賴婭娜，曾文滔，2*

1南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動物中心，2南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166

小鼠作為一種重要的實(shí)驗(yàn)動物，廣泛運(yùn)用于探索生命奧秘、研究疾病機(jī)制及防治等生命科學(xué)各領(lǐng)域。以超數(shù)排卵技術(shù)為基礎(chǔ)的輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）對獲得足夠數(shù)量受精卵和可用胚胎，充分利用有限的動物資源，縮短世代間隔，提高胚胎工程技術(shù)在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用效率具有重要意義［1-3］。國內(nèi)外針對小鼠超數(shù)排卵研究較多，經(jīng)典的小鼠超排方案是注射孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）促卵泡發(fā)育48 h后注射人絨毛膜促進(jìn)腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG）促排卵［4-5］。

幼鼠因超排效果穩(wěn)定、卵子數(shù)量多，被廣泛用于早期胚胎的研究以及基因工程編輯模型鼠的建立［6-7］。相對而言，成年鼠超排受內(nèi)源性激素的影響較大，相關(guān)研究資料報道較少，但對于卵細(xì)胞質(zhì)量要求比較高的科學(xué)研究和在拯救瀕危品系時操作的對象為成年小鼠［8］。成年雌鼠交配后10～12 h 陰道口有白色的陰道栓，交配后小鼠的黃體會變?yōu)楣δ苄渣S體，小鼠的發(fā)情周期停止。有研究報道，雌鼠在發(fā)情周期的不同階段注射PMSG均可以誘導(dǎo)超數(shù)排卵［9］，長期從事生物凈化的過程中發(fā)現(xiàn)妊娠期小鼠也可通過超排獲得受精卵。ICR 小鼠是用Swiss小鼠群以多產(chǎn)為目標(biāo)進(jìn)行選育的小鼠品系，經(jīng)美國癌癥研究所分送各國飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。本研究以ICR野生型雌鼠為實(shí)驗(yàn)對象，在其自然受孕當(dāng)日再進(jìn)行超排操作，探討同時獲得卵細(xì)胞和多細(xì)胞胚胎（一次自然受孕的受精卵在超排期間繼續(xù)發(fā)育的胚胎）的可行性，然后對二次募集成熟卵細(xì)胞的超排方案進(jìn)行優(yōu)化，深挖成年小鼠超排效果和胚胎發(fā)育的潛能，為充分利用小鼠資源從超排卵中獲得最大收益提供了高效、可行的實(shí)驗(yàn)方案。

1 材料和方法

1.1 材料

ICR 雌鼠為10～15周，ICR 雄鼠為10～20 周有生育能力且停配至少1周，均來源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，按照SFP 級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動物中心屏障系統(tǒng)，符合南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理管理規(guī)范（倫理號：IACUC-2205051）。自由飲水，室溫（22±1）℃，光照12 h/d，（7：00～19：00）。

超凈工作臺（蘇州蘇凈公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國），體視顯微鏡（SZX10-3151，Olympus 公司，日本）、35 mm及60 mm培養(yǎng)皿（Corning公司，美國）；注射用PMSG、注射用HCG（北京啟維益成科技有限公司），石蠟油（貨號M8410，Sigma公司，美國），M2培養(yǎng)液（貨號M7167，Sigma公司，美國），透明質(zhì)酸酶（貨號H4272，Sigma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組和激素注射劑量

10～15周齡的C57BL/6J雌鼠種群內(nèi)隨機(jī)挑選，按照采取的超排方案分為4個試驗(yàn)組。自然排卵對照組、隨機(jī)超排對照組、常規(guī)雙排卵實(shí)驗(yàn)組、優(yōu)化雙排卵實(shí)驗(yàn)組。所有超排組小鼠按照每只7.5 U PMSG促卵泡發(fā)育，7.5 U HCG促排卵。實(shí)驗(yàn)組小鼠入組條件：適齡發(fā)情鼠與有交配經(jīng)驗(yàn)并停配1周的雄鼠合籠，次日8：00檢陰道栓，見交配栓的小鼠入選實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 小鼠超排方案

自然排卵對照組：自然受孕，不進(jìn)行激素超排。在16：00挑選發(fā)情鼠，16：30與有交配經(jīng)驗(yàn)并停配1周的雄鼠1∶1合籠，次日檢栓。

隨機(jī)超排對照組：第1天16：00 注射PMSG，第3天16：00（間隔48 h）注射HCG促排卵，16：30與有交配經(jīng)驗(yàn)并停配1周的雄鼠1∶1合籠，次日檢栓。

常規(guī)雙排卵實(shí)驗(yàn)組：見栓當(dāng)天（第1天）16：00注射PMSG，第3天16：00（間隔48 h）注射HCG，第4天9：00取胚胎（圖1A）。

優(yōu)化雙排卵實(shí)驗(yàn)組：見栓當(dāng)天（第1 天）9：00 注射PMSG，第2天17：00（間隔32 h）注射HCG后再次與停配1周的雄鼠1∶1合籠，第3天8：00檢栓，見栓鼠和未見栓鼠分開取卵（圖1C）。

1.2.3 卵母細(xì)胞和早期胚胎的收集

用頸椎脫臼法處死小鼠，剖宮依次取輸卵管和子宮，將輸卵管置于覆蓋石蠟油的M2培養(yǎng)液（提前置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱預(yù)溫）內(nèi)，用眼科鑷撕破壺腹部釋放卵細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞，洗滌3次后統(tǒng)計所有多細(xì)胞的胚胎以及受精、未受精、死亡和異常卵母細(xì)胞的數(shù)量。采用1 mL注射器抽取37 ℃預(yù)熱的M2 沖洗子宮，檢查輸卵管內(nèi)是否存留正常發(fā)育的胚胎，記錄囊胚數(shù)、退化卵數(shù)和取到囊胚的小鼠只數(shù)。受精率=見栓鼠受精卵數(shù)/見栓鼠排卵總數(shù)×100%。

1.2.4 外源PMSG對自然受孕一次胚胎發(fā)育影響的觀察

自然交配見栓鼠于9：00 注射PMSG，分別在8、24、32、48 h 后對輸卵管胚胎數(shù)量進(jìn)行觀察，記錄各時間點(diǎn)自然排卵胚胎數(shù)量的變化（圖1B），并于見栓24、48、80 h分別對2細(xì)胞、8細(xì)胞及囊胚期不同階段胚胎發(fā)育進(jìn)行觀察記錄。

圖1 雙排卵實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 1 Flow chart of double ovulation experiment

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，各實(shí)驗(yàn)組間排卵計數(shù)資料均采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組排卵數(shù)量的比較

自然排卵對照組、隨機(jī)超排對照組、常規(guī)雙排卵實(shí)驗(yàn)組共入組22只小鼠，各組小鼠排卵的情況詳見表1。自然排卵對照組和隨機(jī)超排對照組的平均排卵數(shù)分別是15.1 和16.6枚，兩者沒有統(tǒng)計學(xué)差異。常規(guī)雙排卵實(shí)驗(yàn)組8只小鼠共獲得二次排卵205枚，平均25.6枚/只，相對其他兩個對照組16.6枚/只和15.1 枚/只差異顯著(P＜0.01）。雙排卵實(shí)驗(yàn)組的8只鼠中有4只取出自然發(fā)育的囊胚期胚胎16枚，所有胚胎均在壺腹部，子宮及近子宮輸卵管無任何形態(tài)卵子或胚胎。

表1 超排方案對小鼠排卵效果的影響Table 1 Effect of superovulation scheme on ovulation in mice （n）

2.2 外源PMSG對自然受孕一次胚胎發(fā)育的影響

自然交配見栓的小鼠在注射PMSG后于各時間節(jié)點(diǎn)觀察自然排卵胚胎的發(fā)育情況。自然排卵胚胎在小鼠注射PMSG 后的8、24、34 h 依然存在于壺腹部中。在48 h隨著壺腹部消失，僅部分小鼠在原壺腹部位置可以檢測到少量胚胎，而對輸卵管和子宮沖洗未發(fā)現(xiàn)胚胎存在（圖2）。

圖2 注射PMSG后胚胎發(fā)育情況Figure 2 Embryo development after PMSG injection

對照組（沒有進(jìn)行外源PMSG 注射）與PMSG 處理組在2 細(xì)胞至8 細(xì)胞期發(fā)育時期一致，囊胚期發(fā)育形態(tài)差距較大。在80 h對照組處于3級擴(kuò)張期晚期，部分囊胚達(dá)到4 級孵化期，囊胚形態(tài)扁長，實(shí)驗(yàn)組處于3級擴(kuò)張期，形態(tài)圓潤立體，透明帶外無孵化點(diǎn)（圖3）。

圖3 不同時期對照組與實(shí)驗(yàn)組胚胎發(fā)育比較（×25）Figure 3 Comparison of embryonic development between control group and experimental group at different stages（×25）

2.3 雙排卵實(shí)驗(yàn)方案的優(yōu)化

優(yōu)化雙排卵實(shí)驗(yàn)組18 只鼠入組，其中16 只鼠取到187 枚由一次排卵發(fā)育而來的8 細(xì)胞胚胎，平均每只鼠收集到一次排卵胚胎11.7 枚。所有優(yōu)化雙排實(shí)驗(yàn)組小鼠均成功誘導(dǎo)二次排卵，共獲得MⅡ期卵子及受精卵838 枚、退化胚85枚，兩次排卵總共獲得1 110 枚卵子和多細(xì)胞胚胎，平均每只61.7枚，顯著高于常規(guī)雙排卵實(shí)驗(yàn)組（31.8 枚），P＜0.01（表2）。異常胚為萎縮、碎裂和溶解3 種狀態(tài)，具體歸為未受精、死亡或異常卵母細(xì)胞未做分類和評價。優(yōu)化雙排卵實(shí)驗(yàn)組總共檢出異常胚85枚（無法區(qū)分畸形碎裂胚實(shí)際來源于第一次排卵還是第二次排卵，故僅統(tǒng)計異常胚總數(shù)），平均每只小鼠檢測到4.7枚，與實(shí)驗(yàn)組無統(tǒng)計學(xué)差異。優(yōu)化雙排卵實(shí)驗(yàn)組在注射HCG后與雄鼠二次合籠，其中15只（15/18）二次見栓，清洗輸卵管共收集735枚卵母細(xì)胞和受精卵母細(xì)胞，其中受精卵509枚，受精率為69.2%。值得一提的是，有3 只鼠二次排卵數(shù)超過80枚，排卵最多的1只雌鼠取胚數(shù)更是高達(dá)109 枚（含二次卵母細(xì)胞93 枚、一次胚胎16枚）且壺腹部異常膨大（圖4）。

圖4 正常超排和雙排卵第二次排卵的壺腹部對比Figure 4 Comparison of ampulla between conventional superovulation and second double ovulation

表2 雙排卵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案與常規(guī)雙排卵實(shí)驗(yàn)方案排卵數(shù)據(jù)對比Table 2 Data comparison between the optimized double ovulation experimental scheme and the conventional double ovulation experimental scheme （n）

3 討論

超排卵技術(shù)有助于基因工程小鼠的產(chǎn)生及減少動物的使用量，在基因工程小鼠構(gòu)建、生物凈化、大量擴(kuò)繁、瀕危動物品系保存等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。小鼠誘導(dǎo)超排技術(shù)流程相對成熟，成年小鼠自然排卵僅8～15枚，而常規(guī)超排卵技術(shù)也僅能得到15～40 枚卵子，因此提高雌鼠超排效果和胚胎發(fā)育潛能一直是輔助生殖技術(shù)所追求的目標(biāo)。盡管幼年小鼠供體受激素刺激會產(chǎn)生更多的卵母細(xì)胞，但對于卵細(xì)胞質(zhì)量要求比較高的科學(xué)研究以及在拯救瀕危珍貴小鼠模型時使用更多的是成年小鼠。本研究以成年小鼠為研究對象進(jìn)行受精后激素誘導(dǎo)超排，在見栓和激素誘導(dǎo)后，平均每只鼠可二次排卵25.6枚，相對于對照組小鼠差異顯著（P＜0.01）。結(jié)果說明，雙排卵實(shí)驗(yàn)方案能夠顯著提高成年雌鼠的超排效果。

自然受孕的小鼠受精卵在適宜的條件下，會繼續(xù)發(fā)育成為多細(xì)胞胚胎。但8只常規(guī)雙排卵實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)僅有4只收集到總數(shù)16枚正常發(fā)育的多細(xì)胞胚胎（平均2枚），說明在雌鼠接受外源激素注射后，小鼠體內(nèi)自然受孕產(chǎn)生的受精卵在胚胎發(fā)育過程中受到嚴(yán)重的抑制。為了更大程度上提高雌鼠超排效果，明確一次胚胎（自然產(chǎn)生的受精卵）減少的原因，本研究小組觀察了自然交配見栓鼠在注射PMSG不同時間節(jié)點(diǎn)輸卵管內(nèi)胚胎數(shù)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PMSG注射后伴隨32～48 h壺腹部消失，僅極少量胚胎停留在原壺腹部位置，近子宮端輸卵管和子宮內(nèi)均無胚胎。本項研究表明，HCG的注射時間與壺腹部的狀態(tài)對自然受孕一次胚胎的發(fā)育有密切關(guān)系。

通過改良的二次超排方案，將超排時間改為見栓當(dāng)日9：00注射PMSG，并將HCG的注射時間提前到次日16：00注射（與PMSG注射間隔縮短至31 h）。調(diào)整后，優(yōu)化雙排實(shí)驗(yàn)組平均每只鼠收集到自然排卵發(fā)育而來的8 細(xì)胞胚胎11.7枚，顯著多于常規(guī)雙排卵實(shí)驗(yàn)組（2 枚）。第二次超排18 只鼠均有排卵，共收集到卵子838枚，平均每只鼠產(chǎn)生46.6 枚卵子。18只鼠前后兩次排卵合計收集到1 110枚卵子和胚胎（平均每只高達(dá)61.7枚），數(shù)量分別較自然排卵組（平均15.1枚）、隨機(jī)超排組（平均16.6枚）和常規(guī)雙排卵組（平均31.8枚）提高了307.23%、272.12%和94.23%。其中有1只鼠二次排卵總數(shù)高達(dá)109枚，是同齡雌鼠自然排卵的7～13 倍。在不同時期對胚胎觀察發(fā)現(xiàn)，對照組與實(shí)驗(yàn)組一次排卵胚胎在8 細(xì)胞前發(fā)育同步（圖3），在囊胚期實(shí)驗(yàn)組處于3級擴(kuò)張期要晚于對照組，實(shí)驗(yàn)組胚胎受PMSG 的影響一直停留在輸卵管，發(fā)育差距可能是受到不同微環(huán)境的影響。為了評價二次超排募集到的卵子是否具有受精能力，本研究對優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)組采用自然交配來獲得受精卵，有15 只二次見栓鼠共收集到卵子735 枚中有509 枚為受精卵，69.2%的受精率與Luo等［10］的正常小鼠超排受精率結(jié)果相近，說明二次超排卵子為正?？墒芫穆炎?。本研究提供的優(yōu)化雙排卵實(shí)驗(yàn)方案增加了小鼠排卵的數(shù)量，在很大程度上減少了使用的小鼠數(shù)量，對動物福利和科研成本節(jié)約具有深遠(yuǎn)意義。