李晨星，周曉燕，張慕玲

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，江蘇 淮安 223300

胎兒腎臟發(fā)育不良（renal hypodysplasia，RHD）是臨床常見的胎兒泌尿系統(tǒng)畸形（congenital anomalies of the kidney and urinary tract，CAKUT），在活產(chǎn)兒中的發(fā)病率為3‰～7‰，約占兒童慢性腎病和腎衰竭病因的70%［1］，嚴重影響患兒遠期生活質(zhì)量。其表型主要有3類：①腎臟缺如，由胚胎期腎臟發(fā)育未正常啟動所致；②腎臟發(fā)育異常，腎臟含有未完全成熟化的組織，如囊性病變；③腎臟發(fā)育不全，腎臟含有較少的腎單位和/或腎臟體積縮?。?］。

RHD致病機制復(fù)雜，涉及多種基因突變或者信號通路異常［3-4］。目前，約40 個CAKUT 致病基因已被確定，解釋了5%～20%的患者病因［5］。另外大約16%的病例被確定為基因拷貝數(shù)變異導(dǎo)致，其中研究比較多的是17 號染色體上的HNFB1 基因座與22 號染色體上的Di-George 綜合征區(qū)域［6］。16p11.2 基因座是CAKUT 研究熱點區(qū)域，與全面發(fā)育遲緩、畸形、癲癇等相關(guān)，部分患者表現(xiàn)出腎臟畸形或其他腎臟疾病［7］。該區(qū)域的喹啉磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（quinolinic phosphoribosyl transferase，QPRT）基因在腎臟組織中的表達最高，但其對胎兒腎臟發(fā)育的影響尚不明確。

本研究利用免疫組化在胎鼠腎臟組織中對QPRT基因定位，并進一步構(gòu)建了QPRT基因敲除小鼠模型，觀察小鼠及其子代腎臟病理組織學(xué)及腎功能變化，探討QPRT基因缺陷對腎臟發(fā)育的影響，為挖掘RHD新致病基因提供新證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗采用的動物均為C57BL/6JGpt 品系背景，QPRT基因敲除的F0代小鼠購自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究所，于淮安市第一人民醫(yī)院無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級環(huán)境中飼養(yǎng)及配繁，動物飼養(yǎng)環(huán)境嚴格保證溫度為18～22 ℃、相對濕度為40%～70%且明暗交替時間12 h/12 h（07：00-19：00），喂養(yǎng)滅菌水和SPF 級繁殖鼠料，自由進食水。取E13 胎鼠腎臟組織，用免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）檢測QPRT 基因在腎臟中的表達。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)［批準(zhǔn)文號：南醫(yī)大倫審（YX-2-2022-021-01號］，所有實驗動物的操作與飼養(yǎng)均符合國標(biāo)及江蘇省實驗動物中心管理飼養(yǎng)條例，符合倫理規(guī)范要求。

QPRT 引物由南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究所設(shè)計，引物及瓊脂糖粉末購自生工生物工程（上海）股份有限公司，QPRT 引物序列如表1。正義5＇-GAAGGGCAAACCATTAAGAGAAGC-3＇，反義5＇-GCAGTAACAGCAATCCTGTGGAAG-3＇，引物長度24 bp，產(chǎn)物長度256 bp，退火溫度65 ℃。

1.2 方法

1.2.1 QPRT在胎鼠腎臟組織的表達

取E13 胎鼠腎臟組織，用4%多聚甲醛過夜固定，取出沖洗后脫水，組織包埋切片，對石蠟切片進行免疫組化。載玻片用二甲苯脫蠟，然后在乙醇中連續(xù)脫水，蒸餾水浸洗。在0.1 mol/L 檸檬酸修復(fù)液（pH6）中，中高火加熱玻片30 min 進行抗原修復(fù)。在3% H2O2中室溫避光孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS（pH7.4）浸洗3次，每次5 min。將載玻片封閉在3%BSA 溶液中，置于濕盒中室溫孵育30 min。而后甩掉封閉液，滴加一抗工作液均勻覆蓋組織，使載玻片在一抗中4℃孵育過夜。第2天取出切片室溫復(fù)溫30 min，潤洗后，滴加與一抗對應(yīng)的即用型快捷免疫組化MaxVisionTMHRP 二抗覆蓋組織，在室溫下持續(xù)30 min。再次潤洗，用DAB過氧化物酶底物試劑盒進行顯色，蘇木素復(fù)染。連續(xù)脫水待干后，中性樹脂封片。

1.2.2 基因敲除小鼠模型建立及表型鑒定

CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建QPRT 基因敲除小鼠模型：由南京大學(xué)模式動物研究所訂購QPRT Cas9-KO斑點鼠（-4 321 bp/wt，E2-E4 完全刪除，KO 陽性，5.43周齡），得到嵌合體F0代小鼠。

QPRT 基因敲除小鼠的飼養(yǎng)和繁殖：將F0 代中所有小鼠飼養(yǎng)于SPF 級環(huán)境中，提供充足的食物與可飲用水。通過PCR 及TA 克隆測序分析，從所有的F0代小鼠中挑選出QPRT 基因缺失的小鼠，然后將性成熟的陽性F0 代小鼠（滿8 周）分別與同齡的C57BL/6J 小鼠交配，培育后成功獲得F1 代小鼠，繼續(xù)將F1代小鼠在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，再將性成熟的F1代雌雄小鼠相互雜交，雜交后的每只F1代孕鼠單獨飼養(yǎng)、培育，得到F2代小鼠。

基因型鑒定：同一父母產(chǎn)生的后代小鼠中包含野生型（WT）、雜合型（HT）和基因敲除型（KO）3種基因型。采用剪腳趾法標(biāo)記小鼠，并剪取鼠尾組織經(jīng)酚氯仿法提取DNA，依據(jù)表格1中在靶區(qū)域設(shè)計的引物進行擴增，于1.5%瓊脂糖凝膠上加入PCR 擴增產(chǎn)物5 μL，DNA Marker 3 μL，電泳30 min后通過凝膠成像儀獲取條帶，凝膠分析系統(tǒng)進行分析?；蛐丸b定后篩選出WT型和KO型小鼠。

Western blot 檢測QPRT 蛋白表達：處死小鼠后取腎臟組織，加入蛋白裂解液提取蛋白。蛋白定量后，加入5×上樣緩沖液配成樣品，90 ℃水浴10 min使蛋白變性，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗，4 ℃過夜孵育，加入對應(yīng)的二抗，室溫孵2 h，ECL發(fā)光顯色，成像分析。

稱重法、腎功能檢測、HE染色實驗方法：初步分析已獲得的QPRT敲除小鼠的表型，以出生后第8周QPRT-/-（KO 組）小鼠為實驗組，同周齡QPRT+/+（WT組）小鼠作為對照組，處死小鼠后取出腎臟組織。稱重法檢測各組小鼠的體重與腎臟重量，評估腎臟系數(shù)（腎重/體重比）結(jié)果是否具有統(tǒng)計學(xué)差異。使用全自動生化分析儀測量小鼠血清肌酐、尿素氮、尿總蛋白，計算內(nèi)生肌酐清除率。分離E11.5 WT型胎鼠和KO型胎鼠的腎臟、脾臟、肺部、心臟及肝臟，4%多聚甲醛固定后進行常規(guī)石蠟包埋、切片，通過蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色評估組織病理學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 QPRT在胎鼠腎臟組織的表達

顯微鏡拍照如下圖。發(fā)現(xiàn)QPRT 在E13天胎鼠腎臟組織的輸尿管芽（ureteric bud，UB）表達（圖1）。

圖1 QPRT在胎鼠腎臟的輸尿管芽中表達Figure 1 Expression of QPRT in ureteril bud of fetal mouse kidney

2.2 QPRT基因敲除小鼠基因型鑒定

對F2 代小鼠提取鼠尾DNA 進行PCR 擴增，電泳結(jié)果如圖2示，出現(xiàn)1 條256 bp 左右條帶的為QPRT-/-（KO組）小鼠；只出現(xiàn)1條408 bp左右的條帶的為QPRT+/+（WT組）小鼠。

圖2 小鼠PCR基因型鑒定Figure 2 PCR genotyping of the QPRT WT and KO mice

2.3 基因敲除小鼠腎臟組織中QPRT蛋白表達情況

Western blot結(jié)果表明，QPRT-/-小鼠腎臟組織中QPRT 蛋白基本不表達，而QPRT+/+小鼠腎臟組織中的QPRT 表達水平較高，雜合子的表達水平介于兩者之間（圖3），GAPDH為內(nèi)參蛋白。

圖3 Western blot法檢測QPRT蛋白在野生型、雜合子、純合子小鼠腎臟組織中的表達Figure 3 Detection of QPRT protein expression in the wild type，heterozygote and homozygote mouse kidney tissues by Western blot

2.4 QPRT基因敲除小鼠表型鑒定

2.4.1 QPRT-/-與QPRT+/+小鼠的體重、腎臟重量及腎臟系數(shù)分析

以出生后第8 周QPRT-/-小鼠為實驗組，同周齡QPRT+/+小鼠作為對照組。

雌性組（KO組n=8，WT組n=8）：在小鼠體重上，KO 組平均值19.32 g 小于WT 組平均值19.95 g（P＜0.05，圖4A）；在腎臟重量上，KO組平均值0.12 g小于WT 組平均值0.21 g（P＜0.05，圖4B）；在腎臟系數(shù)上，KO組平均值0.006小于WT組平均值0.010（P＜0.05，圖4C）。雄性組（KO 組n=10，WT 組n=12）：在小鼠體重上，KO組平均值28.56 g小于WT組平均值29.15 g（P＜0.05，圖4D）；在腎臟重量上，KO 組平均值0.34 g 小于WT 組平均值0.41 g（P＜0.05，圖4E）；在腎臟系數(shù)上，KO 組平均值0.012 小于WT 組平均值0.014（P＜0.05，圖4F）。

2.4.2 QPRT-/-與QPRT+/+小鼠的腎功能分析

對各組小鼠進行腎功能檢測發(fā)現(xiàn)，KO 組與WT組相比，KO 組URE、CRE-S、Glu、URIC 和β2-MG 的含量均顯著升高（P＜0.05，圖5），KO 小鼠的血清檢測中尿素氮、血肌酐、尿酸水平高于WT組（秩和檢驗：尿素氮Z=-2.562，P＜0.05；肌酐Z=-2.402，P＜0.05；尿酸Z=-1.992，P＜0.05）。

圖4 雄性組及雌性組小鼠的體重、腎臟重量及腎臟系數(shù)（腎重/體重比）結(jié)果Figure 4 Results of body weight，kidney weight and kidney coefficient（kidney weight/ body weight ratio）of male and female mice

圖5 KO組與WT組腎功能參數(shù)比較結(jié)果Figure 5 Comparison of renal function parameters between KO group and WT group

2.4.3 QPRT-/-仔鼠病理組織學(xué)分析

雌性QPRT+/-小鼠與QPRT+/-雄性交配，因小鼠腎臟在出生2周后發(fā)育結(jié)束，所以在此時處死仔鼠，收集腎臟、脾臟、肺部、心臟及肝臟，進行HE染色。腎臟組織HE染色顯示QPRT-/-仔鼠的腎臟實質(zhì)部位局部呈現(xiàn)蜂窩狀囊性擴張（圖6A、B）。QPRT+/-仔鼠病變較輕，見腎臟皮質(zhì)間質(zhì)局灶性疏松水腫（圖6C），腎臟部分區(qū)域近曲小管上皮細胞胞質(zhì)空泡樣變性（圖6D）；QPRT+/+仔鼠腎臟未見明顯病理組織學(xué)變化（圖6E、F）。QPRT-/-與QPRT+/-仔鼠的其余臟器（脾臟、肺部、心臟及肝臟）未見明顯病理組織學(xué)變化。

圖6 仔鼠腎臟顯微鏡下腎臟實質(zhì)部位Figure 6 Microscopic examination of renal parenchyma in offspring

3 討論

QPRT 基因位于16p11.2（NC_000016.10）區(qū)域，主要在人和小鼠的腎臟和肝臟中特異性表達。在成熟腎臟中，QPRT 蛋白主要分布在新陳代謝最活躍的近端小管上皮細胞中。研究提示，QPRT 基因純合缺失是自閉癥發(fā)病原因之一［8］，QPRT也是急性髓性白血病的直接靶基因，亦可以加重神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡化程度［8］。但是目前尚無報道QPRT 與胚胎腎臟發(fā)育的關(guān)系。

前期研究發(fā)現(xiàn)QPRT 在胎鼠早期發(fā)育中的UB中明顯表達，該定位提示了QPRT 基因可能在胚胎腎臟發(fā)育中發(fā)揮功能。哺乳動物的腎臟起源于后腎，形成于人類胚胎第5周，相當(dāng)于小鼠胚胎第11天。后腎的發(fā)育依賴于UB 和后腎間充質(zhì)（metanephric mesenchyme，MM）之間的一系列相互誘導(dǎo)、相互作用［9］。UB 入侵MM 并分枝，最終分化成為集合管、腎盂和輸尿管。UB 又向MM 傳遞信息，使其發(fā)育成為腎單位和腎間質(zhì)［10］。研究表明這些復(fù)雜發(fā)育過程通過大量基因及信號傳導(dǎo)通路進行調(diào)控。如已知的GDNF/Ret 通路、Wnt 以及NOTCH 途徑等；原癌基因RET、WNT11 在UB 特異性表達，GDNF、WT1 和EYA1 在MM 表達，這些關(guān)鍵步驟中的基因和轉(zhuǎn)錄因子的變異可導(dǎo)致RHD 的發(fā)生［11］?；谇捌谘芯刻崾綫PRT 在UB 表達，本研究推測QPRT功能缺失可能干擾UB與MM相互作用從而導(dǎo)致腎臟畸形的發(fā)生。

CRISPR/Cas9技術(shù)是目前發(fā)展迅速并廣泛應(yīng)用的基因編輯技術(shù)［12］，本研究使用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了QPRT缺陷型小鼠，發(fā)現(xiàn)QPRT基因敲除后小鼠的肌酐、尿素氮等腎功能指標(biāo)升高，提示小鼠腎功能受損。QPRT 是NAD+從頭合成途徑的限速酶，來自實驗?zāi)Ｐ秃团R床研究的數(shù)據(jù)揭示NAD+穩(wěn)態(tài)是腎臟健康和腎小管抵抗各種應(yīng)激源能力的決定因素［13］。有研究通過小鼠局部腎損傷模型結(jié)合代謝組學(xué)分析篩選出了與急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）相關(guān)的代謝變化，發(fā)現(xiàn)此時腎臟的NAD+下降，喹啉酸上升，QPRT 下降。隨后研究者又采用了基因編輯的辦法獲得了QPRT+/-小鼠，以模仿QPRT 下降這一獲得性缺陷，發(fā)現(xiàn)QPRT 的下降導(dǎo)致了腎臟中NAD+的下降，并且升高了尿中的喹啉酸鹽，加劇了小鼠對AKI 的敏感性［13］。此外，亦有研究表明中成藥健脾益腎方能夠通過上調(diào)QPRT/NAD+/SIRT3通路的蛋白表達，有效緩解慢性腎臟疾病進展［14］。以上結(jié)果表明QPRT可以保護腎臟的NAD+，并介導(dǎo)機體對AKI的抵抗力。

已有大量關(guān)于基因劑量改變引起復(fù)雜的涉及腎臟和腎外表型的研究，如由PAX2 突變引起的腎發(fā)育不全的腎缺損綜合征。動物模型顯示，PAX2純合子突變模型小鼠雙側(cè)腎缺如；雜合子突變小鼠腎臟表型為發(fā)育不全；PAX2 過量表達時則形成多囊腎［15］。MAZ 基因亦是調(diào)控生殖泌尿系統(tǒng)發(fā)育的劑量敏感性基因。MAZ 的純合缺失導(dǎo)致65.5%的CAKUT 發(fā)病率，野生型及雜合型的CAKUT 外顯率低于6%［16］。本研究結(jié)果顯示野生型、雜合型和純合型小鼠的QPRT基因表達呈遞減趨勢；KO小鼠的腎臟系數(shù)（腎重/體重比）顯著降低，這提示QPRT 敲除后小鼠的腎單位數(shù)量減少，其子代QPRT 純合子突變模型小鼠呈雙側(cè)腎臟多囊性發(fā)育不良，雜合子突變小鼠腎臟輕度多囊性改變，這有力地證明了QPRT基因?qū)π∈竽I臟發(fā)育的影響具有基因劑量效應(yīng)。最近的研究表明，NAD+合成途徑關(guān)鍵基因的突變可導(dǎo)致先天性畸形，包括編碼色氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因、編碼Kynurenine通路酶的基因（NMNAT1-3和NADSYN1）［17］。另外亦有研究表明QPRT 拷貝數(shù)缺失并外源性煙酸缺乏的小鼠血液NAD+濃度明顯降低［18］。基于QPRT參與NAD+合成，推測小鼠模型表現(xiàn)的腎臟病理組織學(xué)表型可能與其過低的NAD+濃度相關(guān)，這亦為我們研究QPRT 影響腎臟發(fā)育的機制提供了方向。

綜上所述，本研究從QPRT 基因敲除的成年小鼠與胎鼠的腎臟等組織水平研究QPRT基因?qū)ε咛ツI臟發(fā)育的致病作用，預(yù)測QPRT 基因可能為RHD的潛在致病基因。本研究的不足之處在于未能探索QPRT 在腎臟發(fā)育中的具體調(diào)控機制。但是QPRT 基因是NAD+合成途徑的關(guān)鍵酶基因，這亦為從代謝角度深入研究RHD 的致病機制提供了依據(jù)，并有望為后續(xù)的臨床診斷及靶向治療提供新線索。