徐宏宏，昌 瀟，羅 瓊，張 波, 2*

阿卡寧下調(diào)Trx/Akt通路誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡的作用研究

徐宏宏1，昌 瀟1，羅 瓊1，張 波1, 2*

1. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實驗室，新疆 石河子 832002 2. 成都大學(xué)藥學(xué)院，四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610106

探討新疆紫草代表成分阿卡寧對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60的抑制作用及機(jī)制。取對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，采用臺盼藍(lán)法檢測阿卡寧、紫草素處理后的細(xì)胞增殖抑制率；Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；通過系統(tǒng)藥理學(xué)方法篩選出阿卡寧以及急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的共同靶點(diǎn)并分析得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）熒光探針法、差示掃描熒光分析實驗在體外分子水平驗證化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合能力。通過Western blotting檢測凋亡通路標(biāo)志分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、cleaved Caspase-3、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）蛋白表達(dá)。阿卡寧呈劑量相關(guān)性抑制HL-60細(xì)胞增殖。Hoechst染色后熒光顯微鏡下可見阿卡寧處理后的HL-60細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞縮小、染色質(zhì)顏色加深、染色質(zhì)逐漸碎片化等的凋亡形態(tài)；與對照組比較，阿卡寧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.001），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.01），Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（＜0.01、0.001）；通過系統(tǒng)藥理學(xué)篩選得到阿卡寧和AML共有靶點(diǎn)96個，對共有靶點(diǎn)分析得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）中度值較高的靶點(diǎn)是蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，CYCS）、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TXNRD）等?；虮倔w（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析表明阿卡寧治療AML主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞凋亡過程的正調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程，涉及的分子功能有蛋白結(jié)合、氧化還原酶活性，信號通路主要包括癌癥相關(guān)信號通路。共價對接結(jié)果表明，阿卡寧與硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）活性位點(diǎn)半胱氨酸形成共價鍵。體外分子水平結(jié)果顯示阿卡寧可以與谷胱甘肽（glutathione，GSH）、Trx結(jié)合。Western blotting結(jié)果顯示阿卡寧可顯著下調(diào)Trx、Akt、p-Akt的表達(dá)（＜0.05、0.001）。阿卡寧誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與下調(diào)Trx/Akt通路有關(guān)。

紫草；阿卡寧；凋亡；Trx/Akt通路；巰醇；急性髓系白血病細(xì)胞

白血病作為血液腫瘤，是惡性程度最高、治療方法最棘手、愈后易復(fù)發(fā)的血液疾病[1]。最新國家兒童腫瘤監(jiān)測報告顯示白血病仍是兒童患病人群最多的重大惡性疾病，占比57.1%。而白血病中急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）成人發(fā)病率最高，兒童位居第2，占兒童白血病死亡率50%以上。目前AML的臨床治療手段有造血干細(xì)胞移植、化療、放療、免疫治療、靶向藥物治療等[2]?；熓鞘走x方法，但AML患者在初次誘導(dǎo)治療后難以治愈且易復(fù)發(fā)[3]。因此，尋找新的治療方法和治療靶點(diǎn)，以提高患者的順應(yīng)性和生活質(zhì)量至關(guān)重要。

阿卡寧是從紫草Sieb. et Zucc.的根部提取而來的天然產(chǎn)物，是紫草的主要的活性成分之一。阿卡寧具有多種生物活性，其中抗癌活性引起廣泛關(guān)注。據(jù)報道，阿卡寧對乳腺癌MCF-7細(xì)胞、白血病K562細(xì)胞、前列腺癌DU145細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[4]。研究表明，紫草中的另一個主要活性成分紫草素對慢性髓系白血病K562、CLL細(xì)胞以及B細(xì)胞前淋巴白血病JVM-13細(xì)胞、急性髓系早幼粒白血病NB4細(xì)胞等白血病細(xì)胞、人急性髓系白血病細(xì)胞HL-60均有抑制作用[5-9]。根據(jù)美國國立癌癥研究（National cancer institut 60，NCI60）數(shù)據(jù)庫顯示紫草素對HL60細(xì)胞最為敏感，紫草素的這一特點(diǎn)為本研究提供了抗AML藥物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。作為紫草素的異構(gòu)體，阿卡寧對AML的作用鮮有報道。因此本研究以HL-60細(xì)胞為模型探究阿卡寧的藥效及相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

HL-60細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥品與試劑

阿卡寧（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號T31290）購自上海源葉生物科技有限公司；紫草素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號3275584）購自EMD Millipore公司；胎牛血清（批號2033119）購自以色列BI公司；1%青霉素鏈霉素混合液（批號10378016）、IMDM培養(yǎng)基（批號12200069）購自美國Gibco公司；AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶（PI）試劑盒（批號A10642）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號9272S）、p-Akt抗體（批號4060T）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號9665S）、cleaved Caspase-3抗體（批號9664S）購自美國CST公司；硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）抗體（批號ab109385）購自英國Abcam公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號ZP76488P48）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號13CM400B）購自武漢博士德生物工程有限公司；β-actin抗體（批號211050331）購自北京全式金生物公司；羊抗兔IgG二抗（批號133499）、羊抗鼠IgG二抗（批號219760401）購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

313型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；ZHJH 1112B型超凈工作臺（上海智誠分析儀器有限公司）；BDS200-PH型倒置生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；Imager.M2型正置熒光顯微鏡（德國ZEISS公司）；5424型低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；FACS-Calibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；Q5000型超微量核酸蛋白測定儀（美國Quawell公司）。

2 方法

2.1 體外細(xì)胞水平藥效

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞抑制率的測定 細(xì)胞培養(yǎng)于含20%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素混合液的IMDM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)液總體積為2 mL。分別加入不同濃度的阿卡寧、紫草素，藥物終濃度分別為0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L，每組設(shè)3個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)。紫草素作用24 h后終止培養(yǎng)，阿卡寧分別培養(yǎng)24、48、72 h后終止培養(yǎng)。每孔細(xì)胞吹勻后，取20 μL細(xì)胞液與20 μL 0.4%臺盼藍(lán)混合，使用計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，計算細(xì)胞抑制率[10]。

細(xì)胞抑制率＝1－給藥組活細(xì)胞數(shù)/對照組活細(xì)胞數(shù)

2.1.2 Hoechst 33258染色 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，離心去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定液固定10 min，離心去固定液，用PBS洗3遍，最后吸去大部分液體保留約50 μL液體，緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上，盡量使細(xì)胞分布均勻。稍晾干，使細(xì)胞貼在載玻片上不易隨液體流動均勻滴加Hoechst 33258染液，染色5 min。用吸水紙吸去邊緣液體，微晾干，用PBS洗2遍，蓋上蓋玻片于熒光顯微鏡下觀察。

2.1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個，分別加入終濃度為0、0.5、1、2 μmol/L的阿卡寧及1 μmol/L的紫草素，孵育24 h后收集細(xì)胞。細(xì)胞收集后用冷PBS洗2次，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min。上機(jī)前加入5 μL PI，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測，利用Flow Jo軟件分析數(shù)據(jù)。

2.1.4 Western blotting法檢測蛋白表達(dá) HL-60細(xì)胞經(jīng)0、0.5、1、2 μmol/L阿卡寧處理24 h后，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗2遍，加入250 μL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清。蛋白測定儀測定蛋白濃度，蛋白經(jīng)煮沸處理后，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1h后，分別加入Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、Trx、Akt、p-Akt抗體，4 ℃孵育過夜；次日以TBST洗膜4次，每次5 min洗去一抗，加入二抗，室溫孵育1 h；以TBST洗膜4次，每次5 min洗去二抗，加入ECL顯色液，經(jīng)免疫印跡成像系統(tǒng)顯影檢測目的蛋白[11]，利用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

2.2 體外分子水平藥物-靶點(diǎn)互作

2.2.1 鄰苯二甲醛熒光（o-phthalaldehyde，OPA）法[12]測定谷胱甘肽（glutathione，GSH）結(jié)合特征 向96孔板中加入終濃度分別為0.1、1、10、100、1000 μmol/L的阿卡寧，隨后加入等體積終濃度為1000 μmol/L的GSH溶液，震蕩混勻后，室溫孵育4 h。隨后每孔加入10 μL OPA溶液，震蕩混勻，室溫避光孵育40 min。采用酶標(biāo)儀于340 nm激發(fā)波長、420 nm發(fā)射波長測定熒光強(qiáng)度，計算GSH結(jié)合率。

GSH結(jié)合率＝給藥組熒光值/對照組熒光值

2.2.2 差示掃描熒光法[13]測定蛋白巰醇結(jié)合特征 將在PBS中的蛋白樣品（2 mg/mL）在Rotor-Gene中以20 μL的反應(yīng)體積孵育。終濃度為1.5、3、6 μmol/L的阿卡寧分別與硫氧還蛋白在37 ℃孵育0、4、6 h。Sypro Orange稀釋25倍。將樣品從35 ℃加熱到60 ℃，以1 ℃為增量進(jìn)行熒光采集。使用Rotor-Gene上的高分辨率熔解（HRM）通道獲取熒光測量結(jié)果。

2.3 系統(tǒng)藥理學(xué)[14]分析

2.3.1 阿卡寧及AML相關(guān)靶點(diǎn)的收集 利用Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）數(shù)據(jù)庫獲取阿卡寧的相關(guān)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)信息，選取score值大于2.394的靶點(diǎn)。利用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、Disgenet（https://www.disgenet. org/）數(shù)據(jù)庫，以AML為詞條獲得AML相關(guān)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后選擇score值大于2.37的靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析[15-16]。

2.3.2 阿卡寧及AML相關(guān)靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將阿卡寧及AML的靶點(diǎn)輸入Venn（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/ example.html）數(shù)據(jù)庫得到化合物-疾病共同靶點(diǎn)，將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫以獲得PPI，設(shè)置條件物種為人源、置信分?jǐn)?shù)為高置信度。將篩選得到的PPI信息導(dǎo)出，輸入到Cytoscape以實現(xiàn)可視化。以不同的節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，用節(jié)點(diǎn)的度值進(jìn)行評估。度值是指以靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，與其他節(jié)點(diǎn)相連的線數(shù)量。線數(shù)量越多，節(jié)點(diǎn)度值越高，節(jié)點(diǎn)越大節(jié)點(diǎn)顏色越深，該節(jié)點(diǎn)越重要。

2.3.3 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）數(shù)據(jù)庫中的基因列表，選擇基因名稱“OFFICIAL GENE SYMBOL”形式，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析，將信息導(dǎo)出，上傳至Bioinformatics（http://www. bioinformatics.com.cn/）在線數(shù)據(jù)分析可視化平臺進(jìn)行繪圖。

2.3.4 阿卡寧活性位點(diǎn)預(yù)測 通過PubChem獲得阿卡寧結(jié)構(gòu)，將結(jié)構(gòu)上傳至QSAR（OECD QSAR Tool Box-DPRA Cystine Peptide，3.2.0，2013），選擇DPRA Cysteine peptide模塊以預(yù)測阿卡寧消耗巰基的活性部位。DPRA Cysteine peptide的原理為從已被實驗驗證過具有消耗半胱氨酸的112個化合物中提取32個具有消耗巰基的特征結(jié)構(gòu)構(gòu)建訓(xùn)練集，與待測化合物比對，若一致則認(rèn)定具有消耗巰基的性質(zhì)。

2.3.5 共價對接 人Trx的晶體結(jié)構(gòu)獲取自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB ID：4PUF），使用Schr?dinger 2022-1套裝軟件中的蛋白質(zhì)制備工具（ProPrep）制備蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過具有優(yōu)化氫鍵網(wǎng)絡(luò)的Maestro中的PROPKA工具在pH 7.0添加氫原子。賦予OPLS-2005力場并對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量優(yōu)化，將晶體結(jié)構(gòu)中的所有配體都提取出來。配體阿卡寧的結(jié)構(gòu)在PubChem中獲得并經(jīng)過LigPrep進(jìn)行準(zhǔn)備，使用OPLS-2005在pH 7.0下生成低能構(gòu)象。使用Glide Docking模塊進(jìn)行共價對接。以Cys32和Cys35作為共價對接的反應(yīng)殘基，選擇對接反應(yīng)為邁克爾加成，使用PyMOL對對接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 阿卡寧、紫草素對HL-60細(xì)胞增殖的影響

臺盼藍(lán)拒染法檢測阿卡寧及紫草素對HL-60細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖1所示，阿卡寧及紫草素均能明顯抑制HL-60細(xì)胞增殖，隨著濃度的增加，阿卡寧、紫草素對細(xì)胞增殖的抑制率逐漸升高，呈劑量相關(guān)性。分析得出阿卡寧對HL-60細(xì)胞24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為（1.68±0.16）、（1.25±0.02）、（1.24±0.02）μmol/L，紫草素作用HL-60細(xì)胞24 h的IC50為（0.74±0.01）μmol/L，阿卡寧作用HL-60細(xì)胞24 h的IC50高于紫草素，說明二者的抑制作用有差異。48 h和72 h時抑制結(jié)果接近，且在2 μmol/L時阿卡寧的抑制率急劇上升，說明阿卡寧作用時間延長時作用窗口變窄。2 μmol/L阿卡寧作用HL-60細(xì)胞24 h后對其增殖的抑制率就已達(dá)到50%以上，因此選擇0.5、1、2 μmol/L阿卡寧進(jìn)行后續(xù)實驗，1 μmol/L紫草素作用HL-60細(xì)胞24 h的抑制率達(dá)到68.22%，因此選擇1 μmol/L紫草素作為陽性對照。

3.2 阿卡寧對HL-60細(xì)胞形態(tài)及核形態(tài)的影響

如圖2所示，對照組細(xì)胞核呈均勻的淡藍(lán)色熒光且細(xì)胞呈飽滿的類圓形形態(tài)，經(jīng)0.5 μmol/L的阿卡寧處理后部分細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，說明細(xì)胞核濃縮。1 μmol/L的阿卡寧處理后細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)高度濃集成亮藍(lán)色，2 μmol/L時可見細(xì)胞染色質(zhì)更多的呈現(xiàn)分葉狀、碎片狀等細(xì)胞凋亡下的核形態(tài)。

圖1 阿卡寧及紫草素對HL-60細(xì)胞增殖的影響(, n = 3)

圖2 阿卡寧對HL-60細(xì)胞核形態(tài)的影響

3.3 阿卡寧、紫草素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡

如圖3所示，阿卡寧處理HL-60細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率隨著給藥濃度的增加而增加，呈劑量相關(guān)性。0、0.5、1、2 μmol/L的阿卡寧處理后的細(xì)胞凋亡率以及1 μmol/L紫草素處理后的凋亡率分別為（0.12±0.04）%、（13.50±2.87）%、（25.32±4.84）%、（29.68±1.48）%、（57.77±11.03）%。與對照組比較，1、2 μmol/L阿卡寧處理后的細(xì)胞凋亡率均顯著升高（＜0.001），2 μmol/L阿卡寧組細(xì)胞壞死明顯增多，紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯高于阿卡寧。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，圖4、12同

3.4 阿卡寧對HL-60細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組比較，0.5、1、2 μmol/L 阿卡寧處理24 h后，細(xì)胞cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.001）；1、2 μmol/L阿卡寧處理24 h后，Bax蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（＜0.01、0.001），Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.01）。表明阿卡寧可以通過影響凋亡蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。

3.5 阿卡寧抗AML靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將獲取的阿卡寧和AML的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到96個阿卡寧作用AML的潛在靶點(diǎn)見圖5。將交集靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫得到靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，通過Cytoscape可視化及分析后發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)主要有Akt、細(xì)胞色素C（cytochrome c，CYCS）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3）、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TXNRD）等（圖6）。

圖4 阿卡寧對HL-60細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖5 阿卡寧和AML靶點(diǎn)Venn圖

圖6 阿卡寧和AML共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

3.6 阿卡寧作用AML的潛在靶點(diǎn)GO功能和KEGG通路富集分析

GO功能分析共得生物過程（biological process，BP）285個條目（＜0.05）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）55個條目（＜0.05）、分子功能（molecular function，MF）87個條目（＜0.05），按值排序，選取排名前20的條目可視化，結(jié)果如圖7所示，阿卡寧治療AML主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞凋亡過程的正調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等BP，涉及的MF有蛋白結(jié)合、氧化還原酶活性。KEGG通路富集分析共得79條信號通路按值排序，選取排名前20的條目可視化，結(jié)果如圖8所示，氣泡的大小表示包含的基因數(shù)的多少，顏色由藍(lán)到綠表示該通路值由小到大。分析富集的通路發(fā)現(xiàn)，主要有癌癥相關(guān)信號通路等。

3.7 阿卡寧可與巰基肽及蛋白結(jié)合

經(jīng)QSAR巰基消耗活性預(yù)測，阿卡寧具有巰基消耗特性，活性部位為圖9-A所示的紅色區(qū)域，進(jìn)一步對阿卡寧與巰基蛋白Trx進(jìn)行共價對接，結(jié)果顯示阿卡寧可以與Trx的第32位半胱氨酸殘基形成共價鍵（圖9-B、C所示）。隨后在分子水平驗證阿卡寧與巰基的結(jié)合能力，結(jié)果如圖10所示，阿卡寧可以與巰基GSH結(jié)合且呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。通過差示掃描熒光分析實驗可知，3、6 μmol/L阿卡寧與Trx及熒光染料分別共孵育4、6 h后蛋白質(zhì)被打開所需的溫度（melting temperature，m）均上升0.5 ℃，說明阿卡寧可以與Trx結(jié)合（圖11）。

圖7 GO功能富集分析

圖8 KEGG通路富集分析

圖9 QSAR預(yù)測阿卡寧巰基消耗結(jié)構(gòu) (紅色部分，A)、阿卡寧與Trx結(jié)合的3D圖(B) 和3D surface圖(C)

圖10 阿卡寧與GSH的結(jié)合率

3.8 阿卡寧對HL-60細(xì)胞Trx/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖12所示，阿卡寧處理HL-60細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)Trx、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)逐漸減少，呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。與對照組比較，阿卡寧（0.5、1、2 μmol/L）組Trx蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.001），阿卡寧（0.5 μmol/L）組p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.001），阿卡寧（1 μmol/L）組Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），表明阿卡寧可能通過抑制Trx而影響Akt的表達(dá)及磷酸化。

圖11 1.5、3、6 μmol·L?1阿卡寧與Trx和Sypro-Orange反應(yīng)0、4、6 h后熔解溫度變化

圖12 阿卡寧對HL-60細(xì)胞Trx/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

AML是由造血干細(xì)胞異?？寺?dǎo)致的具有生物學(xué)特性高度異質(zhì)性的惡性血液疾病。用于AML的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)化化療（結(jié)合蒽環(huán)類和阿糖胞苷）已經(jīng)使用了很多年。盡管近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多新的治療AML的分子靶點(diǎn)及化合物，為許多患者提供了個性化的治療選擇[17]，但AML患者高復(fù)發(fā)率和預(yù)后差這些問題依然存在[18]。因此尋找新的抗AML的化合物可以為全面治療AML提供更多選擇。

天然產(chǎn)物是治療藥物的重要來源，在癌癥治療中受到越來越多的關(guān)注。新疆紫草清熱涼血的功效認(rèn)識由來已久，近年來研究人員發(fā)現(xiàn)紫草質(zhì)量標(biāo)志物的萘醌化合物中紫草素具有優(yōu)良的抗白血病活性[19]，作為紫草素的立體異構(gòu)體阿卡寧在白血病中的作用鮮有報道，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似作用可能相似原理，本研究著重研究了阿卡寧作用白血病細(xì)胞的藥效，并初步探索其潛在的分子機(jī)制。

藥效學(xué)相關(guān)實驗結(jié)果顯示阿卡寧、紫草素均可以抑制HL-60細(xì)胞增殖，而阿卡寧的抑制作用稍弱，同時流式結(jié)果顯示在相同濃度1 μmol/L下，紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率更高，阿卡寧在2 μmol/L時細(xì)胞壞死增多，誘導(dǎo)的凋亡與壞死的結(jié)果總和接近于1 μmol/L紫草素的抑制結(jié)果。紫草素與阿卡寧互為立體異構(gòu)體，文獻(xiàn)報道紫草素對多種癌細(xì)胞具有活性，但還未能進(jìn)入臨床原因之一在于其有較強(qiáng)的毒性，紫草素對正常人肝細(xì)胞L-02的IC50為3.41 μmol/L，而阿卡寧對L-02的IC50在55.04 μmol/L毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于紫草素[20-21]。因此展開對阿卡寧誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究。

為了明晰這一機(jī)制，通過系統(tǒng)藥理學(xué)收集了阿卡寧及AML的相關(guān)靶點(diǎn)，并對二者的共同靶點(diǎn)進(jìn)行分析。經(jīng)過Cytoscape軟件可視化PPI網(wǎng)絡(luò)后可知Akt、CASP3、TXNRD等具有較高的度值，其中CASP3與藥效學(xué)實驗結(jié)果一致，實驗證明阿卡寧可影響Caspase-3及cleaved Caspase-3的表達(dá)。Akt在這其中度值最高，說明它可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。KEGG通路富集分析顯示阿卡寧及AML的共同靶點(diǎn)更多的集中在癌癥通路中，GO功能分析顯示阿卡寧治療AML的靶點(diǎn)主要涉及對細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程，以上結(jié)果進(jìn)一步證明Akt信號通路可能參與HL-60細(xì)胞的凋亡過程。阿卡寧與AML共同靶點(diǎn)涉及的分子功能有蛋白結(jié)合，氧化還原酶活性等這與PPI網(wǎng)絡(luò)可視化中得到的TXNRD可能相關(guān)。TXNRD為硫氧還蛋白還原酶，主要作用是還原氧化的Trx，還原狀態(tài)的Trx可以還原氧化的蛋白而調(diào)節(jié)蛋白活性，是細(xì)胞內(nèi)非常重要的氧化還原蛋白[22]。進(jìn)一步文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)Trx可能與Akt有關(guān)。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，Akt被激活后會調(diào)節(jié)許多參與細(xì)胞存活、增殖、遷移、代謝和血管生成的下游蛋白質(zhì)的功能[23]。在許多類型的人類癌癥中經(jīng)常失調(diào)，包括卵巢癌、肺癌、胰腺癌、白血病[24]。研究報道60%～80% AML患者中PI3K/Akt通路是上調(diào)的[25]，Akt通過PI3K激活后可以通過抑制凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2細(xì)胞死亡拮抗劑BAD和Caspase-9來阻斷細(xì)胞凋亡，它還可以磷酸化MDM2，降解p53以抑制細(xì)胞凋亡[26-27]。磷酸酶和張力蛋白同系物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一種腫瘤抑制因子，是PI3K的主要拮抗劑，因此也是PI3K/Akt途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子[28]。功能性PTEN的缺失導(dǎo)致激活A(yù)kt的PIP3水平升高，從而激活A(yù)kt及下游信號通路[29]，因此PTEN可通過抑制Akt磷酸化來誘導(dǎo)凋亡。而PTEN的活性由Trx調(diào)節(jié)，生理狀態(tài)下Trx由TrxR還原，在白血病細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的Trx可導(dǎo)致PTEN減少，抑制其磷酸酶活性，使細(xì)胞中Akt的活化增加[30]。這與本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析所得結(jié)果一致，因此推測抑制Trx可能會抑制Akt的活化。

通過巰基消耗結(jié)構(gòu)預(yù)測及共價對接預(yù)測阿卡寧與巰基蛋白Trx的結(jié)合能力，結(jié)果顯示阿卡寧可以與巰基結(jié)合并且可以與Trx的32位半胱氨酸形成共價鍵，于是在分子水平驗證了阿卡寧與巰基肽和蛋白的結(jié)合能力，結(jié)果顯示阿卡寧可以與小分子肽及Trx結(jié)合。進(jìn)一步采用Western blotting檢測Trx、Akt、p-Akt的表達(dá)，結(jié)果顯示阿卡寧可以抑制Trx、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)。研究表明阿卡寧的立體異構(gòu)體紫草素可同時抑制Akt及p-Akt蛋白的表達(dá)從而抑制MCF-7細(xì)胞增殖[31]，紫草素還可調(diào)控PTEN/Akt通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[32]。本研究在阿卡寧處理的HL-60細(xì)胞中也觀察到了相似的結(jié)果，結(jié)果表明阿卡寧處理過后細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3減少、cleaved Caspase-3升高，Bcl-2降低，Bax升高并且Akt及磷酸化Akt均被顯著抑制。根據(jù)結(jié)果推測阿卡寧可能通過降低Trx蛋白的表達(dá)來使PTEN增加，抑制Akt及Akt的進(jìn)一步磷酸化，影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制HL-60細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

因此本研究發(fā)現(xiàn)阿卡寧具有良好的抗白血病的活性，有助于闡明阿卡寧抗白血病的分子機(jī)制，可為其治療白血病的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，也可為紫草萘醌化合物的現(xiàn)代開發(fā)應(yīng)用提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of alkannin on apoptosis of acute myeloid leukemia cells by down-regulating Trx/Akt pathway

XU Hong-hong1, CHANG Xiao1, LUO Qiong1, ZHANG Bo1, 2

1. Xinjiang Key Laboratory of Plant Medicine Resource Utilization, Ministry of Education, School of Pharmacy, Shihezi University, Shihezi 832002, China 2. Sichuan Antimicrobial Industry Research Institute, School of Pharmacy, Chengdu University, Chengdu 610106, China

To investigate the inhibitory effect and mechanism of alkannin (ALK), a representative component of, on HL-60 cells of acute myeloid leukemia.HL-60 cells in logarithmic proliferation phase were selected, and inhibitory rate of cell proliferation after treatment with ALK and shikonin (SK) was detected by trypan blue method; Hoechst 33258 staining was used to observe the cell morphology; Apoptosis rate was detected by flow cytometry; Systematic pharmacological methods was used to screen the common targets of ALK and acute myeloid leukemia (AML) and the key targets were analyzed. The binding ability of compound with target was verified at the molecular level by an o-phthalaldehyde (OPA) fluorescence probe and differential scanning fluorescence analysis. The protein expressions of apoptosis pathway marker cystein-asparate protease-3 (Caspase-3), cleaved Caspase-3, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and Bcl-2 associated X protein (Bax) were detected by Western blotting.ALK inhibited the proliferation of HL-60 cells in a dose-dependent manner. Under fluorescence microscope after Hoechst staining, HL-60 cells treated with ALK showed apoptosis morphology, such as cell shrinkage, chromatin color deepening, chromatin fragmentation, etc; Compared with control group, apoptosis rate induced by ALK was significantly increased (< 0.001), Bcl-2 protein expression was significantly decreased (< 0.01), Bax and cleared Caspase-3 protein expressions were significantly increased (< 0.01, 0.001); A total of 96 common targets of ALK and AML were obtained through systematic pharmacological screening, and the higher degree targets in protein-protein interaction (PPI) network were protein kinase B (Akt), cystein-asparate protease-3 (CASP3), cytochrome C (CYCS), thioredoxin reductase (TXNRD), etc. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis showed that the treatment of AML with ALK was mainly related to the positive regulation of RNA polymerase II promoter transcription, apoptosis, and signal transduction regulation, involved molecular functions include protein binding and oxidoreductase activity, signal pathways mainly including cancer-related signal pathways. The results of covalent docking showed that ALK formed a covalent bond with cysteine at the active site of thioredoxin (Trx). Molecular results showed that ALK could bind to glutathione (GSH) and Trx. Western blotting results showed that ALK could significantly down-regulate the expressions of Trx, Akt, and p-Akt (< 0.05, 0.001).ALK induced apoptosis of HL-60 cells, which is related to the inhibition of the Trx/Akt pathway.

Sieb. et Zucc.; alkannin; apoptosis; Trx/Akt pathway; thoils; acute myeloid leukemia

R285.5

A

0253 - 2670(2023)04 - 1138 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.013

2022-11-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（U1603122）；新疆兵團(tuán)科技創(chuàng)新領(lǐng)域中青年領(lǐng)軍人才項目（2018CB019）；新疆兵團(tuán)英才計劃項目（CZ000601）

徐宏宏（1995—），女，碩士生，研究方向為中藥藥理學(xué)與系統(tǒng)藥理學(xué)。Tel: 13239932721 E-mail: xuhh2018@163.com

張 波（1978—），男，研究生導(dǎo)師，教授，從事系統(tǒng)藥理學(xué)與中藥藥理學(xué)研究。E-mail: bozhang_lzu@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]