任 慧，郭 盛*，張祎盈，李 全，王恒斌，耿婉麗，錢大瑋，段金廒

補(bǔ)肺活血膠囊大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定及代謝途徑分析

任 慧1，郭 盛1*，張祎盈1，李 全2，王恒斌2，耿婉麗3，錢大瑋1，段金廒1

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023 2. 雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 蘇州 215003 3. 廣東雷允上藥業(yè)有限公司，廣東 云浮 527300

研究補(bǔ)肺活血膠囊（Bufei Huoxue Capsules，BHC）在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中的原型成分及其代謝產(chǎn)物，歸納總結(jié)不同類型化合物的體內(nèi)代謝規(guī)律。大鼠ig BHC后，收集血漿、膽汁、尿液和糞便樣品并進(jìn)行預(yù)處理，采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）及質(zhì)量虧損過(guò)濾技術(shù)，分別在正、負(fù)離子模式下對(duì)原型成分及代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。共檢測(cè)到?jīng)]食子酸、芍藥苷、毛蕊異黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、()-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂苷等原型成分及代謝產(chǎn)物67個(gè)，其中酚酸類成分10個(gè)、單萜類成分7個(gè)、黃酮類成分35個(gè)、香豆素類成分12個(gè)、皂苷類成分3個(gè)，主要代謝途徑包括氧化、還原、甲基化、葡糖醛酸結(jié)合、硫酸結(jié)合等。初步闡明了BHC大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及其代謝轉(zhuǎn)化特征，為基于體內(nèi)過(guò)程揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定了基礎(chǔ)，為其臨床安全用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

補(bǔ)肺活血膠囊；代謝產(chǎn)物鑒定；代謝途徑分析；UPLC-Q-TOF-MS；沒(méi)食子酸；芍藥苷；毛蕊異黃酮；新補(bǔ)骨脂異黃酮；()-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮；補(bǔ)骨脂苷；黃芪甲苷

補(bǔ)肺活血膠囊（Bufei Huoxue Capsules，BHC）收載于《中國(guó)藥典》2020年版，由黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂3味中藥組成，具有益氣活血、補(bǔ)肺固腎等功效，是治療肺心?。ň徑馄冢贇馓撗鲎C的有效復(fù)方[1]。大量研究表明，BHC被廣泛應(yīng)用于塵肺病[2]、肺纖維化[3]、慢性阻塞性肺疾病[4]、新型冠狀病毒肺炎[5-7]等多種呼吸道疾病的治療?，F(xiàn)代研究顯示，BHC含有酚酸類、單萜類、黃酮類、香豆素類、皂苷類等化學(xué)成分[8]，在質(zhì)量控制[9-10]、藥理作用[11]、臨床應(yīng)用[3-4]等多個(gè)領(lǐng)域已開(kāi)展了系列研究，然而關(guān)于其活性組分體內(nèi)代謝過(guò)程研究報(bào)道較少。課題組前期對(duì)BHC吸收入血的原型成分進(jìn)行“藥-時(shí)”曲線繪制及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算，闡明其體內(nèi)吸收規(guī)律[12]，但其體內(nèi)代謝途徑及代謝產(chǎn)物尚未見(jiàn)報(bào)道。

藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物研究可明確活性組分在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供參考。中藥復(fù)方具有成分組成復(fù)雜、化學(xué)結(jié)構(gòu)及代謝途徑多樣、內(nèi)源性成分干擾因素多、生物樣本中目標(biāo)組分濃度低等特點(diǎn)，增加了其代謝產(chǎn)物鑒定的難度[13]。唐清等[8]采用UFLC-Triple TOF MS/MS技術(shù)對(duì)BHC中體外化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了定性分析，共確證和指認(rèn)了42個(gè)化合物。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ultra-high performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS），運(yùn)用碰撞能量梯度（MSE）及質(zhì)量虧損過(guò)濾技術(shù)，快速分析鑒定BHC在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中的代謝產(chǎn)物，并對(duì)黃芪中的毛蕊異黃酮等黃酮類及黃芪甲苷等皂苷類成分、赤芍中的沒(méi)食子酸等酚酸類及芍藥苷等單萜類成分、補(bǔ)骨脂中的新補(bǔ)骨脂異黃酮等黃酮類及補(bǔ)骨脂苷等香豆素類成分的代謝規(guī)律進(jìn)行闡釋，以期闡明BHC在生物體內(nèi)的代謝規(guī)律，為臨床安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AcquityTMUPLC系統(tǒng)、SynaptTMQ-TOF質(zhì)譜儀（配有Lock-spray接口，電噴霧離子源ESI）、MassLynx 4.2質(zhì)譜工作站軟件、MetaboLynx XS分析軟件（美國(guó)Waters公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（頻率40 kHz，功率250 W，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；MS105型萬(wàn)分之一、ML204型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Anke GL-16G Ⅱ型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Millipore-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品沒(méi)食子酸（批號(hào)Y19M8C36143）、芍藥苷（批號(hào)X12A8C33672）、氧化芍藥苷（批號(hào)Z14J9S63652）、沒(méi)食子酰芍藥苷（批號(hào)P08A10S85131）、芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)Y15D8H50784）、毛蕊異黃酮（批號(hào)Y24N9Y75652）、芒柄花素（批號(hào)F27J7S18516）、新補(bǔ)骨脂異黃酮（批號(hào)ZN1112BD13）、補(bǔ)骨脂寧（批號(hào)ZN1112BA13）、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷（批號(hào)Y28M10H84302）、()-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮（批號(hào)YM0509HA1）、補(bǔ)骨脂甲素（批號(hào)C19J8G28797）、補(bǔ)骨脂苷（批號(hào)Y07A7S12664）、補(bǔ)骨脂素（批號(hào)C22A9Q68562）、異補(bǔ)骨脂苷（批號(hào)Y27A9S60238）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)C05M10Q82078）、黃芪甲苷（批號(hào)J04M8T30363），以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；BHC（批號(hào)022004）由廣州雷允上藥業(yè)有限公司提供。甲醇、乙醇為色譜純（德國(guó)Merck公司）；甲酸為色譜純（美國(guó)ACS公司）；超純水為Milli-Q純水機(jī)制備。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（浙）2019-0001，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)202010A027），飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)內(nèi)，溫度（20±2）℃，濕度（60±5）%，12 h光照和黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食及進(jìn)水。

2 方法

2.1 BHC給藥溶液及對(duì)照品溶液的制備

精密稱取BHC粉末適量，以0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液混懸制成質(zhì)量濃度為0.378 g/mL的混懸液。分別精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇溶解并定容，分別制成沒(méi)食子酸、芍藥苷、氧化芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂寧、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、()-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂素、黃芪甲苷為2.143、1.452、1.562、1.937、1.748、1.194、1.375、1.465、1.356、1.160、2.047、1.503、1.382、2.405、2.156、2.366、1.794mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

雄性SD大鼠18只，隨機(jī)分為空白組、血漿組、膽汁組、尿液/糞便組；空白組分為血漿空白組、膽汁空白組、尿液/糞便空白組，每組3只，共9只。其余各組均為給藥組，每組3只?？瞻捉M給予等體積0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組ig BHC 3.78 g/kg，連續(xù)給藥3 d。

2.3 生物樣品的采集

大鼠末次給藥前禁食12 h，自由飲水。血漿組大鼠，于給藥后0.5、1、2、4、6、8、10 h經(jīng)眼眶靜脈叢分別取血300 μL，分別置于預(yù)先涂有1%肝素鈉的EP管中，4000 r/min離心10 min，取上清，即得各時(shí)間點(diǎn)血漿樣品；膽汁組大鼠麻醉后，做膽管插管手術(shù)，收集10 h內(nèi)膽汁。尿液/糞便組大鼠置于代謝籠中，分別收集36 h內(nèi)尿液、糞便樣品，每6 小時(shí)收集1次。3個(gè)空白組大鼠，分別同法收集血漿樣品、膽汁樣品、尿液及糞便樣品。于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 生物樣品預(yù)處理

參考文獻(xiàn)中生物樣品的處理方式進(jìn)行樣品預(yù)處理[14-15]。取血漿組3只大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿樣品各50 μL，等量混合（共21個(gè)樣品），渦旋30 s，取混勻后的血漿樣品500 μL，加入3倍體積的乙腈，渦旋30 s，離心（13 000 r/min、10 min、4 ℃），取上清，37 ℃離心濃縮至干，以100 μL 50%甲醇復(fù)溶，離心（13 000 r/min、10 min、4 ℃）取上清，即得含藥血漿樣品溶液；空白血漿樣品溶液處理方法同含藥血漿樣品溶液；取膽汁組3只大鼠膽汁樣品300 μL，等量混合，渦旋30 s，取混勻后的膽汁樣品500 μL，加入500 μL乙腈沉淀蛋白，其余操作同血漿樣品，即得含藥膽汁樣品溶液；空白膽汁樣品溶液處理方法同含藥膽汁樣品溶液；取尿液組3只大鼠各時(shí)間點(diǎn)尿液樣品50 μL，等量混合（共18個(gè)樣品），渦旋30 s，取混勻后的尿液樣品500 μL，加入500 μL乙腈沉淀蛋白，其余操作同血漿樣品，即得含藥尿液樣品溶液；空白尿液樣品溶液處理方法同含藥尿液樣品溶液；取糞便組3只大鼠各時(shí)間點(diǎn)糞便樣品適量，等量混合（共18個(gè)樣品），取混勻后的糞便樣品1.0 g，加入50%甲醇300 μL，超聲30 min，離心（13 000 r/min、10 min、4 ℃），取上清液200 μL，加入200 μL甲醇，渦旋混勻，再次離心（13 000 r/min、10 min、4 ℃），取上清即得含藥糞便樣品溶液；空白糞便樣品溶液處理方法同含藥糞便樣品溶液。

2.5 色譜和質(zhì)譜條件

2.5.1 色譜條件 采用ACQUITYTMUPLC BEH T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～5 min，0～12% A；5～7 min，12% A；7～12 min，12%～30% A；12～15 min，30%～45% A；15～18 min，45%～85% A；18～20 min，85%～0 A，柱溫35 ℃；體積流量0.4 mL/min，進(jìn)樣量4 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式分別掃描；錐孔電壓40 V；毛細(xì)管電壓4 kV；脫溶劑氣溫度400 ℃；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣體積流量500 L/h；錐孔氣體積流量50 L/h；MS、MS/MS碰撞能量10～40 eV；質(zhì)量掃描范圍/100～1000；以亮氨酸-腦啡肽進(jìn)行精準(zhǔn)質(zhì)量實(shí)時(shí)校正，鎖校質(zhì)荷比分別為556.277 1（ESI+）和554.261 5（ESI?）。

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用MassLynx 4.2質(zhì)譜控制平臺(tái)，在MSE模式下采集分析樣本總離子流圖，分析各色譜峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，目標(biāo)物篩選采用MetaboLynx XS數(shù)據(jù)處理軟件及質(zhì)量虧損過(guò)濾技術(shù)，扣除空白生物樣品后，通過(guò)對(duì)比各成分對(duì)照品的保留時(shí)間及一級(jí)、二級(jí)特征離子碎片，參考相關(guān)文獻(xiàn)中特征離子碎片信息，推測(cè)各成分代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及分子式。基本參數(shù)設(shè)置為分析時(shí)間1～20 min，質(zhì)量虧損過(guò)濾范圍±5×104。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便UPLC-Q-TOF-MS分析

通過(guò)參考文獻(xiàn)中BHC提取液原型成分的質(zhì)譜信息[8]，比較給藥后大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便樣品和空白樣品的色譜圖，扣除生物樣品中的內(nèi)源性成分，分析發(fā)現(xiàn)樣品中含有原型成分及代謝產(chǎn)物67個(gè)，包括10個(gè)酚酸類、7個(gè)單萜苷類、35個(gè)黃酮類、12個(gè)香豆素類、3個(gè)皂苷類成分。各含藥樣品正、負(fù)離子模式下總提取離子流圖見(jiàn)圖1。

3.2 酚酸類成分代謝產(chǎn)物鑒定及代謝途徑分析

結(jié)果顯示，給藥大鼠體內(nèi)共檢測(cè)到酚酸類原型成分及代謝產(chǎn)物10個(gè)，見(jiàn)表1，具體代謝途徑見(jiàn)圖2。沒(méi)食子酸為赤芍中含有的酚酸類成分，本實(shí)驗(yàn)以沒(méi)食子酸為例闡述該類成分的代謝規(guī)律[16]。A0為ESI?模式下得到/169的離子峰（R＝3.2 min），文獻(xiàn)報(bào)道赤芍中的沒(méi)食子酸相對(duì)分子質(zhì)量為170[17]，推測(cè)169.014 3為其加氫準(zhǔn)分子離子峰，脫去羧基產(chǎn)生質(zhì)譜碎片/125.023 8 [M－H－COO]?，其保留時(shí)間及質(zhì)譜與沒(méi)食子酸對(duì)照品相一致，確定該化合物為沒(méi)食子酸。A1（R＝4.6 min）與沒(méi)食子酸相差14（CH2），存在與沒(méi)食子酸相同的碎片/125，并脫去1個(gè)氧產(chǎn)生/167.033 4的碎片，推測(cè)為甲基化的沒(méi)食子酸。A1、A2均為沒(méi)食子酸甲基化的產(chǎn)物，但沒(méi)食子酸有3個(gè)酚羥基，無(wú)法確定甲基結(jié)合的具體位置。A5（R＝8.8 min）比沒(méi)食子酸小48（3O），分子式為C7H6O2，質(zhì)譜碎片/119.045 3 [M－H－2H]?，推測(cè)為沒(méi)食子酸脫去3個(gè)O、A4脫去1個(gè)O生成的苯甲酸。A7準(zhǔn)分子離子峰/373.074 7 [M－H]?，脫去甲基產(chǎn)生質(zhì)譜碎片/359.060 2 [M－H－CH2]?，產(chǎn)生與A2相同的碎片/197.044 6 [M－H－C6H8O6]?，比沒(méi)食子酸大204（C6H8O6＋2CH2）、比A2大176（C6H8O6），根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式為C15H18O11，準(zhǔn)分子離子峰理論值為373.076 2，實(shí)測(cè)值為373.074 7，據(jù)此推測(cè)A7為沒(méi)食子酸2次甲基化后葡萄糖醛酸結(jié)合的產(chǎn)物。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸主要發(fā)生甲基化、脫氧、脫羧基、葡糖醛酸結(jié)合、硫酸結(jié)合等反應(yīng)，原型及代謝產(chǎn)物在尿液中均可檢測(cè)到，膽汁中以沒(méi)食子酸甲基化和沒(méi)食子酸硫酸結(jié)合產(chǎn)物為主，血漿及糞便樣品中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物種類較少。

圖1 大鼠空白及含藥血漿、膽汁、尿液、糞便樣品原型化合物及其代謝產(chǎn)物總提取離子流圖

表1 大鼠 igBHC后血漿、膽汁、尿液、糞便中原型成分及代謝產(chǎn)物

續(xù)表1

峰號(hào)tR/min離子模式分子式m/z誤差(×10?6)特征碎片(m/z)化合物來(lái)源 理論值實(shí)際值 F0-216.6[M＋H]+C20H20O4325.144 0325.143 8?0.62205.080 6, 149.022 7補(bǔ)骨脂甲素B, F F12.5[M＋H]+C20H20O5341.138 9341.137 6?3.81149.022 7F0環(huán)氧化B, U, F F214.5[M＋H]+C20H20O5341.138 9341.137 6?3.81269.096 6, 149.022 7F0氧化B, U, F F33.3[M＋H]+C20H20O8S421.095 7421.097 23.56165.089 7F0氧化, 硫酸結(jié)合B F413.6[M＋H]+C20H20O4325.144 0325.143 8?0.62269.169 5, 205.080 6 F0異構(gòu)體B F511.1[M＋H]+C26H28O10501.176 1501.176 30.40223.152 3F0葡糖醛酸結(jié)合B F614.7[M＋H]+C26H28O10501.176 1501.176 30.40149.133 6F4葡糖醛酸結(jié)合B F716.5[M＋H]+C20H18O4323.128 3323.127 5?2.48147.117 9F1重排, 脫水B, U F814.0[M＋H]+C20H18O4323.128 3323.129 33.09147.117 9, 121.101 2F1重排, 脫水B G08.5[M－H]?C17H18O9365.087 3365.087 30.00203.033 3, 175.025 1, 159.044 0補(bǔ)骨脂苷P, B, U, F G113.6[M＋H]+C11H6O3187.039 5187.038 8?3.74159.118 0, 131.084 9補(bǔ)骨脂素P, B, U, F G29.8[M＋H]+C11H6O4203.034 4203.035 55.42175.147 8, 147.044 8G1氧化B, U G35.7[M＋H]+C11H8O4205.050 1205.050 0?0.49187.037 8, 131.051 3G2還原B, U G45.9[M＋H]+C11H10O4207.065 7207.065 70.00189.053 9G3還原B, U G59.3[M＋H]+C11H8O5221.045 0221.043 4?7.24203.033 6, 165.091 1G2水合P, B, U G64.5[M＋H]+C11H10O5223.060 6223.059 7?4.03205.048 4, 179.047 5G5還原B, U G74.9[M＋H]+C11H8O6237.039 9237.039 8?0.42191.035 2, 165.091 2G5氧化U G812.2[M＋H]+C11H6O7S282.991 2282.992 54.59223.136 5, 203.035 2G2硫酸結(jié)合U G99.9[M＋H]+C17H14O10379.066 5379.066 2?0.79203.035 2, 175.147 8G2葡糖醛酸結(jié)合B G108.9[M－H]?C17H18O9365.087 3365.087 30.00203.033 3, 175.025 1異補(bǔ)骨脂苷P, B, U, F G1114.0[M＋H]+C11H6O3187.039 5187.038 8?3.74159.118 0, 131.084 9異補(bǔ)骨脂素P, B, U, F H015.0[M＋H]+C41H68O14785.468 7785.464 1?5.86491.383 9, 473.363 0, 455.354 3, 437.339 5黃芪甲苷F H117.0[M+Na]+C30H50O5513.355 6513.358 25.06455.349 7, 437.337 5, 419.330 0環(huán)黃芪醇F H213.6[M+Na]+C29H48O5499.339 9499.339 2?1.40481.023 6, 463.213 7H1去甲基F

P-血漿 B-膽汁 U-尿液 F-糞便

P-plasma B-bile U-urine F-feces

圖2 酚酸類成分體內(nèi)代謝途徑

3.3 單萜類成分代謝產(chǎn)物鑒定及代謝途徑分析

BHC中單萜類成分主要包括芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷等，本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到單萜類原型成分及代謝產(chǎn)物7個(gè)，見(jiàn)表1，具體代謝途徑見(jiàn)圖3。B0為ESI?模式下得到/479.155 9的離子峰（R＝8.8 min，文獻(xiàn)報(bào)道赤芍中的芍藥苷相對(duì)分子質(zhì)量為480[17]，推測(cè)/479.155 9為該化合物準(zhǔn)分子離子峰，C-O鍵斷裂產(chǎn)生碎片/357.117 6 [M－H－C7H6O2]?及121.029 2 [C7H5O2]?，其保留時(shí)間和質(zhì)譜行為與芍藥苷對(duì)照品相一致，確定該化合物為芍藥苷。B1為ESI?模式下得到/495.150 2的離子峰（R＝6.1 min），B1較芍藥苷多16，文獻(xiàn)報(bào)道[17]赤芍中存在的氧化芍藥苷相對(duì)分子質(zhì)量為496，推測(cè)/495.150 2為氧化芍藥苷的準(zhǔn)分子離子峰，存在質(zhì)譜碎片/333.090 3 [M－H－C6H10O5]?，其保留時(shí)間和質(zhì)譜與芍藥苷對(duì)照品一致，確定該化合物為氧化芍藥苷。B2為ESI?模式下檢測(cè)到/631.164 9的離子峰（R＝10.4 min），文獻(xiàn)報(bào)道[17]赤芍中存在的沒(méi)食子酰芍藥苷相對(duì)分子質(zhì)量為632，比芍藥苷多152（C7H4O4），推測(cè)/631.164 9為沒(méi)食子酰芍藥苷的準(zhǔn)分子離子峰，存在脫水產(chǎn)生的碎片/613.158 8 [M－H－H2O]?，并且存在與芍藥苷準(zhǔn)分子離子峰相同的碎片/479，其保留時(shí)間和質(zhì)譜與沒(méi)食子酰芍藥苷對(duì)照品相一致，確定該化合物為沒(méi)食子酰芍藥苷。B6為ESI?模式下得到/479.155 9的離子峰（R＝8.1 min），與芍藥苷保留時(shí)間相近，質(zhì)譜碎片/357.117 6 [M－H－C7H6O2]?和121.028 5 [C7H5O2]?與芍藥苷相同，保留時(shí)間和質(zhì)譜與芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品相一致，據(jù)此確定該化合物為芍藥苷的同分異構(gòu)體芍藥內(nèi)酯苷。芍藥苷在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物較少，主要發(fā)生氧化、甲基結(jié)合反應(yīng)，且大多經(jīng)糞便代謝，推測(cè)與其生物利用度較低有關(guān)。

3.4 黃酮類成分代謝產(chǎn)物鑒定及代謝途徑分析

黃芪和補(bǔ)骨脂中含有多種黃酮類成分，如毛蕊異黃酮、芒柄花素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素等。黃酮類成分極性普遍較小，因此在生物體內(nèi)多以硫酸、葡糖醛酸等結(jié)合產(chǎn)物的形式存在，增大極性以利于排出體外[18]。黃酮類成分易發(fā)生逆狄爾斯-阿德?tīng)枺╮etro diels-alder reaction，RDA）裂解。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到毛蕊異黃酮、()-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、新補(bǔ)骨脂異黃酮等成分，發(fā)生氧化、還原、脫羥基、脫水、環(huán)氧化、葡糖醛酸結(jié)合、硫酸結(jié)合反應(yīng)。各樣品中代謝產(chǎn)物不同，原型成分及代謝產(chǎn)物共檢測(cè)到35個(gè)，見(jiàn)表1，具體代謝途徑見(jiàn)圖4～6。

圖3 芍藥苷體內(nèi)代謝途徑

圖4 毛蕊異黃酮體內(nèi)代謝途徑

圖5 新補(bǔ)骨脂異黃酮和3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷體內(nèi)代謝途徑

本實(shí)驗(yàn)以毛蕊異黃酮和()-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮為例，分別闡釋異黃酮類與二氫黃酮類成分的代謝規(guī)律。C0為ESI+模式下得到/285的離子峰（R＝13.1 min），文獻(xiàn)報(bào)道黃芪中的毛蕊異黃酮相對(duì)分子質(zhì)量為284，推測(cè)/285.074 3為毛蕊異黃酮的準(zhǔn)分子離子峰，存在質(zhì)譜碎片/270.051 6 [M＋H－CH3]+、253.052 0 [M＋H－CH3OH]+、225.050 6 [M＋H－CH3OH－OH]+、149.060 9 [M＋H－C7H4O3]+、137.024 2 [M＋H－C9H8O2]+，保留時(shí)間和質(zhì)譜與毛蕊異黃酮對(duì)照品信息相一致，確定該化合物為毛蕊異黃酮。C1為ESI+模式下得到/269的離子峰（R＝15.3 min），文獻(xiàn)報(bào)道[18]黃芪中的芒柄花素相對(duì)分子質(zhì)量為268，推測(cè)/269.082 6為芒柄花素的準(zhǔn)分子離子峰，C1比毛蕊異黃酮小16，表明C1可能為毛蕊異黃酮脫氧的代謝產(chǎn)物，存在質(zhì)譜碎片251.169 8 [M＋H－H2O]+、225.112 6 [M＋H－CH4－CO]+、133.102 4 [M＋H－C7H4O3]+，保留時(shí)間和質(zhì)譜行為與芒柄花素對(duì)照品信息相一致，確定該化合物為毛蕊異黃酮脫氧生成的芒柄花素。C2為ESI+模式下得到/255的離子峰（R＝12.6 min），文獻(xiàn)報(bào)道[18]黃芪中的大豆苷元相對(duì)分子質(zhì)量為254，推測(cè)/255.067 7為其準(zhǔn)分子離子峰，C2比毛蕊異黃酮少30（OCH2），存在237.170 1 [M＋H－H2O]+、209.138 3 [M＋H－H2O－CO]+等質(zhì)譜碎片，根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式為C15H10O4，準(zhǔn)分子離子峰理論值為255.065 7，實(shí)測(cè)值為255.067 7，據(jù)此推測(cè)C2為毛蕊異黃酮脫去甲氧基生成的大豆苷元。D0為ESI+模式下得到/321的離子峰（R＝16.4 min），文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂中的新補(bǔ)骨脂異黃酮相對(duì)分子質(zhì)量為322，推測(cè)/321.112 9為新補(bǔ)骨脂異黃酮的準(zhǔn)分子離子峰，存在質(zhì)譜碎片/279.230 2 [M－H－C3H6]?、265.146 6 [M－H－C4H8]?，保留時(shí)間和質(zhì)譜與新補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)照品信息相一致，確定D0為新補(bǔ)骨脂異黃酮。

圖6 (S)-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮和補(bǔ)骨脂甲素體內(nèi)代謝途徑

F0-1（R＝16.1 min）和F0-2（R＝16.6 min）均存在325、205的離子峰，文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂中的()-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮和補(bǔ)骨脂甲素相對(duì)分子質(zhì)量均為324，推測(cè)/325.143 8 [M＋H]+為其準(zhǔn)分子離子峰，存在經(jīng)RDA裂解產(chǎn)生的碎片/205 [M＋ H－C8H8O]+，其保留時(shí)間及質(zhì)譜與()-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮和補(bǔ)骨脂甲素對(duì)照品相一致，確定F0-1和F0-2分別為()-異補(bǔ)骨脂二氫黃酮和補(bǔ)骨脂甲素，前者取代基在C-8位，后者取代基在C-6位，二者僅取代基位置不同，因此在體內(nèi)的代謝途徑較為相似，均可發(fā)生氧化、環(huán)氧化、硫酸結(jié)合等反應(yīng)。

3.5 香豆素類成分代謝產(chǎn)物鑒定及代謝途徑分析

補(bǔ)骨脂中含有的香豆素類成分補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂藥材的質(zhì)量控制成分[1]。該類原型成分及代謝產(chǎn)物共在大鼠體內(nèi)檢測(cè)到12個(gè)，見(jiàn)表1，具體代謝途徑見(jiàn)圖7。其中，G0為ESI?模式下得到/365的離子峰（R＝8.5 min），文獻(xiàn)報(bào)道[19]補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂苷的相對(duì)分子質(zhì)量為366，推測(cè)/365.087 3為其準(zhǔn)分子離子峰，存在碎片/203.033 3 [M－H－C6H10O5]?、175.025 1 [M－H－C6H10O5－CO]?、159.044 0 [M－H－C6H10O5－CO2]?，根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式為C17H18O9，準(zhǔn)分子離子峰理論值為365.087 3，實(shí)測(cè)值也為365.087 3，且保留時(shí)間和質(zhì)譜與補(bǔ)骨脂苷對(duì)照品一致，確定該化合物為補(bǔ)骨脂苷。苷類成分在體內(nèi)酶的作用下會(huì)脫去糖苷轉(zhuǎn)化為苷元。G1為ESI+模式下得到/187的離子峰（R＝13.6 min），文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素的相對(duì)分子質(zhì)量為186，推測(cè)/187.038 8為其準(zhǔn)分子離子峰，G1比補(bǔ)骨脂苷少180（C6H12O6），同樣存在/159的質(zhì)譜碎片，推測(cè)G1為補(bǔ)骨脂苷脫糖基后的苷元，其保留時(shí)間和質(zhì)譜與補(bǔ)骨脂素對(duì)照品一致，確定該化合物為補(bǔ)骨脂素。補(bǔ)骨脂中香豆素類成分補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷在體內(nèi)存在轉(zhuǎn)化現(xiàn)象[20-21]，但由于其含量較高，補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷及其苷元原型在血漿、膽汁、尿液及糞便樣品中均可檢測(cè)到。補(bǔ)骨脂苷在體內(nèi)主要發(fā)生脫糖反應(yīng)，其苷元補(bǔ)骨脂素可發(fā)生氧化、還原、硫酸結(jié)合、葡糖醛酸結(jié)合等反應(yīng)。

圖7 香豆素類成分體內(nèi)代謝途徑

3.6 皂苷類成分代謝產(chǎn)物鑒定及代謝途徑分析

黃芪皂苷類成分是黃芪藥材及飲片的質(zhì)量控制成分。本實(shí)驗(yàn)中H0為ESI+模式下得到/785的離子峰（R＝15.0 min），文獻(xiàn)報(bào)道黃芪中黃芪甲苷的相對(duì)分子質(zhì)量為784[22]，推測(cè)/785.464 1為其準(zhǔn)分子離子峰，存在碎片491.383 9 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4]+、473.363 0 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4－H2O]+、455.354 3 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4－2H2O]+、437.339 5 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4－3H2O]+、419.331 8 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4－4H2O]+，其保留時(shí)間及質(zhì)譜與黃芪甲苷對(duì)照品一致，據(jù)此確定H0為黃芪甲苷。H1為ESI＋模式下得到/513的離子峰（R＝17.0 min），文獻(xiàn)報(bào)道黃芪中環(huán)黃芪醇相對(duì)分子質(zhì)量為490，推測(cè)/513.358 2為其加鈉準(zhǔn)分子離子峰，存在碎片455.349 7 [M＋H－H2O]+、437.337 5 [M＋H－2H2O]+、419.330 0 [M＋H－3H2O]+，根據(jù)元素組成分析，該化合物分子式為C30H50O5，準(zhǔn)分子離子峰理論值為513.355 6，實(shí)測(cè)值為513.358 2，據(jù)此推測(cè)該化合物為環(huán)黃芪醇，見(jiàn)表1，代謝途徑見(jiàn)圖8。

4 討論

BHC體外化學(xué)物質(zhì)分析結(jié)果顯示，其主要含有黃酮類、單萜類、酚酸類、香豆素類、皂苷類等成分[8]。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，在正、負(fù)離子模式下，分別檢測(cè)連續(xù)3 d ig BHC后大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便樣品中原型成分及其代謝產(chǎn)物。結(jié)果顯示，BHC含有的上述5種類型成分在大鼠體內(nèi)多可檢測(cè)到其原型或代謝產(chǎn)物，如黃芪中的黃酮類及皂苷類成分、赤芍中的酚酸類及單萜類成分、補(bǔ)骨脂中的黃酮類及香豆素類成分。與體外物質(zhì)相比，體內(nèi)原型成分?jǐn)?shù)量相對(duì)較少，但代謝產(chǎn)物及途徑豐富。共鑒定原型成分及其代謝產(chǎn)物67個(gè)，其中來(lái)源于黃芪18個(gè)、赤芍17個(gè)、補(bǔ)骨脂32個(gè)，其代謝途徑包括氧化、還原、甲基化、葡糖醛酸結(jié)合、硫酸結(jié)合等I相及II相代謝反應(yīng)。

圖8 黃芪甲苷體內(nèi)代謝途徑

已有研究表明，酚酸類成分在機(jī)體內(nèi)主要以II相結(jié)合形式被代謝，亦有部分首先發(fā)生I相代謝，在I相轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行II相結(jié)合反應(yīng)[23]。有研究顯示ig沒(méi)食子酸后，沒(méi)食子酸代謝物3--甲基沒(méi)食子酸和4--甲基沒(méi)食子酸為血中主要成分，且原型和代謝物主要經(jīng)尿液和糞便排泄[24]。本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)食子酸主要代謝途徑為甲基化、硫酸結(jié)合等II相反應(yīng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

芍藥苷等單萜類成分是赤芍藥材中的主要活性成分，具有良好的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗抑郁、抑制肺纖維化作用[25-28]。研究表明，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠血漿和人血漿中蛋白結(jié)合率較高，提示血漿中游離藥物濃度較低[29]，且在體內(nèi)主要以I相代謝為主，生成單氧化、雙氧化、甲基化、去苯甲?；拇x產(chǎn)物，該報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

毛蕊異黃酮苷在黃芪藥材中含量較高[30]，前期藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其吸收入血的濃度較低，消除速率較快[12]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，黃芪藥材中毛蕊異黃酮苷和毛蕊異黃酮口服生物利用度均較低[31]，推測(cè)毛蕊異黃酮苷主要以其代謝產(chǎn)物形式在體內(nèi)發(fā)揮藥效。本實(shí)驗(yàn)各生物樣品中均未檢測(cè)到毛蕊異黃酮苷原型成分，但其代謝產(chǎn)物種類豐富，在尿液和糞便中檢測(cè)到其脫糖基化產(chǎn)物毛蕊異黃酮，進(jìn)而生成脫氧、去甲基化、葡糖醛酸結(jié)合、硫酸結(jié)合等代謝物，為該推論提供佐證。此外，各生物樣品中也未檢測(cè)到芒柄花苷，但其代謝產(chǎn)物芒柄花素廣泛存在于膽汁、尿液和糞便中，推測(cè)芒柄花苷消除速率較快，導(dǎo)致其主要以代謝產(chǎn)物形式存在于體內(nèi)。補(bǔ)骨脂藥材中黃酮類成分種類較多，本實(shí)驗(yàn)中其葡糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物大多經(jīng)膽汁排泄，推測(cè)代謝產(chǎn)物含量較高時(shí)可能會(huì)引起腸-肝循環(huán)，延長(zhǎng)原型化合物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，進(jìn)而提高其生物利用度。

補(bǔ)骨脂中香豆素類原型成分補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂素在大鼠血漿、膽汁、尿液及糞便樣品中均可檢測(cè)到。前期藥動(dòng)學(xué)研究[12]顯示補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷等成分在體內(nèi)半衰期較長(zhǎng)，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)連續(xù)ig 3 d，檢測(cè)樣品中代謝產(chǎn)物生成情況，可有效避免因半衰期較長(zhǎng)導(dǎo)致代謝不充分的情況。有文獻(xiàn)報(bào)道香豆素類成分的代謝主要在肝臟內(nèi)進(jìn)行，發(fā)生氧化、脫氫、脫甲基、內(nèi)酯環(huán)開(kāi)環(huán)等I相代謝反應(yīng)，隨后進(jìn)行II相代謝生成硫酸結(jié)合、葡糖醛酸結(jié)合等產(chǎn)物，代謝物大多經(jīng)膽汁及尿液排出[32]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

黃芪皂苷類成分是黃芪藥材多種藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[33-35]，但其生物利用度低的問(wèn)題一直廣受關(guān)注。前期對(duì)BHC入血成分的藥動(dòng)學(xué)研究中未檢測(cè)到黃芪皂苷類成分。本實(shí)驗(yàn)中僅檢測(cè)到黃芪甲苷、環(huán)黃芪醇及去甲基產(chǎn)物，且僅存在于糞便樣品中，表明皂苷類成分吸收入血情況較差，大多經(jīng)糞便排出體外，推測(cè)黃芪中皂苷類成分可能參與了機(jī)體腸道菌群的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)，也可能在腸道菌群的作用下發(fā)生生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

目前對(duì)于BHC藥動(dòng)學(xué)研究主要聚集于其原型成分[12,36-37]，這也是多數(shù)中藥成分體內(nèi)代謝研究的共性問(wèn)題。原型成分因溶解度低、首過(guò)效應(yīng)、酶降解或腸腔降解等因素代謝為其他成分，導(dǎo)致原型成分生物利用度低，多數(shù)以代謝物的形式在體內(nèi)發(fā)揮藥效。因此，只研究原型成分在體內(nèi)的代謝規(guī)律較為片面，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)中藥成分中代謝產(chǎn)物的鑒定分析，并進(jìn)一步針對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究，以實(shí)現(xiàn)全面評(píng)價(jià)各成分在體內(nèi)的代謝規(guī)律，為闡明中藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)提供支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Metabolite identification and metabolic pathway analysis of Bufei Huoxue Capsules in rats

REN Hui1, GUO Sheng1, ZHANG Yi-ying1, LI Quan2, WANG Heng-bin2, GENG Wan-li3,QIAN Da-wei1, DUAN Jin-ao1

1. National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, and Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Suzhou 215003, China 3. Guangdong Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Yunfu 527300, China

To study the prototype components and metabolites of Bufei Huoxue Capsules (補(bǔ)肺活血膠囊, BHC) in plasma, bile, urine and feces of rats, and summarize the metabolic rules of different types of compounds.After ig BHC, the plasma, bile, urine and feces samples of rats were collected and pretreated. The prototype components and metabolites were analyzed and identified in positive and negative ion modes by ultra-high performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) with mass loss filtration techniques.A total of 67 prototypes and metabolites were detected, such as gallic acid, paeoniflorin, calycosin, neobavaisoflavone, isobavachin and psoralenoside, etc. Among them, there were 10 phenolic acids, seven monoterpenes, 35 flavonoids, 12 coumarins and three saponins. The main metabolic pathways included oxidation, reduction, methylation, glucuronic acid binding, sulfuric acid binding and so on.This study preliminarily clarified the metabolites and transformation characteristics of BHC in rats, which laid a foundation for revealing its pharmacodynamic substance basis based onprocess, and provided a scientific basis for its safe clinical use.

Bufei Huoxue Capsules; metabolite identification; metabolic pathway analysis; UPLC-Q-TOF-MS; gallic acid; paeoniflorin; calycosin; neobavaisoflavone; isobavachin; psoralenoside; astragaloside IV

R284.1

A

0253 - 2670(2023)04 - 1051 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.005

2022-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81873189）；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（18KJA360006）；江蘇省“六大人才”高峰項(xiàng)目（YY-026）；江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYCX21_1728）

任 慧，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幏治雠c生物藥劑學(xué)。E-mail: rh_whale@163.com

郭 盛，副研究員，從事中藥資源化學(xué)與功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: guosheng@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]