薛 影 ，毛蘊玉 ，徐建青 ,

1.復旦大學生物醫(yī)學研究院，上海 200030；2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201540；3.復旦大學附屬中山醫(yī)院生物治療中心，上海 200030

1 嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細胞與腫瘤治療

癌癥一直是嚴重威脅人類生命安全的一類重大疾病。盡管許多癌癥患者的生存率有所提升，一些國家肝癌、胰腺癌和肺癌患者的存活率增加了5%［1］，然而，癌癥患者的生存狀況仍然不容樂觀。2021年最新全球癌癥統(tǒng)計報告［2］顯示，2020年全球新增癌癥病例1 930萬例，新增癌癥死亡人數(shù)近1 000萬例。近年來，除化療、放療、外科手術等傳統(tǒng)的腫瘤治療手段外，光動力治療、光熱治療、免疫治療等新興的治療方式快速發(fā)展，逐漸顯示出其在癌癥治療領域中的獨特優(yōu)勢，將來或能為癌癥的臨床治療提供新的手段，為進一步降低癌癥死亡率、提高癌癥5年生存率帶來希望。

CAR-T細胞治療是一種有效的免疫治療方式［3］，其主要功能元件CAR包括胞外識別結構域、鉸鏈及跨膜域和胞內信號域［4］。在CAR-T細胞治療過程中，來源于患者的T細胞經(jīng)過基因編輯后能夠表達識別腫瘤表面抗原的CAR分子并被回輸?shù)交颊唧w內。回輸?shù)腃AR-T細胞通過其胞外識別域與腫瘤細胞表面抗原特異性結合，胞內信號域進一步向胞內傳導T細胞活化信號。激活后的CAR-T細胞通過釋放穿孔素、顆粒酶等殺傷性分子，高表達腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）配體，F(xiàn)as/FasL等途徑實現(xiàn)對腫瘤的殺傷［5］。實際上，在腫瘤患者機體內本身也存在一群對腫瘤組織有殺傷能力的T細胞，即細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）。然而，CTL對腫瘤細胞的識別依賴于靶細胞上的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子對靶細胞抗原的提呈；CTL的活化依賴于抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC）與CTL間共刺激分子的相互作用。在免疫系統(tǒng)與腫瘤的博弈過程中，腫瘤進化出了一系列的逃逸機制來避免機體的免疫監(jiān)視和免疫清除［6］，其中就包括下調MHC Ⅰ類分子的表達［7］。而腫瘤免疫抑制微環(huán)境嚴重限制APC的作用，共刺激信號被減弱，CTL細胞難以活化增殖，最終走向耗竭。因此，依靠癌癥患者自身產(chǎn)生的CTL往往不能有效地抑制癌癥生長，控制腫瘤發(fā)展。而CAR-T細胞對腫瘤的識別不需要借助MHC Ⅰ類分子的抗原提呈作用，CAR的結構中包含活化刺激信號，不依賴APC提供第二信號。即使在免疫抑制的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中，對于低表達MHC Ⅰ類分子的腫瘤細胞也能起到殺傷作用，從而達到治療癌癥的目的。此外，CAR可靶向除蛋白質抗原外的糖脂類抗原，從而擴大腫瘤抗原的靶向范圍［8］。

目前，CAR-T細胞治療已經(jīng)成功應用于血液系統(tǒng)腫瘤領域，這在很大程度上依賴于CD19靶點的獨特性質。CD19在B細胞惡性腫瘤及幼稚B細胞中高表達［9］，在其他細胞及成熟B細胞（如漿細胞）中不表達。接受治療的患者，盡管表現(xiàn)出B細胞丟失的癥狀，但是這一不良反應可以通過靜脈注射免疫球蛋白替代治療來控制［10］。

在實體瘤的治療中，人們也希望能尋找到僅在實體瘤細胞表面表達的腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen，TSA）作為CAR-T細胞治療的靶點。對于與病毒感染密切相關的實體瘤，可以將病毒抗原作為CAR-T細胞治療的靶點。例如，全世界50%～ 80%的肝癌由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起，因此HBV表面蛋白［11］被視為肝癌的理想靶點。同理，對于EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染引起的相關惡性腫瘤（如鼻咽癌），EBV潛膜蛋白1作為EBV陽性患者CAR-T細胞治療靶點的研究也已開展［12］。然而，對于大部分實體瘤來說，CAR-T細胞研究是以差異表達的腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAA）［13］作為靶點。由于TAA在正常組織器官中也表達，CAR-T細胞會對其造成無差別殺傷，從而引發(fā)嚴重的不良反應，如細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）、免疫效應細胞相關神經(jīng)毒性綜合征（immune effector cellassociated neurotoxicity syndrome，ICANS）和細胞減少癥等［14］。在實體瘤中以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、間皮素（mesothelin，MSLN）、EGFR變體Ⅲ、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、前列腺特異性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）等TAA作為靶點的研究已開展，但初步臨床試驗結果不盡如人意［15］。在一項正在進行的靶向cldn18.2的CAR-T細胞治療的Ⅰ期臨床試驗［16］中，其中期分析結果顯示，所有患者均出現(xiàn)3級或更高的血液學毒性，94.6%的患者發(fā)生1、2級CRS。此外，實體瘤所處的TME表現(xiàn)為免疫抑制性的特征，會在一定程度上限制CAR-T細胞的效力，造成CAR-T細胞對實體瘤的清除效果不佳［17］。

由此可見，僅將單一的TAA作為靶向腫瘤細胞的工具并不能實現(xiàn)對癌癥部位的精準定位，TME在腫瘤生成與發(fā)展中所起的作用對于CAR-T細胞治療的影響也不容忽視。為克服上述瓶頸，實現(xiàn)CAR-T細胞治療在實體瘤治療領域中的應用，研究者提出了許多方案。其中一項可行的方法是基于TME有別于正常組織內環(huán)境的獨特性質，構建既能靶向TAA又能靶向TME的CAR-T細胞。本文基于TME的缺氧特性，討論缺氧敏感型CAR-T細胞構建的常用元件和思路，梳理近年來構建缺氧敏感型CAR-T細胞的研究進展，有望加強CAR-T細胞治療的安全性，提高CAR-T細胞在實體瘤治療中的效果。

2 TME的形成和特征

腫瘤被認為是一種涉及癌細胞與TME之間持續(xù)、動態(tài)的相互作用的進化和生態(tài)過程［18］。TME支持侵襲性腫瘤行為，在腫瘤發(fā)展過程中，免疫細胞往往表現(xiàn)出表型和功能的不穩(wěn)定性，并分化為不同的細胞類型或狀態(tài)，從而促進或抑制腫瘤的生長和轉移［19］，提供免疫逃避［20］。TME由細胞和非細胞成分組成，細胞成分包括腫瘤細胞、成纖維細胞、間充質基質細胞（mesenchymal stromal cells，MSC）、髓系來源的抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）、免疫細胞、炎癥細胞等［21］；非細胞成分包括細胞外基質及細胞分泌的可溶性分子（如細胞因子等）［22］?；蛲蛔儗е履[瘤細胞表現(xiàn)為不受控的生長、對凋亡的抵抗、代謝向有氧糖酵解的轉變等特征，使得TME呈現(xiàn)出缺氧、氧化應激和酸中毒等有別于正常組織微環(huán)境的特點。TME對于抗腫瘤治療的效果及患者預后會產(chǎn)生關鍵影響，例如，TME會對T細胞的浸潤產(chǎn)生明顯的屏障作用，這也被認為是過繼T細胞治療失敗的一個重要原因［23］。近年來，靶向TME的治療策略受到了廣泛關注，已有研究［24］證實，TME可能是調節(jié)宿主免疫系統(tǒng)以支持免疫靶向治療的可行策略。

在腫瘤最初形成時，細胞主要依靠滲透獲得營養(yǎng)物質。隨著腫瘤細胞迅速增殖，對氧氣的需求量越來越高，腫瘤生長往往伴隨著血管新生［25］。然而，隨著腫瘤的進一步異常增生，腫瘤細胞的快速擴張使得腫瘤對于氧和營養(yǎng)物質的需求無法由周圍的血液供應維持，再加上腫瘤血管系統(tǒng)發(fā)育不完全，導致TME呈現(xiàn)出氧含量低的特點［26］。在實體瘤部位中，氧含量僅占1%甚至更低［27］。TME乏氧的特點及腫瘤細胞快速生長的需求又會迫使腫瘤細胞的代謝方式由氧化磷酸化向糖酵解發(fā)生轉變，糖酵解產(chǎn)物乳酸在細胞質中生成并被運輸?shù)郊毎?，導致細胞外酸化?8-29］。乏氧、弱酸性不僅會導致常規(guī)治療耐藥性，缺氧驅動的適應機制還為腫瘤細胞提供了生長優(yōu)勢，允許腫瘤細胞在缺氧的TME中繼續(xù)生存甚至增殖。與此相對，TME為免疫細胞創(chuàng)造不適宜的環(huán)境并破壞關鍵調控通路，干擾效應細胞殺傷腫瘤的功能，阻礙免疫細胞向腫瘤組織的浸潤，削弱機體自發(fā)的抗腫瘤免疫，誘導免疫耐受和免疫逃逸［30］。由此可見，乏氧是誘導新血管生成、弱酸性等TME與正常組織內環(huán)境顯著區(qū)別的關鍵因素，它與腫瘤組織的放化療耐藥性、腫瘤轉移性等患者不良預后特征息息相關［31-32］。

3 缺氧誘導元件的工作機制

缺氧會對細胞正常的生理活動產(chǎn)生不利影響，為適應缺氧環(huán)境，腫瘤細胞往往表現(xiàn)出缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIF）信號轉導通路的激活［33］。HIF是一種在缺氧TME中激活并穩(wěn)定表達的轉錄因子，能在腫瘤部位上調促癌基因的表達［31］，如血管內皮生長因子、血小板衍生生長因子和血管生成素-1等，從而觸發(fā)一系列的細胞反應（如糖酵解、血管生成、凋亡分化）以抵消缺氧對細胞造成的負面影響［33］。鑒于HIF在腫瘤組織發(fā)生、發(fā)展和侵襲中發(fā)揮的關鍵作用，許多研究團隊也在嘗試將以HIF為靶點的抑制劑用于腫瘤的治療［31，34］。

HIF是一種異源二聚體復合物，包含一個組成性表達的核HIF-β亞基和一個胞質氧依賴的HIF-α亞基［26，35-36］。哺乳動物中共有3種HIF-α亞基：HIF-1α、HIF-2α及HIF-3α，分別在不同的組織器官中表達。其中，HIF-1α和HIF-2α是研究最為廣泛的HIF-α亞基，HIF-3α的功能還沒有被很好地確定［37］。HIF的穩(wěn)定與HIF-脯氨酸羥化酶結構域蛋白密切相關［38］。在常氧條件下，PHD-2使HIF-α亞基氧依賴降解結構域（oxygendependent degradation，ODD）的脯氨酸殘基發(fā)生羥基化，隨后，E3泛素連接酶pVHL蛋白附著在羥化的ODD脯氨酸殘基上，并作為E3泛素連接酶復合物的底物識別成分使HIF-α亞基泛素化。最終，泛素化的HIF-α亞基被蛋白酶體降解?？傊?，在細胞中的氧含量正常時，HIF-α會發(fā)生迅速降解，半衰期只有5 min，基本不會被檢測到［39］。在細胞乏氧條件下，PHD的活性受到抑制，HIF-α亞基不會發(fā)生羥基化、泛素化，從而避免了被蛋白酶體降解。未被降解的HIF-α亞基在細胞質中不斷積累并轉移到細胞核內，與細胞核內的HIF-β亞基形成異源二聚體復合物。異源二聚體HIF能夠與靶基因上的缺氧反應元件（hypoxia-responsive elements，HRE）區(qū)域相結合，介導下游基因的轉錄調控［33，40］（圖1）。

圖1 HIF信號轉導通路Fig.1 HIF signaling transduction pathway

4 缺氧敏感型CAR-T細胞的構建及研究現(xiàn)狀

基于上述缺氧誘導元件能在缺氧條件下誘導基因轉錄表達的特性，研究者們提出了缺氧敏感型CAR-T細胞的概念，嘗試克服傳統(tǒng)CAR-T細胞治療脫靶效應的缺陷，擴大CAR-T細胞治療的應用范圍。

其中一種構建思路是利用ODD在氧含量正常時易被降解的特性，在CAR編碼基因上串聯(lián)ODD編碼序列，使得在正常組織器官中編碼CAR的基因即使轉錄表達出來，也很容易被蛋白酶體降解，從而避免CAR-T細胞對正常體細胞的殺傷。Juillerat等［41］設計構建了3種靶向CD19抗原的HIF-CAR，在這3種類型的HIF-CAR中，CAR-α鏈的C端分別連接了HIF-α鏈380～ 603位的氨基酸（ODD大結構域，記為HIF-CAR1），344～ 417位的氨基酸（ODD N末端結構域，記為HIFCAR2）及530～ 652位的氨基酸（ODD C末端結構域，記為HIF-CAR3），結果顯示，HIF-CAR1與HIF-CAR2細胞在低氧條件下可以測得CAR在細胞表面上的表達增加。Liao等［42］比較了4種ODD的缺氧敏感性，對比發(fā)現(xiàn)全長的HIF-1α ODD具有最低的基線表達和最強的缺氧誘導表達，缺氧敏感性最為嚴格，因此，研究者選擇全長的HIF-1α ODD作為缺氧敏感元件，在缺氧條件下，缺氧敏感性CAR-T細胞對于腫瘤細胞的殺傷能力相較于在常氧條件下顯著增強，作者還評估了缺氧敏感性CAR-T細胞對實體瘤的殺傷效果，結果表明，相較于常規(guī)CAR-T細胞，缺氧敏感性CAR-T細胞的殺傷效果有所減弱，但仍可有效地控制腫瘤生長。

另一種構建思路是在常規(guī)的僅攜帶CAR編碼基因載體的基礎上，串聯(lián)HRE啟動子序列。只有在缺氧條件下，HIF二聚體入核與HRE結合后才能介導下游的編碼CAR基因的表達。除此之外，通過改變串聯(lián)HRE啟動子的重復數(shù)目，能夠調節(jié)缺氧條件的嚴格程度［43］。串聯(lián)的HRE重復數(shù)越多，缺氧條件下目的基因的轉錄水平越高。ErbB受體家族是廣受關注的TAA，在許多種類的癌癥中呈高表達。然而，為轉移性結腸癌患者靜脈注射靶向ErbB2受體的CAR-T細胞會引發(fā)嚴重的CRS，產(chǎn)生致命的不良反應。Kosti等［44］通過在CAR上添加ODD，同時在載體的長末端重復增強子區(qū)域添加9個連續(xù)的HRE，構建了一個靶向ErbB2受體的嚴格缺氧調節(jié)的CAR表達系統(tǒng)。研究結果顯示，在HN3或SKOV3移植瘤小鼠模型中，CAR細胞在腫瘤中的表達均顯著高于血液、肺、肝臟等其他組織。此外，靜脈注射缺氧敏感性CAR-T細胞的小鼠體內白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等細胞因子的表達水平?jīng)]有顯著提高，沒有在小鼠身上觀察到CRS的癥狀，說明缺氧敏感性CAR-T很好地避免了非缺氧敏感型CAR-T細胞脫靶效應引起的不良反應。

盡管已有許多構建缺氧誘導型CAR-T細胞的實驗得到了開展，目前還沒有缺氧敏感型CAR-T細胞治療藥物被批準上市并用于腫瘤治療。通過添加缺氧誘導元件可以在一定程度上控制CAR在常氧與乏氧條件下的區(qū)別表達，但其控制的嚴格程度還有待進一步提升。理想情況下，缺氧誘導型CAR-T細胞能很好地區(qū)分腫瘤與正常組織，實現(xiàn)在不同部位CAR的“全或無”表達。然而，在實際應用中，常氧組織中仍可以觀察到殘留的CAR-T細胞。此外，人體內還存在一些健康的、低氧的組織如骨髓，CAR-T細胞可能對這些組織造成損傷［45］。此外，缺氧誘導元件的添加使得CAR即使在缺氧條件下的表達也遠達不到常規(guī)CAR-T細胞中CAR的表達水平。這也在一定程度上限制了CAR-T細胞的療效，或需通過提高回輸次數(shù)或數(shù)量來補償，給治療增加新的成本和負擔。最后，盡管缺氧誘導型CAR-T能夠控制CAR在不同空間中的表達，但是在進入人體后，難以對其表達時相加以監(jiān)測和控制。理想情況下，CAR-T細胞在不同氧含量環(huán)境中切換時，其表面CAR的表達水平也應隨著氧含量的變化得到迅速響應，從而在達到最佳的療效的同時避免由于CAR降解延遲引起的非靶向毒性。ODD能實現(xiàn)在蛋白水平上的迅速調控，如前文中提到的Juillerat等［41］的研究，在去除缺氧誘導因素后大約2 h內，CAR的表面表達下降了80%。此外，在轉錄水平上進行調控的HRE響應速度較慢，如前文中提到的結合了ODD與HRE的CAR表達系統(tǒng)，在缺氧培養(yǎng)18 h后，CAR的表達才達到了峰值。且對于在缺氧環(huán)境中順利表達的CAR-T細胞，由于缺乏對其在蛋白質水平上的調控，也存在著潛在的不良反應風險。如何實現(xiàn)CAR表達的嚴格控制從而增加其在不同氧含量環(huán)境中表達水平的差異性，如何在保證CAR-T細胞有效性的同時進一步增強安全性，以及如何平衡CAR表達的時相控制和空間控制，這是構建缺氧敏感型CAR-T細胞的研究中需要思考的問題。

5 總結與展望

作為腫瘤免疫治療領域備受矚目的治療手段，CAR-T細胞治療已經(jīng)成功地應用于許多類型的血液瘤中。盡管目前該項技術還存在一些瓶頸，阻礙其推廣到實體瘤的治療中，但研究者們也在積極地尋找針對上述局限的解決思路。由于CAR-T細胞治療的不良反應絕大多數(shù)由脫靶效應引起，如何使CAR具備區(qū)分正常組織和腫瘤組織的能力成為關鍵。

缺氧與腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展密切相關，自從HIF信號轉導通路發(fā)現(xiàn)幾十年來，該通路相關蛋白被廣泛地用于癌癥治療的研究中。例如，有研究［46］表明，pVHL的缺失能夠促進CAR-T細胞在TME部位的駐留。本綜述重點介紹了利用TME缺氧的特點，借助HRE、ODD等缺氧敏感元件構建缺氧敏感型CAR-T的思路和優(yōu)化方向。除本文中介紹的方法外，還有許多用于增加CAR-T細胞區(qū)分度的手段。例如，利用動力學原理制備與高表達TAA的腫瘤細胞親和力更強而與低表達TAA的正常組織細胞親和力低的CAR-T細胞，利用二價抗體提高CAR-T細胞對腫瘤組織的靶向性等。無論利用何種手段，只要設計得當，都能實現(xiàn)區(qū)分腫瘤組織與正常組織、克服脫靶效應的目標。盡管目前還沒有針對實體瘤的CAR-T細胞治療藥物被批準上市用于臨床治療，但相信CAR-T細胞治療必將逐漸發(fā)展成熟，并逐步推廣到越來越多類型的腫瘤臨床治療中。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。