杜安妮，林 牧，蔡 銳

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學校藥理教研室，貴州 遵義 563000；2.貴州航天醫(yī)院中心實驗室，貴州 遵義 563000；3.遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

腦卒中是臨床上較常見的腦血管疾病，多發(fā)病于45 歲以上的中老年人[1]，據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)有1 100萬例腦卒中患者，每年新發(fā)約200 萬例，死亡150萬例[2]。目前，我國老齡化問題日益嚴重，腦卒中發(fā)病率呈逐年攀升趨勢[3]。在腦卒中治療過程中，常需要長期服用血小板P2Y12受體拮抗劑——氯吡格雷，用于阻礙二磷酸腺苷(ADP)介導的血小板膜糖蛋白(GP) Ⅱb/Ⅲa 復合物活化及ADP與血小板P2Y12受體的結合，以達到抑制血小板聚集、改善血流動力學的目的[4]。

在使用氯吡格雷治療過程中，部分患者會表現(xiàn)出低反應、無反應或耐藥性的現(xiàn)象，稱為氯吡格雷抵抗。在研究氯吡格雷抵抗的各種機制中發(fā)現(xiàn)，細胞色素P450酶同工酶系統(tǒng)中的CYP2C19基因是氯吡格雷代謝過程中的關鍵酶[5]。而CYP2C19基因具有高度多態(tài)性，根據(jù)藥物代謝快慢可將CYP2C19基因型分為 4 種代謝表型：超快代謝型(UM)*17/*17、 *1/*17，快代謝型(EM)*1/*1，中間代謝型(IM)*1/*2、 *1/*3，慢代謝型(PM)*2/*2、*2/*3、 *3/*3[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19 PM患者不良心腦血管事件的發(fā)生率明顯高于EM患者[7]，PM患者體內氯吡格雷的活性轉化率降低，活性代謝產(chǎn)物減少，最終導致藥效減弱[7-8]。而UM*17基因在中國人群中突變頻率約為2%[9]，該基因型會導致酶活性過度表達，患者在服藥后可能會出現(xiàn)氯吡格雷抗血小板療效增強，進而增加其出血風險。查閱國內外相關文獻，普遍認為CYP2C19基因第681位堿基由G→A突變(CYP2C19*2)是影響氯吡格雷抗血小板聚集及療效的重要因素，個體表現(xiàn)為對氯吡格雷的反應性降低或無反應[10]。但僅依據(jù)CYP2C19基因型來指導臨床用藥并不一定能達到較為滿意的治療結果。

已有相關研究證實，血小板P2Y12受體的基因多態(tài)性會影響冠心病患者的發(fā)病率。目前，由ADP誘導的血小板聚集率檢測作為評價氯吡格雷療效的一項重要指標。本課題基于前期的研究結果[11-12]，通過對298例腦卒中患者檢測其CYP2C19、P2Y12基因分型，分析患者一般資料和高危因素(高血壓、糖尿病、高血脂等)，從中篩選出CYP2C19*2患者，觀察其P2Y12不同基因位點C34T、G52T、i-T774C在用藥前后血小板聚集率的差值比較，旨在研究CYP2C19、P2Y12基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗之間是否存在相關性，結合血小板聚集率檢測，為個體化用藥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取2019 年1 月至2020年12 月于貴州航天醫(yī)院住院、臨床診斷為缺血性腦卒中的患者 298 例，其中男210 例，女88 例；年齡40 ～ 85 歲，平均(65.0 ± 9.8)歲。入選患者均排除對氯吡格雷和阿司匹林過敏或不耐受，符合美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)≥3分，并在開展研究前簽署知情同意書。

1.2藥品、試劑及設備 硫酸氯吡格雷片(商品名：波立維，杭州賽諾菲制藥有限公司，每片75 mg)，拜阿司匹林腸溶片(德國拜耳有限公司，每片100 mg)；ADP(美國Sigma公司)，血液基因組 DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，人類 CYP2C19 基因檢測試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司)，C34T、G52T、i-T774C各基因型引物(上海生工生物工程有限公司合成)；7500 型 real time Quantitative-PCR儀(美國ABI 公司)，普利生 LBY-NJ4 血小板聚集率測試儀(北京普利生儀器有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1CYP2C19 基因型檢測 PCR 檢測法：抽取患者服藥前當天的空腹靜脈血 2 mL于乙二胺四乙酸( EDTA) 抗凝管中，4 ℃冰箱內保存； 采用血液基因組 DNA 提取試劑盒提取入選患者 DNA 樣本，取2 μLDNA溶液，分別在紫外分光光度計260、280 nm處測定DNA溶液光密度(OD)值，估算DNA的純度與濃度。所提取的DNAOD260/OD280比值均達到1.8～2.0，說明DNA濃度達到標準，-20 ℃保存并于24 h 內檢測；取 2 μL DNA 樣本加入分裝好的 CYP2C19 基因檢測 PCR 反應管中，按要求上機檢測( AB 7500) 。CYP2C19 基因型分為野生型*1/*1，突變雜合型*1/*2、*1/*3、*1/*17，突變純合型*2/*2、 *3/*3、*2/*3、*17/*17。所有患者在治療前先接受基因多態(tài)性檢測，后首劑給予氯吡格雷負荷劑量 300 mg每天1次，之后長期給予氯吡格雷 75 mg 每天1次[13]。本研究中所有分子生物學實驗均在貴州航天醫(yī)院中心實驗室使用相關科研設備完成。

1.3.2患者一般資料及高危因素相關性分析 對研究中患者的性別、年齡、血糖、血壓、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)等指標進行檢測，根據(jù)不同代謝表型患者進行分組，研究其相關性。

1.3.3P2Y12基因多態(tài)性檢測 C34T、G52T、i-T774C各基因型參考相關文獻[14]，使用Primer3軟件設計擴增引物和延伸引物并合成。外顯子C34T引物：上游5′-GAAATGCAAGCCGTCGAGAA-3′，下游5′-AGTGTAGAGCAGTGGGAAGA-3′。P2Y12外顯子G52T引物設計：上游5′-AAGATGAGAAACCTCAACTTTTAG-3′，下游5′-AACAGGACAGTGTAGAGCAGTG-3′。內含子i-T774C引物：上游5′-TTTGGGGAATTTAAGTGCTAC-3′，下游5′-CCACAATAGGCAGCTATAATG-3′。

1.3.4血小板聚集率檢測 抽取CYP2C19*2 基因型患者發(fā)病當天及服藥7 d后血液樣本，以5 μmmol/L ADP為誘導劑，采用光度比濁法(TPA)檢測血小板聚集率。氯吡格雷反應變異性參照ANGIOLILLOD等[15]提出的定義，以血小板聚集率與基線水平差值小于或等于10%作為氯吡格雷抵抗的標準。當血小板聚集率與基線水平差值(服用氯吡格雷前血小板聚集率-服藥后血小板聚集率)<10%認為氯吡格雷無反應，10%～<30%為低反應，≥30%視為正常反應[16]。

2 結 果

2.1CYP2C19基因型和代謝表型分布情況 入選的腦卒中患者中以CYP2C19*1/*1基因型發(fā)生率最高(39.9%)，CYP2C19*3/*3及CYP2C19*1/*17基因型發(fā)生率最低(均為0.3%)。具體結果見表1。

表1 CYP2C19 基因型和代謝表型分布情況[n( %),n=298]

2.2不同代謝表型患者基本資料及高危因素分析 4種代謝表型的患者在年齡、性別及合并高血壓、糖尿病、高血脂等高危因素間均未見明顯差異，見表2。

表2 不同代謝表型患者基本資料及高危因素分析[n(%)]

2.3298例患者P2Y12受體基因型分布情況

2.3.1C34T位點組 共成功分型出281例，其中CC型166例，CT型96例，TT型19例，基因型頻率分別為59.1%、34.2%、6.8%，其中C等位基因為76.2%，T等位基因為23.8%。

2.3.2G52T位點組 共成功分型出267例，其中GG型162例，GT型88例，TT型17例，基因型頻率分別為60.7%、33.0%及6.4%，其中G等位基因為77.2%，T等位基因為22.9%。

2.3.3i-T744C位點組 共成功分型出277例，其中TT型156例，TC型109例，CC型12例，基因型頻率分別為56.3%、39.4%及4.3%，其中T等位基因為76.0%，C等位基因為24.0%。采用χ2檢驗判斷各等位基因和基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，P>0.05表示病例來自群體符合遺傳平衡，表明樣本具有一定的群體代表性。

2.4155例CYP2C19*2(GA型+AA型)患者P2Y12基因多態(tài)性對氯吡格雷抵抗的影響分析

2.4.1C34T位點組 共成功分型出147例，其中CC型83例，CT型56例，TT型8例，基因型頻率分別為56.5%、38.1%、5.4%，其中C等位基因為75.5%，T等位基因為24.5%。測定服用氯吡格雷前后各基因間血小板聚集率差值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 P2Y12受體C34T位點各基因型分布與血小板聚集率差值比較

2.4.2G52T位點組 共成功分型出145例，其中GG型91例，GT型48例，TT型6例，基因型頻率分別為62.8%、33.1%、4.1%，其中G等位基因為79.3%，T等位基因為20.7%。測定服用氯吡格雷前后各基因間血小板聚集率差值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 P2Y12受體G52T位點各基因型分布與血小板聚集率差值比較

2.4.3i-T744C位點組 共成功分型出148例，其中TT型78例，TC型60例，CC型10例，基因型頻率分別為52.7%、40.5%、6.8%，其中T等位基因為73.0%，C等位基因為27.0%。測定服用氯吡格雷前后各基因間血小板聚集率差值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 P2Y12受體i-T744C位點各基因型分布與血小板聚集率差值比較

3 討 論

氯吡格雷作為臨床常用的抗血小板聚集藥物，其療效受CYP2C19基因多態(tài)性影響，超過60.6%的中國患者攜帶 CYP2C19*2、*3等位基因缺失(LOF)，而只有攜帶2個CYP2C19 LOF(PM)的患者預后情況不良[17-18]。一項關于東亞人群的研究中發(fā)現(xiàn)，CYP2C19*2、*3等位基因攜帶者均出現(xiàn)血小板較高聚集性，并可能降低氯吡格雷的治療效果[19]。既往相關研究顯示，攜帶CYP2C19*2或*3等位基因患者在氯吡格雷治療中不能有效預防腦卒中的復發(fā)[20]。本研究共298例腦卒中患者，以CYP2C19*1/*1基因型發(fā)生率最高，CYP2C19*3/*3及CYP2C19*1/*17基因型發(fā)生率最低。根據(jù)代謝表型分為：UM型4例、EM型119例、IM型133例、PM型42例，故遵義市腦卒中患者基因分布情況以EM型和IM型為主。

既往研究關于 CYP2C19 基因型與年齡、性別、合并糖尿病等基礎疾病之間的相關性存有爭議[21-22]，本研究中關于CYP2C19各基因型與患者年齡、性別、合并高血壓、糖尿病、高血脂等高危因素間均未見明顯差異，推斷可能與收集樣本量較小有關。在后續(xù)的研究中，可通過擴大樣本量，納入如民族[23]等因素綜合分析。

迄今為止，關于P2Y12基因多態(tài)性與腦卒中的研究仍較缺乏， 并且P2Y12受體基因多態(tài)性對氯吡格雷的療效影響及不良反應發(fā)生率仍存在較多爭議，所以，P2Y12受體與心腦血管等疾病發(fā)生、發(fā)展的相關性成為研究熱點[24-25]。本研究中選取CYP2C19*2患者分析P2Y12基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗之間相關性[26]，結果證實P2Y12受體中C34T、G52T基因位點可能與氯吡格雷抗血小板作用無明顯相關性,該結果與既往研究結果相符[27]。i-T744C位點與血小板活性有相關性，可能是導致氯吡格雷抵抗的原因之一，該結果與陳昕朦等[14]研究中缺血性腦卒中患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的結果相一致。但還需要進一步的前沿性試驗予以論證，也可作為今后研究的一個重點方向。相關研究表明，攜帶PM基因患者的血小板抑制率

綜上所述，在條件允許的情況下，臨床上對患者進行基因型的檢測顯得十分必要，以此來克服氯吡格雷在CYP2C19 LOF患者中藥效明顯降低的現(xiàn)象。對于腦卒中患者可以采用聯(lián)合用藥或使用其他新型抗血小板藥物(如替格瑞洛、普拉格雷、坎格瑞洛、西洛地唑等)，這對防止患者病情進一步加重、改善預后等方面具有指導意義。另一方面，可通過患者門診復診、再次入院及電話等方式開展隨訪，收集使用藥物的主要不良反應發(fā)生情況。這樣既可以及時調整更有效的用藥方案，也有利于降低心腦血管不良事件的發(fā)生率，對抗血小板治療管理及個體化用藥均具有非常重要的研究意義。