功能注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的成員中，僅這3個(gè)成員被注釋到多糖分解或β-淀粉酶活動(dòng)的功能。無規(guī)則卷曲往往是蛋白質(zhì)分子特殊構(gòu)象和功能實(shí)施的重要區(qū)域[46]，因此這些結(jié)構(gòu)的高占比必定會(huì)使基因功能更多樣化，數(shù)據(jù)庫注釋信息也證實(shí)了這點(diǎn)，無規(guī)則卷曲占比較高的NtBES1-3被注釋到最多的功能且功能與其他基因差別很大，除涉及其他蛋白有的功能外，還涉及靜止中心組織等特殊的功能。這些結(jié)果均能反映NtBES1蛋白結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一。

BR信號(hào)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過程涉及多個(gè)空間和反應(yīng)，首先BR信號(hào)從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再傳導(dǎo)至細(xì)胞核中才可與目標(biāo)基因結(jié)合并起到調(diào)控作用，其中BES1是將信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)的關(guān)鍵基因[6]。在亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)中，大部分基因僅被定位于細(xì)胞核中，推測(cè)它們?cè)诩?xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要的作用，而僅有NtBES1-6被定位于細(xì)胞質(zhì)中，推測(cè)它在BR信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核的過程中起著重要作用，磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果也可證明該推測(cè)。蛋白磷酸化是生物體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)最重要的機(jī)制[36]，磷酸化底物蛋白的氨基酸殘基主要有兩種，一種是絲氨酸(含蘇氨酸)，另一種是酪氨酸，絲氨酸磷酸化的主要作用是變構(gòu)蛋白質(zhì)以激活蛋白質(zhì)或酶的活力，而酪氨酸磷酸化除了激活功能外，更重要的功能是進(jìn)行信號(hào)的多次傳遞。在磷酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)NtBES1-6的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)最多，這成為NtBES1-6將信號(hào)從胞質(zhì)傳至胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

基因表達(dá)模式分析可在一定程度上預(yù)測(cè)基因參與的生理活動(dòng)和基因功能。在PEG模擬干旱的實(shí)驗(yàn)中，低濃度的PEG脅迫下，只有NtBES1-4表達(dá)上調(diào)，對(duì)于高濃度的PEG的誘導(dǎo)，3個(gè)基因均出現(xiàn)了上調(diào)，且均在早期(2 h)表達(dá)量最高，然而只有NtBES1-4在12 h時(shí)仍然較CK處于上調(diào)狀態(tài)，另外2個(gè)基因的表達(dá)均受到抑制，由此可以說明NtBES1-4在白刺響應(yīng)PEG脅迫的過程中起著重要作用，可能是白刺耐干旱過程中的重要基因。NtBES1-2、NtBES1-6在PEG脅迫下受到了一定程度的抑制，這與杉木(Cunninghamialanceolata)和馬鈴薯中的研究結(jié)果相似[3]，ClBES1在干旱脅迫下也出現(xiàn)了表達(dá)抑制的情況，這可能與它們除Motif1(BES1_N)外的其他的結(jié)構(gòu)有關(guān)。鹽脅迫實(shí)驗(yàn)中，低濃度鹽處理下NtBES1-2和NtBES1-4在脅迫早期(2 h)和中期(12 h)顯著上調(diào)，且NtBES1-2表達(dá)量更高；高濃度鹽脅迫下，3個(gè)基因從中期(12 h)開始陸續(xù)上調(diào)，且在24 h后表達(dá)量最高，雖在此過程中NtBES1-4貢獻(xiàn)了最高的表達(dá)量，但它僅在24 h上調(diào)，而NtBES1-6從中期(12 h)到晚期(48 h)表達(dá)均上調(diào)，所以就整個(gè)過程來看，NtBES1-6的貢獻(xiàn)更突出。綜上，NtBES1-2和NtBES1-6分別在低濃度和高濃度NaCl脅迫的耐鹽過程中起到更重要的作用。另外，3個(gè)基因在高濃度鹽脅迫24 h時(shí)均受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，說明該高濃度處理下24 h是白刺的一個(gè)生理轉(zhuǎn)折點(diǎn)，此時(shí)白刺可能通過調(diào)整更多的生理活動(dòng)去適應(yīng)更長(zhǎng)時(shí)間的高鹽脅迫。

綜上所述，白刺N(yùn)tBES1成員不同的結(jié)構(gòu)特征以及在干旱和鹽脅迫下的不同表達(dá)模式表明這些成員具有不同的功能，本研究不僅豐富了植物BES1轉(zhuǎn)錄因子的信息，還補(bǔ)充了白刺抗逆分子機(jī)理的內(nèi)容，可為白刺及其他作物、林木和牧草的人工栽培、遺傳改良以及綜合開發(fā)利用提供理論參考。