沈 可 綜述，胡 晨 審校

(湖州師范學院醫(yī)學院，浙江 湖州 313000)

我國是結直腸癌(CRC)的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率位列癌癥前三。根據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計的數據，我國2020年有55.5萬例新增確診患者，約28.6萬人死于CRC，發(fā)病率和死亡率分別占全球病例的28.7%和30.6%，并在逐漸增加[1]。臨床上CRC患者的高死亡率主要歸咎于病癥的不易察覺性，發(fā)現時已是結直腸癌中晚期并存在遠處轉移，而肝臟是最常受累和最致命的部位。在初始診斷時，14%～18%的CRC患者已存在遠處轉移，大約70%的結直腸癌患者會發(fā)生肝臟轉移[2]，80%～90%的結直腸癌肝轉移灶無法得到根治性切除[3-5]。

早期發(fā)現癌癥和控制癌細胞的轉移是患者存活的關鍵，而結直腸癌肝轉移研究很大程度上依賴動物腫瘤模型。選擇能更好地模擬臨床結直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉移的動物模型為研究對象，不僅有利于發(fā)現和驗證腫瘤特異性生物標志物，闡明結直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉移的分子機制，為其診斷和治療提供特異性分子靶點，還能提高抗癌藥物臨床前研究的可信性，有助于臨床結直腸癌患者個性化精準治療的實施，提高患者的生存率。本文就常用的腫瘤動物、腫瘤異種移植模型及結直腸癌肝轉移異種移植模型的構建方法進行綜述，供研究者以探討。

1 常用的腫瘤模型動物

免疫缺陷小鼠被開發(fā)并廣泛應用于各種腫瘤研究，為人源腫瘤細胞或組織移植提供了一種強有力的載體。本文主要介紹常用的幾種免疫缺陷小鼠及其免疫缺陷特征(表1)。

表1 常用于制作為腫瘤宿主的免疫缺陷小鼠品系

裸鼠于1962年首次被報道，由于Foxn1基因突變而引起胸腺退化或缺失，但仍保留了B細胞和NK細胞，阻礙腫瘤生長和轉移。1983年，SCID小鼠出現，該小鼠因Prkdc基因缺失導致缺乏成熟的T、B細胞，不易排斥異種細胞或組織，但異種移植率并沒有顯著提高。1995年出現的NOD-SCID小鼠的適應性免疫存在缺陷，并且其巨噬細胞、樹突狀細胞及補體功能受損，對人類癌細胞移植率高，但其胸腺淋巴瘤發(fā)病率高，平均壽命短。NOG(NOD/Shi/SCID/IL2Rγ null)小鼠和NSG(NOD/SCID/IL2Rγ null)小鼠是在NOD-SCID小鼠上進行Rag2和IL-2Rγ敲除，造成機體內NK、T、B細胞等缺失，免疫功能嚴重障礙，同時自身淋巴瘤發(fā)生率低。目前，NOG、NSG小鼠具有最高的腫瘤形成率[6]，也是被認為最適合植入人源組織的動物[7]。

2 腫瘤異種移植模型

現常用的腫瘤異種移植動物模型主要有癌細胞系來源的異種移植模型(CDX和PDX)。由于CDX模型的細胞系經過傳代培養(yǎng)，不能模擬宿主對腫瘤存在的反應——免疫反應和血管生成[8]。此外，傳代后缺乏腫瘤內異質性，通常與原代腫瘤在生理和遺傳上相似度低[9]，臨床應用受限。而PDX模型保持了原代腫瘤異質性，組織病理和分子遺傳特征與臨床原代腫瘤高度相似[10]。因此，美國國家癌癥研究所建議使用PDX模型而不是傳統(tǒng)的體外細胞培養(yǎng)物進行藥物篩選[11-12]。

3 CRC肝轉移異種種植模型

3.1原位種植模型

3.1.1盲腸/直腸注射種植 原位移植模型需要將CRC細胞注射到腸壁中，或將其他動物或人類患者的腫瘤縫合到免疫缺陷小鼠的腸壁上，使腫瘤細胞在腸壁上生長向周圍血管侵襲，通過血行轉移定植于肝臟，從而構建肝轉移模型。該模型能復制腫瘤侵襲、血管擴散，模擬人早期CRC和晚期轉移的進展。在20世紀80年代初，SNIPES[13]報道了CRC細胞系的第一個原位移植，證明了壁內細胞注射引起局部浸潤性腫瘤生長的可行性。KOCHALL等[14]在NSG小鼠盲腸腸壁內注射HCT116細胞，35 d后發(fā)現約為10 mm的原發(fā)性腫瘤，并且存在肝轉移。HITE等[15]使用熒光素酶標記的HT-29細胞，建立了直腸種植模型和盲腸種植模型，通過生物發(fā)光成像監(jiān)測腫瘤生長，結果顯示直腸內注射的死亡率最低，為4.0%(1/25)，而盲腸內注射組為17.4%(4/23)，60%的直腸種植模型小鼠有肝轉移。所以直腸內注射種植模型是人CRC原發(fā)性腫瘤生長和自發(fā)轉移最安全、最可重復的原位小鼠模型。

雖然該模型能復制腫瘤的局部侵襲過程，伴有淋巴血管轉移，能較好地模擬臨床上CRC的發(fā)生、發(fā)展，但因腫瘤發(fā)生和肝轉移過程時間長，原位原發(fā)腫瘤自發(fā)轉移形成的效率和可預測性較差。并且手術過程中癌細胞與腹腔接觸，因此不能排除某些轉移是腹腔內細胞溢出的結果[16]。此外，該模型具有高度侵入性，耗時，并且需要外科手術，這些手術不僅會影響腫瘤微環(huán)境，而且還可能改變腫瘤的生長和傳播能力。

3.1.2肛門注射種植 肛門注射移植是近年來較新的一種轉移模型，通過在免疫缺陷小鼠肛門內注射腫瘤細胞或種植腫瘤塊，細胞/腫瘤塊種植到黏膜層，可以完整地觀察結直腸癌局部生長、浸潤、侵襲并發(fā)生經過靜脈血行轉移的過程。DONIGAN等[17]在Balb / c小鼠肛門開口處進行肛門擴張，將結腸癌CT26細胞或CT26(CT26-luc)細胞注射到直腸遠端后部中，腫瘤生長的總體成功率為65%，且注射后第50天顯示肝臟內存在轉移性結腸腺癌。但是該方法需要注意注射深度，勿將結腸癌細胞注射到盆腔。

該建模方法不僅能夠最大限度地模擬腫瘤肝轉移的發(fā)展過程，建立模型還屬于一種非手術原位小鼠模型，易于創(chuàng)建，比傳統(tǒng)的原位模型(即盲腸注射)侵入性更小，可以更準確地研究炎癥和手術干預的免疫反應。但由于注射部位為肛門，小鼠可于早期出現肛門梗阻，致使其臨床狀態(tài)較差，嚴重者甚至死亡。而且發(fā)生肝轉移的效率低，可預測性差。

3.2異位種植模型

3.2.1脾臟種植 脾臟種植被認為是CRC肝轉移模型最常用也是最佳的方法之一。該方法將腫瘤細胞種植到脾臟，隨著腫瘤細胞的生長，浸潤、侵襲脾靜脈，再通過肝門靜脈定植于肝臟從而構建肝轉移模型。該方法廣泛地應用于制備肝轉移模型，可分為保脾法、脾切除法及脾臟半切除法。

3.2.1.1保脾法 保脾法即在脾臟注射腫瘤細胞后保留脾臟，該方法在建立CRC肝轉移模型方面相對易于實施，且具有較高的肝轉移率。MAGISTRI等[18]使用成功表達熒光素酶的HCT 116-fLuc細胞，注入裸鼠脾內，21 d后檢測到與肝臟解剖定位一致的生物發(fā)光源，通過肝臟的離體生物發(fā)光分析進一步證實了肝轉移的存在。BAE等[19]將30只裸鼠分為2組，使用HCT116細胞建立CRC肝轉移的脾臟注射模型和手術原位移植模型，通過肉眼和顯微鏡檢查證實肝轉移，且脾臟注射模型在更短的觀察時間內具有更高的肝臟轉移率和克隆動力學，因此該模型是識別新靶點和開發(fā)CRC肝轉移藥物的良好動物模型。

但該模型只能模擬CRC細胞肝轉移最后階段，并不能研究整個轉移的過程及CRC早期發(fā)生、發(fā)展的機制。此外，保留脾臟會使得部分腫瘤細胞在脾臟內生長并發(fā)脾腫瘤，不僅降低小鼠的存活率，也對肝轉移的研究造成了一定的干擾。

3.2.1.2脾切除法 為了減少CRC細胞在脾臟內形成腫瘤原發(fā)灶，學者們又研究出了脾切除法，即在脾臟內注射腫瘤細胞后，再將脾臟切除。HACKL等[20]對3種CRC 異種移植模型(盲腸原位模型、脾內注射模型和脾切除模型)進行了對比，在6周齡的雌性SCID小鼠上，將表達熒光素酶的HCT116腫瘤細胞進行脾內注射，部分小鼠注射后1 min進行脾切除，建立脾切除模型，結果發(fā)現保脾組和脾切除組均觀察到廣泛的肝轉移，與盲腸原位模型相比，脾內注射或脾內注射后切除組存活率均較低。

該方法同樣具備肝臟高轉移性，但是脾臟作為免疫器官，是成熟T、B淋巴細胞的定居所，也是免疫應答的發(fā)生場所，因此切除脾臟會使小鼠的免疫力降低，增加小鼠的死亡率及建模難度。

3.2.1.3半脾模型 半脾模型(脾臟半切除法)是保脾法和脾切除法經過改良后的建模方法。該方法是將通過在脾臟中心放置2個鈦夾，將小鼠脾臟分成2個帶血管蒂的半脾(上極和下極)，注射CRC細胞后將該半脾切除。半脾模型既保證了高肝轉移率又保留了動物的部分免疫功能，減少了脾臟原生瘤對肝轉移的影響。喬大偉等[21]將結腸腺癌CT26細胞注入脾的下極并且按壓30 s以上，10 min后結扎該側血管和韌帶，夾閉、切斷并游離下極脾臟，通過電凝器止血，7 d后研究發(fā)現CRC細胞肝轉移率為100%。YANG等[22]在近端半脾緩慢注入 HT29 CRC細胞懸液，10 min 后夾閉、切斷近端半脾臟血管，切除并移除，遠端半脾擺放在皮下儲存囊內，肝轉移成瘤率為100%。

半脾切除法不僅模擬CRC的血行轉移，而且肝轉移率高。脾內注射或局部腫瘤生長引起的死亡率可通過注射后脾切除術或半切除術控制。但其動物實驗技術要求高，難度較大，需要熟練的手術技能來完成。

3.2.2門靜脈種植 肝門靜脈是由脾靜脈、腸系膜上靜脈匯合而成，再進入肝臟后分支匯入肝血竇。通過門靜脈直接注射，腫瘤細胞經過肝臟的截留后在其內部定植生長，模擬腫瘤細胞回流入門靜脈至肝臟血行播散而發(fā)生肝轉移的過程，較其他方法肝轉移率更高，因此該模型非常適合研究轉移形成方面及分析新型治療劑的療效。柴燕濤等[23]在裸鼠中經肝門靜脈注射5×105個高侵襲性的轉移性CRC SW480細胞系,經4～6周生長后進行正電子發(fā)射計算機斷層顯像(PET)/CT檢測,結果在裸鼠肝臟形成多發(fā)彌散的腫瘤病灶，建立基于肝門靜脈注射的新型進展期肝臟腫瘤動物模型,為進展期肝臟腫瘤相關藥物篩選奠定了堅實基礎。FOUBERT等[24]在裸鼠門內注射熒光素酶轉染的LS174T細胞，并通過生物發(fā)光法證實腫瘤肝轉移，從而比較預靶向免疫68Ga-PET成像(68Ga-pPET)與抗癌胚抗原(CEA)、抗組胺-琥珀酰-甘氨酸 (HSG) 重組人源化雙特異性單克隆抗體(TF2)和68Ga的性能。BOCUK等[25]通過C57BL小鼠的門靜脈注射CRC細胞CMT-93，且在4周內形成穩(wěn)定的肝轉移腫瘤，從而建立肝轉移模型來研究轉移時CRC細胞侵襲和擴增時發(fā)生的基因表達變化。

該模型更具有組織特異性，而且簡化了癌細胞由原發(fā)腫瘤侵入，向遠處器官轉移擴散的動態(tài)過程，可預測性好，建模速度快，腫瘤肝轉移率高。但注射過程中注射部位易出血及癌細胞容易外滲進入腹腔,造成小鼠死亡或腹腔種植。此外該模型只能研究腫瘤轉移形成的晚期階段。

3.2.3肝種植 肝種植法是在肝實質上做一個小切口，然后將CRC細胞或腫瘤組織植入，從而構建肝轉移模型。該方法被廣泛用于晚期CRC的肝轉移機制、抗腫瘤藥物研究。BRUNO等[26]將新鮮的腫瘤碎片植入小鼠肝實質，轉移性腫瘤在裸鼠體內成功生長，然后連續(xù)植入第二、三代小鼠體內。在第一次傳代期間腫瘤植入后，腫瘤生長時間縮短，但腫瘤特性沒有喪失。這項試點研究成功地建立了PDX模型臨床前平臺，以研究新的治療策略、疾病進展生物標志物和治療反應性。

該方法操作簡單,重復性好，腫瘤生長速度快,轉移率高。但術中易大量出血，以及腫瘤細胞易外滲。此外該模型不能客觀模擬CRC細胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉移的整個過程，多數都只在肝臟形成實體瘤，腫瘤轉移點較少。

3.2.4腹腔擴散種植 腹腔擴散法是將CRC細胞注入腹膜和腹膜腔中，導致腹膜上腫瘤結節(jié)的發(fā)展并通過腹膜腔播散性擴散到肝臟的過程。楊劍鋒等[27]在裸鼠的下腹部正中偏右注入CT26細胞懸液，待其死亡后開腹觀察原位腫瘤生長情況和肝臟轉移情況，存在大量血性腹水，肝轉移率較低。

BASTIAENEN等[28]開發(fā)了一個體內模型來評估15種CRC細胞系的腹膜擴散模式。在免疫缺陷小鼠腹膜內注射結直腸癌細胞，使用腹膜癌指數(PCI)評分系統(tǒng)評估腹膜腔7個解剖區(qū)域，在不同的細胞系中均觀察到肝臟腫瘤結節(jié)。

該模型易于執(zhí)行，建模速度快，但是腹腔內注射會導致廣泛的移植瘤和癌性腹水，肝轉移率低，且不能模擬單一器官的轉移，因此該模型常用于癌癥晚期腹腔廣泛轉移和CRC術后腹腔種植擴散的病理生理研究。

4 小結與展望

CRC的轉移途徑，一般包括直接浸潤、淋巴轉移、血行轉移，其中肝轉移發(fā)生的主要途徑為血行轉移。而CRC肝轉移動物模型對探究CRC肝轉移過程中的分子機制、腫瘤特異性靶點、藥物干預及腫瘤微環(huán)境的研究提供了一個絕佳的研究工具。通過掌握各種肝轉移模型特點有利于選用客觀可靠的實驗模型，更好地進行CRC肝轉移的基礎和臨床研究。制備CRC肝轉移小鼠模型各有利弊，脾內、肝種植或直接門靜脈注射結腸癌細胞來誘導肝轉移符合臨床腫瘤轉移過程，適合研究轉移形成的許多方面及分析新型治療劑的功效，但只能研究轉移形成的晚期階段且手術難度較大；對研究自發(fā)轉移形成的早期階段或腫瘤轉移的全過程，需要以原位方式生長轉移性腫瘤，但原位腫瘤自發(fā)轉移形成的效率和可預測性較差。

由于普通肝轉移模型難以實時觀察，且細胞系與臨床腫瘤相似度低。本課題組正構建以人CRC組織中的細胞為接種細胞源，經轉染熒光素酶基因和肝門靜脈注射等步驟，制備出CRC肝轉移模型(M-PDX)，該模型不僅較好地保留了CRC的異質性與臨床腫瘤組織相似度高，而且還具備易于大規(guī)模擴展、移植成功率極高和便于實時觀察等優(yōu)點，能較好地模擬CRC的血行轉移，必將有助于CRC肝轉移的基礎和應用性研究。

現有的CRC肝轉移模型多為PDX模型，但因實驗動物免疫系統(tǒng)與人類差異性較大而無法模擬人類腫瘤發(fā)生時的免疫反應，從而限制了抗腫瘤免疫療法的研發(fā)。為了重現人抗腫瘤免疫系統(tǒng)應答過程，目前常使用人源淋巴細胞(Hu-PBL)或CD34陽性人源造血干細胞(Hu-HSC)移植、人源化基因改造等方法對免疫缺陷小鼠進行免疫重建，在人源化免疫缺陷小鼠的基礎上構建PDX模型，該免疫、腫瘤雙人源化模型更有利于腫瘤在人類免疫系統(tǒng)環(huán)境生長機制的研究，有利于評估抗腫瘤藥物療效，促進抗腫瘤免疫療法等的研發(fā)。雖然尚缺乏利用免疫、腫瘤雙人源化模型構建肝轉移模型的研究，但作者認為其在腫瘤肝轉移研究方向有較高的潛力和意義。

總之，臨床前腫瘤模型是理論基礎和臨床轉化研究的基石，對癌癥研究具有無法衡量的價值，目前的動物模型具有巨大的潛力。選擇最佳的動物模型，將為研究生物學和評估結直腸癌的新型化療藥物開辟新的知識維度，新的成像和分子工具將進一步提高動物模型的功效、準確性和再現性。