靳豐蔚，董 云*，楊曉明，方 彥，劉婷婷，王 毅

(1 甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學干旱生境作物學重點實驗室，蘭州 730070)

糖基轉(zhuǎn)移酶是多糖合成中的關(guān)鍵酶，參與多種物質(zhì)的糖基化，催化糖供體和受體結(jié)合產(chǎn)生新的化合物，其供體多是激活狀態(tài)的核苷二磷酸糖，如UDP-葡萄糖、GDP-甘露糖和UDP-半乳糖等[1]。植物體內(nèi)存在大量的天然次生代謝物，這些次生代謝物的產(chǎn)生是植物在進化過程中對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，是植物生理狀態(tài)在代謝水平上的反映[2]。糖基化是這些次生代謝產(chǎn)物的主要修飾之一，糖基化修飾是植物體內(nèi)普遍存在的生理生化反應(yīng)，可以提高天然化合物的溶解度和穩(wěn)定性，使化合物便于儲存在植物細胞中，是調(diào)節(jié)細胞代謝平衡的重要機制[3]；糖基化修飾可以改變化合物毒性和生物活性[4]，在植物響應(yīng)逆境脅迫等方面具有重要作用[5]。

根據(jù)序列同源性和催化機制，在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫CAZy(Carbohydrate-Active Enzymes database) 中，根據(jù)GT序列相似度、催化底物的特異性和催化產(chǎn)物化學結(jié)構(gòu)，將糖基轉(zhuǎn)移酶分為114個家族。根據(jù)糖基轉(zhuǎn)移酶三維結(jié)構(gòu)的折疊特征，將糖基轉(zhuǎn)移酶被分為GT-A、GT-B、GT-C和GT-D等4種類型[5]。糖基轉(zhuǎn)移酶家族多使用NDP-戊糖和NDP-己糖作為供體底物，催化UDP-糖的糖基轉(zhuǎn)移酶稱為UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)[6]。

關(guān)于UGTs的研究，有學者分別在蕓薹屬植物白菜(Brassicarapa)、甘藍型油菜(Brassicanapus)和甘藍(Brassicaoleracea)中鑒定到140、251和154個UGTs[7]，這些糖基轉(zhuǎn)移酶主要參與合成次生代謝物質(zhì)響應(yīng)生物非生物脅迫。水稻超表達OsUGT90A1能保護冷脅迫下細胞膜的完整性[8]；而有學者研究UGT84A17能夠調(diào)控楊樹對逆境做出積極響應(yīng)[9]；擬南芥UGT85U1/2和UGT85V1通過改變吲哚衍生物參與應(yīng)答鹽和活性氧脅迫抗性[10]；甘藍型油菜UGT84F1和白菜BrGUGT也被發(fā)現(xiàn)通過抑制芥子酸來適應(yīng)非生物脅迫[11]。

木聚糖是存在于植物細胞壁中的一種異質(zhì)多糖，是植物半纖維素的主要成分。模式植物擬南芥遺傳和生物化學分析表明，一些來自糖基轉(zhuǎn)移酶GT43家族的BnIRX14 (IRX9I9H/IRX9-L、IRX14、I14H/IRX14-L)和GT47(IRX10、IRX10-L) 家族基因是木糖鍵延伸所必須的。木糖基轉(zhuǎn)移酶除了參與木聚糖的合成，還在擬南芥[12]和南荻(Miscanthuslutarioriparius)[13]種皮粘液合成中起作用，糖基轉(zhuǎn)移酶生物功能具有多樣性和保守性，影響植物的生長發(fā)育、逆境應(yīng)答等功能[14]。油菜是中國重要的油料作物，次生物質(zhì)代謝和抗逆機理解析是油菜育種的重要基礎(chǔ)研究。目前糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控的油菜抗性研究還相對滯后。甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所前期克隆了一個與甘藍型油菜抗性有關(guān)的β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX14(NCBI登錄號KP100641)，發(fā)現(xiàn)該基因在細胞質(zhì)中表達，屬非分泌性蛋白[15]。本研究利用生物信息學方法對甘藍型油菜BnIRX14家族成員進行鑒定，從基因組水平上分析了甘藍型油菜BnIRX14基因數(shù)目、進化和結(jié)構(gòu)以及在染色體上的分布，并構(gòu)建BnIRX14的干擾載體轉(zhuǎn)化油菜，為進一步發(fā)掘BnIRX14基因在油菜抗性育種中的利用價值提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 油菜品種供試材料為甘藍型油菜(BrassicanapusL.)春性品種Westar，由華中農(nóng)業(yè)大學生命科學學院提供。

1.1.2 其他材料農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞DH5α、植物RNAi載體pKANNIBAL、植物表達載體pART27以及Taq DNA聚合酶2×fast pfu master mix、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、KpnⅠ、XbaⅠ、HindⅢ、NotⅠ,T4連接酶，質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit Ⅰ(OMEGA)，基因組提取試劑盒Trans Direct Plant Tissue PCR Ki均購自陜西博瑞德生物科技公司。其他化學藥品均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 油菜BnIRX14基因家族成員鑒定根據(jù)BnIRX14氨基酸序列，利用Clustal W 默認設(shè)置進行多重序列比對，并在MEGA 6 軟件中使用鄰接法(Neighbour-Joining,NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[16]。利用GSDS2.0繪制BnIRX14基因結(jié)構(gòu)[17]。通過MEME分析BnIRX14蛋白保守元件[18]。

1.2.2 油菜BnIRX14基因干擾載體構(gòu)建利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計BnIRX14基因靶位點序列擴增引物(表 1)，擴增后用百泰克膠回收試劑盒回收目的片段，回收后置-20 ℃保存?zhèn)溆?。用XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切質(zhì)粒pKANNIBAL載體，切取載體大片段對應(yīng)條帶的凝膠，百泰克膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將膠回收的正向片段和線性化pKANNIBAL載體以9∶1摩爾比加到EP管中進行重組反應(yīng)，混勻后在37 ℃放置30 min進行轉(zhuǎn)化[19]。進行單菌落PCR陽性克隆鑒定，挑取陽性菌落測序驗證。將測序正確的質(zhì)粒用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切pKANNIBAL正向片段載體，回收大片段。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers in this test

將膠回收的反向片段和線性化pKANNIBAL正向片段載體以9∶1摩爾比加到EP管中進行重組反應(yīng)，連接、轉(zhuǎn)化、鑒定方法同正向片段。將測序正確的含有正反向片段的pKANNIBAL載體和表達載體pART27用NotⅠ酶切，T4連接酶連接(圖 1)，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR進行陽性克隆鑒定。

圖1 干擾載體pART27-485-6構(gòu)建Fig.1 The structure of interference vector pART27-485-6

利用Plasmid Mini Kit Ⅰ提取測序正確的pART27-485-6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，轉(zhuǎn)化參照董云等[19]，待單菌落長出后，選3～5個單菌落做菌落PCR驗證，引物見表1，PCR反應(yīng)體系和條件與靶位點序列擴增相同。

1.2.3 油菜BnIRX14基因干擾載體轉(zhuǎn)化參照劉宏波[20]以及CARDOZAD等[21]、DE BLOCK等[22]和MAHESHWARI等[23]關(guān)于農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因方法。以栽培品種Westar為受體材料，用轉(zhuǎn)化了pART27-485-6質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101侵染油菜下胚軸，當抗性芽在誘導分化培養(yǎng)基上長到2 cm時，切芽并將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，待形成完整小植株時切取葉片，使用Trans Direct Plant Tissue PCR Kit試劑盒提取基因組DNA，用4對基因特異引物(表 1)檢測陽性植株。參照方彥等[24]方法，依據(jù)BnIRX14基因的cDNA全長序列設(shè)計特異RT-PCR引物，Actin作為內(nèi)參基因?qū)﹃栃灾仓甑幕?、角果、葉片進行實時熒光定量PCR分析，實時熒光定量PCR引物見表 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜BnIRX14基因家族成員鑒定

根據(jù)前期獲得的BnIRX14基因序列[15]，在PFAM數(shù)據(jù)庫中預(yù)測基因保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，BnIRX14包含一個糖基轉(zhuǎn)移酶家族結(jié)構(gòu)域。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域在甘藍型油菜基因組注釋序列中檢索家族基因，得到11個家族成員。

氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析表明，甘藍型油菜BnIRX14家族成員被分成3個亞家族(圖2，A)，第一個亞家族包括IRX9-L-1、IRX9-L-2、IRX9-L-4、IRX9-L-5、IRX9-L-7、IRX9-L-8，第二個亞家族包括IRX9-L-3、IRX9-L-6，第三個亞家族包括IRX14-L-1、IRX14-L-2、IRX14-L-3。其中，有8個BnIRX14基因家族成員分別分布在6條染色體上(圖 2，B)，分別為A07、A08、A09、C03、C07和C09染色體，除C07染色體有3個基因外，其余染色體均有1個基因，根據(jù)染色體定位分布信息和序列比對分析，發(fā)現(xiàn)IRX14-L-2和IRX14-L-3串聯(lián)重復。第一亞家族基因有3～4個外顯子，第二亞家族基因有7～9個外顯子，第三亞家族基因有2～4個外顯子，IRX14-L-1只有2個外顯子，且內(nèi)含子最短(圖 3，A)。

圖2 BnIRX14家族氨基酸序列系統(tǒng)進化樹(A)和染色體分布(B)Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences (A) and chromosome distribution (B) of BnIRX14 family members

在BnIRX14蛋白中預(yù)測出10個保守元件(圖 3，B)，第一亞家族蛋白有2～8個保守元件，其中：IRX9-L-4有2個，IRX9-L-8有5個，其余4個蛋白均有8個相同的元件；第二亞家族蛋白只有1個保守元件；第三亞家族蛋白有1～4個保守元件，其中IRX14-L-2僅1個保守元件，IRX14-L-1和IRX14-L-3存在4個相同元件。元件1除IRX9-L-4和第三亞家族外，在其他兩個亞家族蛋白中均存在；元件2在第一、第三亞家族蛋白中存在；元件3僅在第一亞家族蛋白中存在；元件9、10只有IRX14-L-1、IRX14-L-3存在。3個亞家族在基因結(jié)構(gòu)和保守元件中具有較大特異性。

圖3 BnIRX14基因家族結(jié)構(gòu)(A)和蛋白保守元件(B)Fig.3 Family structure (A) and protein conserved element (B) of BnIRX14

2.2 油菜BnIRX14基因干擾載體構(gòu)建

利用BnIRX14基因靶位點序列設(shè)計的正向片段擴增引物F485-6-F/F485-6-R和反向片段擴增引物R485-6-F/R485-6-R進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物分別為340和336 bp(圖4，A)，膠回收目的片段。XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切線性化質(zhì)粒pKANNIBAL載體，與膠回收的正向片段進行重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用正向片段擴增引物進行單菌落PCR鑒定得到4個陽性克隆(圖4，B)。

XbaⅠ和HindⅢ 雙酶切測序正確的質(zhì)粒pKANNIBAL 正向片段載體，與膠回收的反向片段進行重組轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用反向片段擴增引物進行單菌落PCR鑒定得到2個陽性克隆(圖4，C)。NotⅠ酶切含有正反向片段的pKANNIBAL載體和植物表達載體pART27，膠回收目的片段后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，用反向片段擴增引物單菌落PCR鑒定得到1個陽性克隆(圖4，D)。提取測序正確的pART27-485-6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，利用485F/485R進行單菌落PCR，擴增條帶743 bp，驗證得到4個陽性克隆(圖4，E)。

A.正反向片段PCR擴增：1、2.F485-6；3、4.R485-6；B.F485-6連接載體pKANNIBAL菌落PCR鑒定：1-4.pKANNIBAL-F485-6；C.R485-6連接載體pKANNIBAL-F485-6菌落PCR鑒定：1、2.pKANNIBAL- F485-6- R485-6；D.pART27-485-6轉(zhuǎn)大腸桿菌菌落PCR鑒定；E.pART27-485-6轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定；M.DL2000圖4 BnIRX14基因干擾表達載體構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化PCR鑒定A.PCR amplification of positive and reverse fragments:1 and 2 were positive fragments F485-6,3 and 4 were reverse fragments R485-6;B.Positive colony PCR identification of the forward fragment F485-6 linked to the vector pKANNIBAL:1-4 were pKANNIBAL-F485-6;C.Positive colony PCR identification of the reverse fragment R485-6 linked to the vector pKANNIBAL-F485-6,1 and 2 were pKANNIBAL-F485-6-R485-6;D.Colony PCR identification of plasmid pART27-485-6 transfected Ecoli;E.Colony PCR identification of plasmid pART27-485-6 transfected agrobacterium tumefaciens;M.DL2000Fig.4 PCR identification of BnIRX14 gene interference expression vector and agrobacterium transgenics

2.3 油菜BnIRX14基因RNA干擾表達載體遺傳轉(zhuǎn)化和表型分析

2.3.1 遺傳轉(zhuǎn)化通過農(nóng)桿菌介導侵染油菜下胚軸進行BnIRX14基因干擾表達載體 pART27-485-6的遺傳轉(zhuǎn)化，侵染油菜下胚軸300個(圖5，A)，出愈率67%，分化培養(yǎng)和Kan抗性篩選，獲得抗性芽60個(圖5，B)，通過生根培養(yǎng)得到再生植株20個(圖5，C)，用4對特異性引物JDF1/JDR1、JDF2/JDR2、JDF3/JDR3和JDF4/JDR4進行PCR檢測后，擴增條帶分別為1 500、1 500、1 000和1 000 bp(圖5，D～G)，確定5株為陽性轉(zhuǎn)化體。

A.GV3101侵染油菜下胚軸共培養(yǎng)；B.誘導分化培養(yǎng)；C.生根培養(yǎng)；D-G.PCR鑒定：M.DL5000；2#、5#、6#、9#、10#。陽性轉(zhuǎn)化體；N.陰性對照圖5 干擾表達載體 pART27-485-6的遺傳轉(zhuǎn)化及PCR鑒定A.Coculture of rapeseed hypocotyls infected by agrobacterium Gv3101;B.Resistant buds grown on induced differentiation medium;C.Resistant buds grown in rooting medium;D-G.PCR identification of positive plants:2,5,6,9 and 10# were transformation events;M.DL5000;N.Negative controlFig.5 Genetic transformation of expression vector pART27-485-6 and PCR identification

2.3.2 表型分析通過BnIRX14基因在不同器官中表達量的分析(圖 6)在油菜5個轉(zhuǎn)化干擾表達載體 pART27-485-6陽性植株的花、角果、葉中，BnIRX14基因表達量均低于野生型，且差異顯著，說明BnIRX14基因在花、角果和葉中的表達受到抑制。BnIRX14基因在野生型油菜的花、角果、葉片中的表達量基本一致，但在油菜轉(zhuǎn)化干擾表達載體pART27-485-6陽性植株的花、角果、葉片中的表達量是依次降低。表型鑒定發(fā)現(xiàn)，編號為9#和10#的陽性轉(zhuǎn)化株花的柱頭至花柱中央為一孔狀的空腔，子房較野生型明顯膨大，在柱頭表面授粉后，不能結(jié)實，表現(xiàn)雌性不育(圖7)，其他3個陽性株花器結(jié)構(gòu)發(fā)育正常，但植株莖、枝表皮有液體滲出，呈露珠狀粘附在莖、枝表面。

WT.野生型;2#、5#、6#、9#、10#.陽性株系；下同。小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)圖6 BnIRX14基因在陽性植株不同器官中的表達WT.Wild type;2,5,6,9 and 10#.The positive plant;The same as below.Different normal letters meam significant difference at 0.05 level (P≤0.05)Fig.6 Expression of BnIRX14 gene in different organs of positive plants

A.株系；B.株系花蕾、花器和角果；C.WT柱頭；D.9#陽性轉(zhuǎn)化株柱頭圖7 轉(zhuǎn)化干擾表達載體陽性株雌性不育表型A.Strains;B.Flower bud,floral apparatus,silique;C.Chapiter of WT;D.Chapiter of positive strain 9#Fig.7 Female sterility phenotype of rape positive strains of the expression vector transferred

3 討 論

木聚糖是一種存在于植物細胞壁中的異質(zhì)多糖，約占植物細胞干重的15%～35%，是植物半纖維素的主要成分[25]。β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶是糖基轉(zhuǎn)移酶家族GT43成員[26]，大多以UDP-木糖作為專一性的糖供體，GT43家族中所含成員多與植物的次級代謝和逆境脅迫相關(guān)[27]。糖基轉(zhuǎn)移酶GT43家族成員在模式植物中有許多報道，像擬南芥IRX9、IRX9L、IRX14、IRX14L等[28]都參與了木糖的合成。木聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶在植物生長發(fā)育、調(diào)節(jié)次生代謝及參與相應(yīng)逆境脅迫有重要意義[29]。有學者從南荻(Miscanthuslutarioriparius)中鑒定到了7個GT43成員[13]，在水稻中發(fā)現(xiàn)了10個GT43成員[30]，這些功能基因冗余具有多樣性。

董云通過RACE技術(shù)從甘藍型油菜中克隆到了β-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因BnIRX14，保守結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位表明BnIRX14屬于油菜糖基轉(zhuǎn)移酶GT43家族成員[15]。本研究通過同源序列比對，在甘藍型油菜中檢索到了11個BnIRX14基因家族成員，分別定位在A07、A08、A09、C03、C07和C09染色體上，其中IRX14-L-2和IRX14-L-3串聯(lián)重復，可能來自于遠緣雜交的甘藍基因組。IRX9-L-1、IRX9-L-7、IRX9-L-2和IRX9-L-5結(jié)構(gòu)域十分保守，都存在8個保守的結(jié)構(gòu)域，進化樹結(jié)果也表明IRX9-L-1和IRX9-L-7，IRX9-L-2和IRX9-L-5分別聚為一類，說明在進化上的保守性。

通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，構(gòu)建了油菜BnIRX14干擾表達載體轉(zhuǎn)化油菜下胚軸，通過生根培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化株系20個。qRT-PCR檢測T0代陽性轉(zhuǎn)基因油菜，相比野生型BnIRX14在花，角果和葉中均下調(diào)表達，其中葉中下調(diào)最為明顯，可能的原因在于BnIRX14參與木糖調(diào)節(jié)的半纖維素的合成，而葉中相比花和角果中本底水平的BnIRX14表達量就低，導致干擾BnIRX14轉(zhuǎn)基因株系中BnIRX14基因低表達，但具體的原因還需要進一步分子水平的證據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)干擾BnIRX14轉(zhuǎn)基因株系9#和10#花器柱頭至花柱中央為一孔狀的空腔，子房較野生型明顯膨大，在柱頭表面授粉后，不能結(jié)實，表現(xiàn)雌性不育。其他2#、5#和6#陽性干擾BnIRX14轉(zhuǎn)基因株系花器結(jié)構(gòu)發(fā)育正常，但植株莖、枝表皮有液體滲出，呈露珠狀粘附在莖、枝表面。原因可能是轉(zhuǎn)基因株系中基因被干擾的程度不同所致，這種情況在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛谐３０l(fā)現(xiàn)[31]，不同的轉(zhuǎn)基因株系因?qū)虿迦胛稽c不同而造成基因表達量不同[32]。qRT-PCR檢測在9#和10#株系角果中BnIRX14基因表達低于其他轉(zhuǎn)基因干擾株系，也符合觀察到的結(jié)實發(fā)育的異常。2#、5#和6#轉(zhuǎn)基因株系植株莖、枝表皮有液體滲出，呈露珠狀粘附在莖枝表面的原因可能在于下調(diào)了BnIRX14基因的表達導致次生代謝物質(zhì)的異常所致，但具體的分子機制和確鑿的證據(jù)正在進行后續(xù)的研究。本研究在甘藍型油菜中發(fā)現(xiàn)了11個BnIRX14基因家族成員，進化上高度保守且存在多樣性，功能缺失研究表明這些木糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因能夠參與雌蕊的發(fā)育和次生物質(zhì)代謝，該研究為油菜雜交育種和抗逆育種提供理論依據(jù)。