羅嘉儀，羅旖璐，韓紅亮，Galina Ramskaya，徐 娟，林學(xué)鎂，申玲玲，何 新*，紀(jì)瑞鋒*

摘除花蕾對(duì)林下參不同部位中人參皂苷和植物激素含量的影響

羅嘉儀1，羅旖璐1，韓紅亮1，Galina Ramskaya2，徐 娟3，林學(xué)鎂3，申玲玲4，何 新1*，紀(jì)瑞鋒1*

1. 廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006 2. 莫斯科國立謝東諾夫第一醫(yī)科大學(xué)，莫斯科 119991 3. 拉芳家化股份有限公司，廣東 汕頭 515041 4. 島津企業(yè)管理（中國）有限公司廣州分公司，廣東 廣州 510640

考察摘除花蕾對(duì)林下參葉片、葉柄、莖頂端、莖中部、莖基部、蘆頭、根皮、根心、側(cè)根及須根主要人參皂苷和植物激素水楊酸、脫落酸含量的影響，研究人參皂苷含量變化與植物激素的相關(guān)性，為林下參的種植方式優(yōu)化提供依據(jù)?；赨PLC-MS/MS技術(shù)分別建立含量測(cè)定方法，對(duì)林下參10個(gè)部位主要人參皂苷和植物激素進(jìn)行測(cè)定，運(yùn)用單因素分析評(píng)價(jià)林下參摘蕾與否的質(zhì)量差異，并采用Spearman相關(guān)性分析方法探討植物激素與人參皂苷含量的相關(guān)性。所建立的含量測(cè)定方法穩(wěn)定可行；摘蕾組林下參地下部位中參皮（＜0.05）和側(cè)根部位（＜0.001）中人參總皂苷含量顯著增加，地上部位包括林下參葉、葉柄與莖總?cè)藚⒃碥蘸烤@著降低（＜0.001）；摘蕾組人參皂苷Rd在蘆頭（＜0.05）、根皮（＜0.01）中的含量顯著上升。摘蕾組參皮和參心中水楊酸含量顯著降低（＜0.001）。水楊酸與人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1含量呈正相關(guān)，與人參皂苷Rg3、人參皂苷F1含量呈負(fù)相關(guān)。摘除花蕾可顯著提高林下參除須根外地下部位主要人參皂苷總含量，并使地上部位人參皂苷含量降低，提高林下參綜合經(jīng)濟(jì)價(jià)值。摘除花蕾可引起內(nèi)源性水楊酸含量變化，且該變化人參皂苷含量與人參皂苷含量變化有相關(guān)性。

林下參；摘蕾栽培；人參皂苷Rb1；人參皂苷Rg3；人參皂苷Rd；水楊酸；脫落酸；UPLC-MS/MS

人參為五加科人參屬植物人參C. A. Meyer的干燥根和根莖，人參葉為其干燥葉，兩者均具有補(bǔ)氣、益肺、生津的功效[1]。播種或移栽于森林之下的人參稱之為林下參，林下參全株均含有人參皂苷，其種類和含量是影響林下參藥理作用和藥材質(zhì)量的主要因素，其中人參皂苷Rb1、人參皂苷Re和人參皂苷Rg1為《中國藥典》2020年版規(guī)定的林下參藥材質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[1]。

在中藥栽培生產(chǎn)實(shí)踐中，摘除花蕾可以節(jié)約藥用植物生殖活動(dòng)所消耗的能量及物質(zhì)使其更多地被用于營養(yǎng)生長，從而提高藥用植物的總生物量[2-3]。20世紀(jì)80～90年代[4-5]，我國即有摘蕾可以提高人參產(chǎn)量10%～30%，西洋參摘蕾有效提高單產(chǎn)37%的報(bào)道，在國家標(biāo)準(zhǔn)《人參優(yōu)質(zhì)種植技術(shù)規(guī)范》中明確規(guī)定園參的種植“除留種田外，應(yīng)及時(shí)掐掉花蕾”，但是對(duì)于林下參現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)及團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中并無摘蕾的規(guī)定[6-9]。近年來在林下參的栽培生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)了摘蕾以進(jìn)一步提高產(chǎn)量的現(xiàn)象，但是摘蕾對(duì)林下參不同部位人參皂苷含量影響的研究尚不多[10]。

植物激素是植物體內(nèi)的小分子化合物，調(diào)控著植物的休眠、生殖以及次生代謝物合成[11]等幾乎所有生命活動(dòng)。水楊酸、脫落酸是目前研究較為深入的影響植物次生代謝物合成的植物激素，已有研究表明外源水楊酸、脫落酸可引起人參、西洋參中人參皂苷含量變化[12-13]。因此，外界刺激引起的人參皂苷含量變化可能與水楊酸、脫落酸等植物激素的含量變化呈現(xiàn)較高的相關(guān)性，即外界刺激可能通過影響水楊酸、脫落酸等植物激素含量，繼而引起人參皂苷的含量變化。

綜上所述，目前摘蕾對(duì)林下參不同部位人參皂苷和植物激素影響的研究尚不多，本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS技術(shù)探討摘蕾引起的林下參不同部位主要人參皂苷含量和植物激素的變化，并初步探討了人參皂苷與水楊酸、脫落酸2種植物激素含量變化的相關(guān)性，為林下參栽培過程中是否摘蕾提供參考依據(jù)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 儀器

QUINTIX125D-1CN型十萬分之一電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；島津LC-40D X3plus四元泵，島津SIL-40C X3自動(dòng)進(jìn)樣器，島津CTO-40S柱溫箱，島津LCMS-8045三重四極桿質(zhì)譜儀，日本島津公司；Sigma 3-30K型高速臺(tái)式離心機(jī)，德國默克公司；MD200-2氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；ZQTY-50V臺(tái)式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；SB-5200DTD超聲波清潔儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 材料

將同一年播種且生長環(huán)境及日常管理完全一致的林下參分為2組，其中未摘蕾（CK）組林下參種植年限為21年，自然生長，無額外干預(yù)；摘蕾（BR）組林下參在種植的第15年開始連續(xù)摘蕾7年直至其年限為21年。本研究所用上述2組藥材于2021年8月采自吉林省集安市，經(jīng)廣東藥科大學(xué)紀(jì)瑞鋒博士鑒定為五加科人參屬植物人參C. A. Meyer林下參鮮樣，所有樣品留樣于廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院。

1.3 試劑

對(duì)照品人參皂苷Rb1（批號(hào)DSTDR000601）、人參皂苷Rd（批號(hào)DST200703-015）、人參皂苷Re（批號(hào)DSTDR001401）、人參皂苷F1（批號(hào)DST200302-025）、人參皂苷Rg1（批號(hào)DST200722-009）、人參皂苷Rg2（批號(hào)DST200518-010）、人參皂苷Rg3（批號(hào)DST191107- 011），均購自成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；水楊酸（批號(hào)H31A10B96366）、脫落酸（批號(hào)A09N11L130206），購自上海源葉生物；質(zhì)譜級(jí)甲醇（批號(hào)I1101035028），購自德國Merck公司；甲酸（批號(hào)L2300107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

2 方法

2.1 樣品前處理

CK組和BR組各3個(gè)生物學(xué)平行，全株采挖，快速擦拭表面泥土，切分為10個(gè)部位，分別為地上部位：葉片、葉柄、莖頂端（自葉柄開始的莖上段部位，約為莖總長度的1/3）、莖中部（莖中間部分的1/3）、莖基部（自蘆頭開始的莖下段部位，約為莖總長度的1/3），地下部位：蘆頭、根皮、根心、側(cè)根、須根。以上10個(gè)部位錫箔紙包裹后放入液氮，備用。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 人參皂苷溶液[14]林下參樣品快速液氮研磨，精密稱取0.1 g研碎的樣品，加入2 mL 70%甲醇水溶液，超聲提取30 min（100 Hz、50 ℃），超聲后補(bǔ)足損失體積，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 植物激素溶液[15]林下參樣品快速液氮研磨，精密稱取50 mg研碎的樣品，平行3份，分別加入500 μL提取溶液（異丙醇-純水-濃鹽酸2∶1∶0.002），搖床振搖提?。?00 r/min、30 min，4 ℃）；加入1 mL二氯甲烷，搖床振搖萃?。?00 r/min、30 min、4 ℃）；離心機(jī)離心（13 000 r/min、5min，4 ℃）；吸取900 μL有機(jī)相至2 mL離心管；氮吹儀吹干，150 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷F1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rg3對(duì)照品，精密稱定，加入色譜甲醇配制成人參皂苷檢測(cè)成分混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0.162、0.185、0.075、0.110、0.077、0.050、0.050 mg/mL，加入色譜甲醇逐級(jí)稀釋，配制成7種質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

分別稱取水楊酸和脫落酸對(duì)照品，精密稱定，加入色譜甲醇配制成植物激素檢測(cè)成分混標(biāo)溶液，水楊酸和脫落酸的質(zhì)量濃度分別為2.00 μg/mL和2.16 μg/mL；加入色譜甲醇逐級(jí)稀釋制成7個(gè)質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

2.4 色譜與質(zhì)譜條件

2.4.1 人參皂苷檢測(cè)條件 （1）色譜條件 Waters ACQUITY UPLC ACQUITY BEH色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），洗脫梯度為0～1 min，10%B；1～9 min，10%～60% B；9～12 min，60%～65% B；12～14 min，65%～70% B；14～23 min，70%～80% B；23～26 min，80%～85% B；26～29 min，85%～95% B；體積流量為0.5 mL/min；柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

（2）質(zhì)譜條件 ESI離子源；掃描模式為正負(fù)離子切換，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測(cè)；霧化氣流量3.0 L/min；干燥氣流量10.0 L/min；加熱氣流量10L/min；接口溫度300 ℃；去溶劑管溫度（desolvation line，DL）250 ℃；加熱塊溫度 400 ℃；碰撞誘導(dǎo)解離電壓（collision induced dissociation，CID）270 kPa。人參皂苷成分MRM參數(shù)見表1。

2.4.2 植物激素檢測(cè)條件 （1）色譜條件 Waters ACQUITY UPLC ACQUITY BEH色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），洗脫梯度為0～1 min，10% B；1～6 min，10%～15% B；6～16 min，15%～66% B；16～19 min，66%～95% B；體積流量為0.5 mL/min；柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

（2）質(zhì)譜條件：ESI離子源；掃描模式為正負(fù)離子切換，MRM模式檢測(cè)；霧化氣流量3.0 L/min；干燥氣流量10.0 L/min；加熱氣流量10 L/min；接口溫度300 ℃；DL溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；CID270 kPa。植物激素成分MRM參數(shù)見表1。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取“2.3”項(xiàng)下制備的梯度質(zhì)量濃度混合對(duì)照品工作溶液，按上述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行樣品分析，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸；結(jié)果表明，在考察范圍內(nèi)，7種人參皂苷成分與2種植物激素的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，均大于0.990，見表2。取上述混合對(duì)照品適量，用70%甲醇稀釋成濃度為梯度由高到低的系列溶液，進(jìn)樣，取信噪比（/）為3和/為10的混合對(duì)照品溶液作為待測(cè)成分的檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）。

表1 植物激素與人參皂苷的MRM優(yōu)化結(jié)果

表2 人參皂苷成分與植物激素的回歸方程、r、線性范圍、LOD和LOQ

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄待測(cè)成分的峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD值，考察精密度。人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷F1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、和人參皂苷Rg3的精密度分別為4.77%、1.25%、1.20%、2.96%、1.19%、1.9%、3.89%；水楊酸、脫落酸的精密度為2.99%、1.72%。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取CK組林下參葉樣品，按按“2.2”項(xiàng)下植物激素以及人參皂苷供試品制備方法分別平行制備6份供試品，室溫放置，分別于0、2、4、6、12、24 h按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄待測(cè)成分的峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD值，考察穩(wěn)定性。人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷F1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、和人參皂苷Rg3分別為2.23%、1.84%、2.55%、4.22%、1.09%、2.37%、2.61%；水楊酸和脫落酸分別為2.87%、2.89%。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取CK組林下參葉樣品，按“2.2”項(xiàng)下植物激素以及人參皂苷供試品制備方法分別平行制備6份供試品，按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄待測(cè)成分的峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD值。人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷F1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、和人參皂苷Rg3分別為1.81%、2.41%、1.31%、1.58%、3.43%、2.54%、2.79%；水楊酸和脫落酸分別為2.99%、1.72%，表明重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已測(cè)定的液氮研碎樣品（CK組林下參葉）6份，每份約0.05 g，精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液，分別按“2.2”項(xiàng)制備供試品，按“2.4”項(xiàng)條件進(jìn)樣測(cè)定各成分含量，計(jì)算其回收率。人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷F1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、和人參皂苷Rg3的平均回收率分別為101.83%、114.69%、109.51%、105.53%、104.70%、103.95%、98.23%；RSD分別為2.3%、1.3%、4.3%、2.3%、5.3%、2.3%、1.3%；水楊酸和脫落酸的平均回收率分別為94.26%和100.57%；RSD分別為2.3%、1.3%。

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Labsolutions 工作站進(jìn)行測(cè)定物濃度計(jì)算，用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用 SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用R 語言（ggplot2 package、corrplot package）進(jìn)行圖表繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 UPLC-MS/MS定量分析結(jié)果

2種UPLC-MS/MS定量分析方法可分別使7種人參皂苷（圖1-A）和2種植物激素分離（圖1-B），可用于林下參不同部位人參皂苷及植物激素的含量檢測(cè)。

圖1 目標(biāo)化合物總離子流圖

3.2 摘除花蕾對(duì)林下參質(zhì)量的影響

3.2.1 摘除花蕾對(duì)林下參不同部位主要人參皂苷含量的影響 按“2.1”項(xiàng)下方法處理樣品，“2.2”項(xiàng)下方法制備人參皂苷供試品，“2.4”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)。人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re為人參藥材質(zhì)量的主要指標(biāo)成分[1]，三者含量之和計(jì)為主要人參皂苷，2組樣品主要人參皂苷見圖2-A；所測(cè)7種人參皂苷含量之和計(jì)為總?cè)藚⒃碥眨?組樣品中總?cè)藚⒃碥毡容^見圖2-B。

BR組林下參地下部位中主要人參皂苷和總?cè)藚⒃碥蘸烤哂贑K組林下參，其中根皮（＜0.05）、須根（＜0.05）2個(gè)部位具有顯著性差異，蘆頭及根心部位無顯著性差異；然而，對(duì)于地上部位而言，BR組主要人參皂苷和總?cè)藚⒃碥蘸烤@著低于CK組（0.0001)。2組林下參根皮中的人參皂苷含量均明顯高于根心（＜0.05）。

3.2.2 摘除花蕾對(duì)林下參不同部位單體人參皂苷含量的影響 林下參各部位人參皂苷含量見圖3及表3，與CK組比較，BR組人參皂苷Rb1在蘆頭和側(cè)根中含量顯著增加（＜0.05），在須根和葉中顯著降低（＜0.05）。BR組人參皂苷Rg1在側(cè)根以及須根中含量顯著升高（＜0.01），在葉中的含量顯著降低（＜0.05）。BR組中，人參皂苷Re在蘆頭、葉、葉柄以及須根中均顯著下降（＜0.05），均少于CK組的50%。BR組人參皂苷Rd在蘆頭（＜0.05）、根皮（＜0.01）中的含量顯著上升，其中蘆頭中的Rd增至CK組的12倍以上。與CK組比較，BR組人參皂苷Rg2含量在側(cè)根、須根和葉中的含量顯著升高（＜0.05）。BR組人參皂苷Rg3在葉中的含量顯著升高，增至CK組（＜0.01）的10倍以上，在其他部位無顯著性差異。2組間人參皂苷F1含量無顯著性差異。

LT-蘆頭 GP-根皮 GX-根心 CG-側(cè)根 G-須根 Y-葉 YB-葉柄 JL-莖基部 JM-莖中部 JH-莖頂端 BR與CK組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

LT-蘆頭 GP-根皮 GX-根心 CG-側(cè)根 G-須根 Y-葉 YB-葉柄 JL-莖基部 JM-莖中部 JH-莖頂端

表3 林下參不同部位單體人參皂苷含量(, n = 3)

與CK組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01CK group

3.3 摘蕾對(duì)人參影響的機(jī)制

3.3.1 摘蕾對(duì)林下參不同部位植物激素含量的影響 取“2.1”項(xiàng)下同樣的林下參植株，按“2.2”項(xiàng)下制備方法制備植物激素供試品，按“2.4”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，BR組和CK組不同部位植物激素的含量分布結(jié)果見表4和圖4。

2組林下參中的水楊酸在參皮、參心間含量無顯著差異性，其他部位均具有顯著性差異（＜0.05）。CK組林下參中脫落酸在不同部位間的分布無顯著性差異，但在BR組中，地上部位與地下部位含量分布具有顯著性差異（＜0.05），須根與其他部位的脫落酸含量均具有顯著性差異（＜0.05）。林下參莖中每段間的植物激素含量無顯著性差異。

表4 CK組與BR組中不同部位植物激素的含量分布(, n = 3)

“—”表示含量低于檢測(cè)限；同列數(shù)據(jù)不同字母表示顯著性差異（＜0.05）

The symbol“—”means below LOQ; Different letters in the same column indicate significant difference (< 0.05)

LT-蘆頭 GP-根皮 GX-根心 CG-側(cè)根 G-須根 Y-葉 YB-葉柄 JL-莖基部 JM-莖中部 JH-莖頂端；BR組與CK組比較：*P＜0.05 **P＜0.001

相比于CK組，BR組根皮、根心水楊酸含量顯著降低（＜0.05）；CK組中，葉柄和莖中水楊酸含量低于檢測(cè)限，BR組中水楊酸含量顯著升高；其他部位水楊酸含量在兩組間無顯著性差異。2組間林下參不同部位脫落酸含量變化無顯著性差異。

3.3.2 水楊酸、脫落酸與人參皂苷含量分布相關(guān)性 采用IBM SPSS 26和R Studio軟件，對(duì)2組樣品人參皂苷以及植物激素含量進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析、雙尾顯著性檢驗(yàn)，從而分析林下參中脫落酸和水楊酸與人參皂苷的含量分布相關(guān)性，結(jié)果見圖5。

水楊酸與人參皂苷Rb1（＝0.467，＜0.01）、人參皂苷Rg1（＝0.294，＜0.05）呈正相關(guān)，與人參皂苷Rg3（＝?0.257，＜0.05）和人參皂苷F1（＝?0.355，＜0.01）呈負(fù)相關(guān)。脫落酸與人參皂苷Re（＝0.257，＜0.05）、人參皂苷F1（＝0.258，＜0.05）呈正相關(guān)。水楊酸與總?cè)藚⒃碥蘸浚ǎ?.266，＜0.05）呈正相關(guān)，與主要人參皂苷含量（＝0.304，＜0.05）呈正相關(guān)。

4 討論

4.1 色譜條件考察

高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有專屬性強(qiáng)、定量限低和分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，近年來越來越多地用于人參藥材中人參皂苷和植物激素的含量測(cè)定[16-17]。人參體內(nèi)植物激素水楊酸與脫落酸含量極低，數(shù)量級(jí)約為10?8～10?7，因此適合使用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行測(cè)定。針對(duì)人參皂苷和植物激素檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、甲醇-水（0.05%甲酸）、甲醇-水（0.1%甲酸）洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明采用甲醇-水作為洗脫系統(tǒng)時(shí)，人參皂苷及植物激素的離子化效果差；采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為洗脫系統(tǒng)時(shí)，人參皂苷時(shí)離子響應(yīng)效果最好；而采用甲醇-0.05%甲酸水溶液與甲醇-0.1%甲酸水溶作為液洗脫系統(tǒng)，植物激素響應(yīng)效果無差別，因此選用甲醇-0.1%甲酸水溶液進(jìn)行洗脫。

左下角數(shù)值為P值，右上角顏色表示r值

本實(shí)驗(yàn)成功建立了可用于人參皂苷含量測(cè)定及人參內(nèi)源植物激素含量測(cè)定的UPLC-MS/MS方法，并對(duì)林下參10個(gè)不同部位中的7種人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷F1及2種植物激素水楊酸、脫落酸進(jìn)行了含量測(cè)定，所建立的方法穩(wěn)定可行。

4.2 林下參不同部位人參皂苷的分布規(guī)律及摘蕾對(duì)其的影響

研究表明摘蕾可顯著提高園參、三七及西洋參的產(chǎn)量及人參皂苷含量[4-5, 18]。為了考察摘蕾對(duì)林下參品質(zhì)的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)未摘蕾及摘蕾林下參中7種人參皂苷含量進(jìn)行測(cè)定。人參皂苷含量部位間分布差異大[19]，且分布差異與運(yùn)輸密切相關(guān)[20-21]，Schramek等[20]用13C標(biāo)記的同位示蹤法發(fā)現(xiàn)，人參皂苷合成的前體存在從葉子轉(zhuǎn)移到根中的現(xiàn)象。Kim等[22]與Han等[23]研究小組發(fā)現(xiàn)，人參皂苷分布與基因表達(dá)并不一致，由此可以推測(cè)，人參皂苷含量在葉片、葉柄、莖頂端、中部、基部、蘆頭、根皮、根心、側(cè)根與須根的空間分布可能呈依次遞增或遞減規(guī)律。因此本實(shí)驗(yàn)將林下參切分為10個(gè)部位并對(duì)其含量分別進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常生理狀態(tài)下，地上部分人參皂苷總含量葉＞葉柄＞莖頂端＞莖中部＞莖基部，即人參皂苷總含量在葉、葉柄與莖中呈遞減規(guī)律，這可能是人參皂苷由葉片合成然后運(yùn)輸?shù)礁斐傻?，與前期文獻(xiàn)報(bào)道相符[22-23]。摘蕾后人參皂苷在地上部位的含量均降低，但其含量遞減現(xiàn)象與正常組基本一致。

與未摘蕾組相比，摘蕾組林下參地下部位除須根部位外中主要人參皂苷和總?cè)藚⒃碥蘸烤仙?，地上部位主要人參皂苷和總?cè)藚⒃碥蘸烤@著降低?？紤]到須根在林下參植株總生物量中占比較少，因此摘除花蕾可提高林下參藥材整體質(zhì)量，但是林下參來源的人參葉藥材品質(zhì)卻有所下降。

4.3 摘除花蕾對(duì)林下參影響的植物激素相關(guān)機(jī)制

研究表明外源水楊酸及脫落酸處理對(duì)人參皂苷的含量有顯著影響，例如，外源水楊酸處理可以提高林下參根中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re等人參皂苷的含量[12]。

研究表明水楊酸及脫落酸均參與調(diào)控植物人參皂苷的生物合成，例如水楊酸通過提高人參合成酶活性，促進(jìn)人參皂苷積累[12]，脫落酸通過上調(diào)人參皂苷合成酶相關(guān)基因啟動(dòng)子的表達(dá)，影響西洋參人參皂苷的積累[13, 24]。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)林下參不同部位水楊酸及脫落酸的含量進(jìn)行了檢測(cè)。摘蕾對(duì)不同部位水楊酸的含量變化有顯著影響。植物在受到外界環(huán)境刺激時(shí)可通過調(diào)控水楊酸、脫落酸等植物激素，促進(jìn)次生代謝物的合成來抵御環(huán)境脅迫[25]。水楊酸通過影響關(guān)鍵酶活性、關(guān)鍵酶基因差異表達(dá)、調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子活性、植物激素間協(xié)同交互影響人參皂苷的生物合成和積累[26]。因此，摘蕾改變林下參中內(nèi)源性水楊酸的含量，可能通過調(diào)控三萜類化合物在生物合成中的關(guān)鍵酶活性或基因差異表達(dá)，進(jìn)而影響人參皂苷的合成與運(yùn)輸。

摘除花蕾可提高林下參除須根外地下部位人參皂苷含量，并使地上部位人參皂苷含量降低，因此摘除花蕾可提高林下參藥材整體質(zhì)量，但是林下參來源的人參葉藥材品質(zhì)卻有所下降。但林下參根和根莖經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高，因此摘除花蕾可以提高林下參的綜合經(jīng)濟(jì)價(jià)值。摘除花蕾可能通過改變內(nèi)源性水楊酸的含量，從而調(diào)控林下參的生理活動(dòng)，最終引起人參皂苷的含量變化。本研究闡明了摘除花蕾對(duì)林下參中人參皂苷和植物激素含量的影響，為林下參種植方式選擇提供理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Influence of buds removal on content of ginsenosides and phytohormones in different part of similar wild

LUO Jia-yi1, LUO Yi-lu1, HAN Hong-liang1, Galina Ramskaya2, YU Juan3, LIN Xue-mei3, SHEN Ling-ling4, HE Xin1, JI Rui-feng1

1. Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow 119991, Russia 3. Lafang China Co., Ltd., Shantou 515041, China 4. Guangzhou Analytical Applications Center, Shimadzu (China) Co., Ltd., Guangzhou 510640, China

To provide basis for the optimization of planting mode of, and investigate the effects of buds removal on the contents of main ginsenosides and plant hormones like salicylic acid and abscisic acid in various parts of similar wild ginseng, including aerial part: leaf, petiole, stem tip, middle part stem base, and underground part: rhizome, root bark, root heart, lateral root and fibrous root. Moreover, the further study focus on the correlation of content between ginsenosides and plant hormones.The major ginsenosides and plant hormones ofin 10 parts were accurately quantified using UPLC-MS/MS technology. The quality ofaffected by buds removal was evaluated using one-way ANOVA, and the correlation between the content of plant hormones and ginsenosides was investigated using Spearman correlation analysis.The methodologies that had been established were reliable and practical. Total ginsenosides in root bark (＜0.05) and lateral root (＜0.001) of similar wild ginseng in the buds removed group were significantly increased, whereas total ginsenosides in aboveground parts of similar wild ginseng, including leaves, petioles, and stems, were significantly decreased (＜0.001). The contents of ginsenoside Rd in rhizome(＜0.05) and root bark (＜0.01) in buds removed group were significantly increased. The contents of salicylic acid in the root bark and root heart of ginseng in buds removed group were significantly decreased (＜0.001). Salicylic acid was positively correlated with ginsenoside Rb1and Rg1, and negatively correlated with ginsenoside Rg3and F1contents.Removal of buds significantly increased the content of total ginsenosides in the underground parts ofexcept fibrous roots, but decreased in the above-ground part, leading to an increase in the comprehensive value of forest cultivated ginseng. Furthermore, buds removal can cause changes in salicylic acid content, which was correlated to the change of ginsenoside contents.

C. A. Meyer; buds removal; ginsenoside Rb1; ginsenoside Rg3; ginsenoside Rd; salicylic acid; abscisic acid; UPLC-MS/MS

R286.2

A

0253 - 2670(2023)04 - 1243 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.025

2022-08-06

2022年廣東省科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金（“攀登計(jì)劃”專項(xiàng)資金）（pdjh2022a0260）；2021年汕頭市精細(xì)化工企業(yè)引進(jìn)科技領(lǐng)軍人才團(tuán)隊(duì)及進(jìn)口替代攻關(guān)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（STLT2021007）；廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目（20212125）；2021年度廣東省科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金（“攀登計(jì)劃”）（pdjh2021b0262）

羅嘉儀（1997—），女，在讀碩士，從事中藥分析及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: logaga2@163.com

何 新，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥理與中藥藥動(dòng)學(xué)研究。E-mail: hexintn@gdpu.edu.cn

紀(jì)瑞鋒，博士，講師，從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制研究。E-mail: jiruifeng@edpu.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]