居悅俊，郭展宏，王冠怡，沈婷，吳潤澤，孔穎宏

常熟市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 常熟 215500

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是世界上最常見的代謝性疾病，由胰島素缺乏及作用減弱引起［1］。目前全球有10%的人患有DM［2］。DM會(huì)引起微血管并發(fā)癥，例如糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）、腎病和神經(jīng)病變［3］。據(jù)報(bào)道，超過30%的DM患者患有DR［4-5］，即使積極治療，仍有10%的DR 患者不可避免地會(huì)失明［6］。雖然早期檢測和治療對(duì)于防治DR非常重要，但是目前可用于DR早期發(fā)現(xiàn)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的診斷性生物標(biāo)志物仍需要探索。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指轉(zhuǎn)錄本超過200 nt 的單鏈RNA，參與調(diào)控許多生物過程［7］。已有研究表明，lncRNA與DR發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可作為DR診斷和治療的潛在靶點(diǎn)［8-9］。例如，Liu等［10］研究揭示了lncRNA MALAT1敲低可以抑制高糖（high glucose，HG）環(huán)境下的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal microvascular endothelial cell，hRMEC）的小管形成。Zhang 等［11］研究顯示lncRNA AK077216過表達(dá)顯著抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（human retinal pigment epithelial cell，hRPE）的凋亡。lncRNA VIM 反義RNA 1（LncRNA VIM Antisense RNA 1，lncRNA VIM-AS1）之前被鑒定為癌癥相關(guān)的lncRNA［12］。最近有研究顯示，lncRNA VIM-AS1 在DM 患者中異常表達(dá)［13］。更重要的是，lncRNA VIM-AS1在DM合并DR患者中表達(dá)明顯降低，lncRNA VIM-AS1 過表達(dá)明顯抑制HG 處理的hRPE 的細(xì)胞凋亡［14］，表明其在DR 中起關(guān)鍵作用。但lncRNA VIM-AS1 在DR 中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長度約為22 nt的非編碼單鏈RNA分子，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［15］。先前的一項(xiàng)研究顯示，miR-497在DM大鼠的胰腺中顯著上調(diào)，這表明miR-497可能在DM進(jìn)展中充當(dāng)某種作用［16］。此外，Li等［17］研究顯示miR-497-5p在HG處理的視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)，miR-497-5p 過表達(dá)顯著促進(jìn)HG 處理的視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。

F-box 和WD-40 結(jié)構(gòu)域蛋白（F-box and WD-40 domain proteins，F(xiàn)BXW7）作為泛素-蛋白酶體降解途徑的關(guān)鍵識(shí)別因子之一，被證實(shí)在調(diào)節(jié)DR 進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。Shao等［18］證明了FBXW7 敲低可以促進(jìn)DR 中的新生血管形成。據(jù)報(bào)道，DR 小鼠和HG處理的hRMEC 中FBXW7 表達(dá)顯著降低，并且FBXW7過表達(dá)可以抑制HG誘導(dǎo)的血管生成［19］。因此，本研究對(duì)lncRNA VIM-AS1、miR-497-5p 和FBXW7 在DR 發(fā)展中的調(diào)控關(guān)系及作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 材料

ARPE-19 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）。lncRNA VIMAS1 的過表達(dá)質(zhì)粒（overexpression plasmid of lncRNA VIM-AS1，OE-VIM-AS1）、短發(fā)夾-FBXW7（sh-FBXW7）、miR-497-5p 模擬物（miR-497-5p mimics）、miR-497-5p 抑制劑（miR-497-5p inhibitror）及其陰性對(duì)照組（pcDNA3.1、shRNA、mimics/inhibitror NC）（上海吉瑪基因）。雙熒光素酶報(bào)告基因測定系統(tǒng)（北京Promega 公司）。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）（上海生工公司）。Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒、BCA 試劑盒（Beyotime 公司，上海）。SYBR 試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

所有細(xì)胞均在含有10%胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）和1%青霉素/鏈霉素溶液（上海生工）的DMEM（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）中于37 ℃5%CO2培養(yǎng)。HG處理為細(xì)胞用30 mmol/L D-葡萄糖（Sigma-Aldrich公司，美國）處理48 h。使用600 μg/mL 晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）（Biovision 公司，美國）處理細(xì)胞，并將其作為HG處理的陽性對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

使用LipofectamineTM3000（Invitrogen 公司，美國）將OE-VIM-AS1、sh-FBXW7 和miR-497-5p mimics/inhibitror 及其陰性對(duì)照組（pcDNA3.1、shRNA、mimics/inhibitror NC）轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

使用常見的在線工具預(yù)測lncRNA VIM-AS1、miR-497-5p 和FBXW7之間的結(jié)合位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增人lncRNA VIM-AS1/FBXW7 片段。使用定點(diǎn)突變?cè)噭┖校⊿tratagene 公司，美國）對(duì)lncRNA VIM-AS1/FBXW7 片段中的miR-497-5p 結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變檢測。將lncRNA VIM-AS1/FBXW7 序列的野生型（wild type，wt）和突變型（mutate，mut）報(bào)告質(zhì)粒克隆到pmirGLO 載體（上海吉瑪基因）中。用lncRNA VIM-AS1-wt/FBXW7-wt 或lncRNA VIM-AS1-mut/FBXW7-mut 質(zhì)粒 和miR-497-5p mimics 或mimics NC 或miR-497-5p inhibitor或inhibitor NC 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞LipofectamineTM3000。使用雙熒光素酶報(bào)告基因測定系統(tǒng)檢查熒光素酶活性。

1.2.4 傷口愈合試驗(yàn)

將細(xì)胞接種到6 孔板（Corning 公司，美國）。當(dāng)細(xì)胞融合程度達(dá)到約90%時(shí)，使用200 μL移液器吸頭在融合的細(xì)胞單層中產(chǎn)生人工傷口。用PBS洗滌細(xì)胞3 次并加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，使用顯微鏡（Olympus公司，日本）在0 h和24 h拍攝圖像。

1.2.5 CCK-8檢測

將細(xì)胞接種在96 孔板中，與CCK-8（10 μL）一起孵育，并在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育2 h。使用微孔板分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）在450 nm處檢測吸光度。

1.2.6 細(xì)胞凋亡測定

使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒分析細(xì)胞凋亡。收獲細(xì)胞并重新懸浮在500 μL的1×Annexin結(jié)合緩沖液（中國Beyotime）中。細(xì)胞在黑暗條件下用10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI（中 國Beyotime）染色10 min，立即使用流式細(xì)胞儀分析樣品。

1.2.7 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR）

用TRIzol 試劑（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）分離總RNA。對(duì)于mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Toyobo公司，日本）合成cDNA。對(duì)于miRNA，使用第一鏈cDNA 合成試劑盒合成cDNA。然后，使用SYBR 試劑盒將cDNA 用于qRT-PCR 測定。miRNA 和mRNA 的相對(duì)表達(dá)分別用U6 和GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計(jì)算。研究中使用的引物如下：LncRNA VIM-AS1 正義：5＇-ACTGTAATGGACTCGTGGTG-3＇，反義：5＇-CGTCGTGTTGTCCTGATG-3＇；miR-497-5p 正義：5＇-CCTTCAGCAGCACACTGTGG-3＇，反義：5＇-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3＇；FBXW7正義：5＇-ACTGGGCTTGTACCATGTTCA-3＇，反義：5＇-TGAGGTCCCCAAAAGTTGTTG-3＇；U6 正義：5＇-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3＇，反義：5＇-AAATATGGAACGCTTCACGA-3＇；GAPDH 正義：5＇-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3＇，反義：5＇-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3＇。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法

用RIPA 分離蛋白質(zhì)，用BCA 試劑盒（中國Beyotime）測定蛋白質(zhì)濃度。樣品通過8%～12% SDSPAGE 分離，進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Millipore 公司，美國）。然后將膜與針對(duì)FBXW7（1∶1 000，Abcam公司，美國）和GAPDH（1∶10 000，Sigma-Aldrich 公司，美國）的抗體在4 ℃下孵育過夜。用PBS-T洗滌后，將膜與用HRP（1∶10 000，Abcam 公司，美國）標(biāo)記的相應(yīng)二抗孵育60 min。通過GEL成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）對(duì)膜進(jìn)行可視化和成像。通過軟件Image J分析蛋白質(zhì)的定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究使用GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析。進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。測量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)均來自至少3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HG 處理抑制ARPE-19 細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)通過下調(diào)lncRNA VIM-AS1促進(jìn)細(xì)胞凋亡

首先，評(píng)估了不同培養(yǎng)基中的ARPE-19細(xì)胞中l(wèi)ncRNA VIM-AS1 的表達(dá)，結(jié)果顯示lncRNA VIMAS1 在HG 及AGE 處理后的ARPE-19 細(xì)胞中的表達(dá)分別為0.40±0.05 及0.45±0.06，正常培養(yǎng)基（NG）組的表達(dá)為1.00±0.13，HG組及AGE組與NG相比顯著下調(diào)，t值分別為7.449 及6.723，P值分別為0.002及0.003（圖1A）。為了評(píng)估lncRNA VIM-AS1 在DR中的功能，用lncRNA VIM-AS1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ARPE-19 細(xì)胞，并評(píng)估細(xì)胞表型。qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染OE-VIM-AS1 后ARPE-19 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA VIM-AS1 的表達(dá)顯著增加（4.51±0.87，t=6.481，P=0.003，圖1B）表明轉(zhuǎn)染成功。CCK-8 實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)過HG 處理后，ARPE-19 的細(xì)胞活力明顯受到抑制［（54.06±11.16）%，t=3.346，P=0.028，圖1C］。HG處理后，流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示Q2 及Q3 象限中的細(xì)胞凋亡明顯增加［（18.48±1.65）%，t=11.86，P＜0.001］。過表達(dá)lncRNA VIM-AS1，細(xì)胞凋亡減少［（7.69±2.28）%，t=6.640，P=0.003］。這表明HG 處理后的ARPE-19 細(xì)胞的細(xì)胞增殖受到抑制，而過表達(dá)lncRNA VIM-AS1則逆轉(zhuǎn)這一改變（圖1D）。此外觀察到HG 處理ARPE-19 細(xì)胞后，傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞遷移受到抑制［（37.35±5.77）%，t=5.631，P=0.005］。過表達(dá)lncRNA VIM-AS1 后細(xì)胞遷移增加［（65.60±8.87）%，t=5.299，P=0.006，圖1E］。所有這些結(jié)果表明，HG 處理抑制了ARPE-19 細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)通過降低lncRNA VIM-AS1 表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

圖1 HG處理抑制ARPE-19細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)通過下調(diào)lncRNA VIM-AS1促進(jìn)細(xì)胞凋亡Figure 1 HG treatment inhibited the proliferation and migration of ARPE-19 cells，while promoting apoptosis by down-regulating lncRNA VIM-AS1

2.2 LncRNA VIM-AS1 在ARPE-19 細(xì)胞中通過海綿化miR-497-5p抑制miR-497-5p的表達(dá)

眾所周知，lncRNA 通過充當(dāng)miRNA 的海綿來實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能（即lncRNA通過與miRNA結(jié)合，減弱miRNA 對(duì)靶基因的沉默，從而對(duì)miRNA 的靶基因進(jìn)行調(diào)控）。本研究發(fā)現(xiàn)在lncRNA VIM-AS1 過表達(dá)后，ARPE-19細(xì)胞中miR-497-5p的表達(dá)顯著降低（0.42±0.08，t=6.768，P=0.003，圖2A）。在轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics后，ARPE-19 細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)顯著升高（3.31±0.30，t=11.38，P＜0.001），而miR-497-5p 在miR-497-5p 敲低后顯著下調(diào)（0.31±0.11，t=5.911，P=0.004，圖2B），表明轉(zhuǎn)染成功。預(yù)測lncRNA VIM-AS1和miR-497-5p之間存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2C）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種結(jié)合關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因測定，結(jié)果顯示miR-497-5p mimics/inhibitor 在與lncRNA VIM-AS1-wt 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后抑制/提高了熒光素酶活性（0.54±0.09）/（1.53±0.21），t值分別為5.541及4.228，P值分別為0.005及0.013。共轉(zhuǎn)染lncRNA VIM-AS1-mut 載體后沒有發(fā)生顯著性影響（P＞0.05，圖2D）。因此，lncRNA VIM-AS1 靶向miR-497-5p 以負(fù)向調(diào)節(jié)miR-497-5p表達(dá)。

圖2 LncRNA VIM-AS1通過海綿化miR-497-5p抑制miR-497-5p表達(dá)Figure 2 LncRNA VIM-AS1 inhibits miR-497-5p expression by sponging miR-497-5p

2.3 miR-497-5p過表達(dá)逆轉(zhuǎn)lncRNA VIM-AS1過表達(dá)對(duì)HG處理的ARPE-19細(xì)胞遷移和凋亡的影響

首先，觀察到miR-497-5p 在HG 處理后的ARPE-19 細(xì)胞中顯著上調(diào)（2.36±0.31，t=6.820，P=0.002，圖3A）。為探究lncRNA VIM-AS1/miR-497-5p在DR 進(jìn)展中的潛在作用，將miR-497-5p mimics 和OE-VIM-AS1 共轉(zhuǎn)染HG 處理的ARPE-19 細(xì)胞。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示lncRNA VIM-AS1過表達(dá)促進(jìn)了HG處理的ARPE-19 細(xì)胞的活性［（181.01±26.98）%，t=4.621，P=0.009］。在miR-497-5p過表達(dá)后細(xì)胞活性為（93.98±17.00）%（t=4.726，P=0.009），miR-497-5p過表達(dá)能恢復(fù)lncRNA VIM-AS1 過表達(dá)的造成的細(xì)胞活性增加（圖3B）。與HG+mimics NC+vector 組相比，HG+mimics NC+OE-VIM-AS1 組的流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示Q2及Q3象限中的細(xì)胞凋亡明顯減少［（7.92±1.94）%，t=11.33，P＜0.001］。而轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics 后細(xì)胞凋亡為（19.59±3.44）%（t=5.528，P=0.005）。轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics 逆轉(zhuǎn)了lncRNA VIM-AS1 過表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡減少（圖3C）。此外，OE-VIM-AS1 轉(zhuǎn)染導(dǎo)致HG 處理的ARPE-19 細(xì)胞遷移增加［（58.61±5.17）%，t=5.551，P=0.005］。而miR-497-5p 過表達(dá)的細(xì)胞遷移為（42.03±7.75）%（t=3.083，P=0.036）。miR-497-5p 過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)lncRNA VIM-AS1 過表達(dá)引起的細(xì)胞遷移增加（圖3D）。因此，miR-497-5p 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)lncRNA VIM-AS1 過表達(dá)對(duì)HG 處理的ARPE-19 細(xì)胞遷移和凋亡的影響。

圖3 miR-497-5p過表達(dá)逆轉(zhuǎn)lncRNAVIM-AS1過表達(dá)對(duì)HG處理的ARPE-19細(xì)胞表型的影響Figure 3 miR-497-5p overexpression reverses the effect of lncRNA VIM-AS1 overexpression on the phenotype of HG-treated ARPE-19 cells

2.4 FBXW7是miR-497-5p的靶基因

qRT-PCR 結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7 的mRNA 表達(dá)因miR-497-5p 過表達(dá)而顯著降低［（0.43±0.13），t=6.995，P=0.002］。miR-497-5p 敲低后FBXW7 的mRNA 表達(dá)升高（2.16±0.18，t=7.960，P=0.001，圖4A）。免疫印跡檢測結(jié)果顯示顯示，F(xiàn)BXW7的蛋白表達(dá)因miR-497-5p 過表達(dá)而顯著降低（0.16±0.04，t=6.995，P=0.002）。miR-497-5p 敲低后FBXW7 的蛋白表達(dá)升高（0.63±0.06，t=2.822，P=0.048，圖4B）。使用生物信息學(xué)軟件miRanda 預(yù)測了miR-497-5p和FBXW7之間的潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖4C）。隨后進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因測定以驗(yàn)證miR-496-5p和FBXW7之間的相互作用，將FBXW7的3＇UTR區(qū)域構(gòu)建至載體中報(bào)告基因luciferase 的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，比較過表達(dá)或干擾miR-496-5p 后目的FBXW7 的熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-496-5p 后野生型FBXW7（FBXW7-WT）的熒光素酶活性明顯下降（0.55±0.19，t=3.702，P=0.021）。同時(shí)敲低miR-496-5p 后發(fā)現(xiàn)FBXW7-WT 的的熒光素酶活性明顯上升（1.45±0.11，t=4.385，P=0.012）。miR-496-5p的過表達(dá)及敲低后突變型FBXW7的熒光素酶活性無顯著改變（P＞0.05，圖4D）。因此，F(xiàn)BXW7 是miR-497-5p 的靶基因，過表達(dá)miR-497-5p可以抑制FBXW7的表達(dá)。

圖4 FBXW7是miR-497-5p的靶基因Figure 4 FBXW7 is the target gene of miR-497-5p

2.5 敲低miR-497-5p可以調(diào)節(jié)FBXW7的表達(dá)促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞的增殖和遷移并抑制細(xì)胞凋亡

探索FBXW7對(duì)miR-497-5p 介導(dǎo)的體外生物學(xué)功能的影響。qRT-PCR 檢測顯示，轉(zhuǎn)染sh-FBXW7抑制了FBXW7 mRNA 在ARPE-19 細(xì)胞中的（0.36±0.10，t=6.325，P=0.003，圖5A）。免疫印跡檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染sh-FBXW7 抑制了FBXW7 蛋白在ARPE-19 細(xì)胞中的表達(dá)（0.21±0.08，t=4.590，P=0.010，圖5B）。CCK-8檢測實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示miR-497-5p的敲低促進(jìn)了HG 處理的ARPE-19 細(xì)胞的細(xì)胞活性［（183.05 ± 22.38）%，t=6.269，P=0.003］。抑 制FBXW7 可以逆轉(zhuǎn)敲低miR-497-5p 導(dǎo)致的細(xì)胞活性增加［（91.02±22.38）%，t=6.128，P=0.004，圖5C］。此外，如圖5D 所示，轉(zhuǎn)染miR-497-5p inhibitor 導(dǎo)致HG 處理的ARPE-19 細(xì)胞凋亡減少［（7.79±1.66）%，t=9.309，P＜0.001］。轉(zhuǎn)染sh-FBXW7后則可逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染miR-497-5p inhibitor導(dǎo)致的ARPE-19細(xì)胞凋亡減少［（19.43±4.02）%，t=4.636，P=0.009，圖5D］。傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-497-5p 的敲低促進(jìn)了HG處理的ARPE-19 細(xì)胞的遷移［（62.30±7.48）%，t=4.471，P=0.011］，抑制FBXW7而能夠逆轉(zhuǎn)細(xì)胞遷移的增多［（45.42±6.13）%，t=3.024，P=0.039，圖5E］。因此，敲低miR-497-5p 促進(jìn)了ARPE-19 細(xì)胞的增殖和遷移，并通過調(diào)節(jié)FBXW7的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。

圖5 敲低miR-497-5p可以調(diào)節(jié)FBXW7的表達(dá)促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞的增殖和遷移并抑制細(xì)胞凋亡Figure 5 Knockdown of miR-497-5p can regulate the expression of FBXW7，promote the proliferation and migration of ARPE-19 cells and inhibit apoptosis

3 討論

DM 是一種高發(fā)的慢性病，其病理和生理的改變能夠引起一系列并發(fā)癥，對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅［20-21］。DR 常見于病程較長的DM 患者［5］，DR 是DM相關(guān)失明的危險(xiǎn)因素，中晚期DR可能會(huì)導(dǎo)致不可逆的病變。DR的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，給DR的早期診斷和治療帶來了困難。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA VIM-AS1 通過調(diào)節(jié)miR-497-5p/FBXW7 軸來介導(dǎo)DR中ARPE-19細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡。

視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞是指滋養(yǎng)視網(wǎng)膜視覺細(xì)胞［22］。視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞增殖降低和細(xì)胞凋亡增加會(huì)導(dǎo)致DR 患者視力喪失［23］。正如廣泛報(bào)道的那樣，視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡受某些lncRNA 的調(diào)節(jié)［24］。LncRNA AK077216可以抑制HG處理的ARPE-19細(xì)胞的凋亡［11］。此外，據(jù)報(bào)道lncRNA MEG3 可抑制HG 處理的ARPE-19 細(xì)胞的凋亡［25］。此外，lncRNA VIM-AS1 在DM 和DM 相關(guān)并發(fā)癥中的作用之前已有報(bào)道［13-14，26］，但在DR中的調(diào)節(jié)功能尚不清楚。最近一項(xiàng)研究表明，與其他DM 患者相比，DR 患者的lncRNA VIM-AS1表達(dá)降低［14］，這表明lncRNA VIMAS1 有可能成為DR 預(yù)后和治療的新型生物標(biāo)志物。值得注意的是，據(jù)報(bào)道，lncRNA VIM-AS1通過miR-29 抑制HG 誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞凋亡［14］。然而，lncRNA VIM-AS1 調(diào)控DR進(jìn)展的具體分子機(jī)制仍不清楚。本研究中，lncRNA VIM-AS1 在HG處理的ARPE-19細(xì)胞中被下調(diào)，這與之前的研究完全一致［14］。此外，lncRNA VIM-AS1 過表達(dá)促進(jìn)了HG處理的ARPE-19細(xì)胞的增殖和遷移，并抑制了細(xì)胞凋亡。

lncRNA 通過充當(dāng)miRNA 的內(nèi)源誘餌發(fā)揮競爭性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的作用，進(jìn)而影響miRNA 與其靶標(biāo)的結(jié)合［27］，這被認(rèn)為是闡明lncRNA 分子機(jī)制的重要途徑之一。據(jù)此，科學(xué)界提出了ceRNA 假說，這被描述為一種新的RNA 調(diào)控機(jī)制［28］。據(jù)報(bào)道，lncRNA MIR497HG通過調(diào)節(jié)miR-128-3p來抑制HG處理的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移［29］。然而，尚不清楚lncRNA VIMAS1是否通過充當(dāng)miRNA海綿在DR中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究提出了一個(gè)新的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中l(wèi)ncRNA VIM-AS1海綿化了miR-497-5p。據(jù)報(bào)道，在HG 條件下，miR-497 的表達(dá)與胰島素水平一致［30］。此外，miR-497在糖尿病腎病患者和HG處理的HK-2 細(xì)胞中顯著下調(diào)，miR-497 過表達(dá)可以抑制HG 處理的HK-2 細(xì)胞的焦亡［31］。更重要的是，據(jù)報(bào)道，miR-497在DM大鼠的視網(wǎng)膜和HG處理的Müller細(xì)胞中顯著上調(diào)［32］，表明miR-497 在不同的糖尿病并發(fā)癥中具有不同的表達(dá)。本研究證實(shí)了miR-497-5p 在HG 處理的ARPE-19 細(xì)胞中顯著上調(diào)。此外，還發(fā)現(xiàn)lncRNA VIM-AS1 可以通過直接靶向miR-497-5p 負(fù)調(diào)控ARPE-19 細(xì)胞中的miR-497-5p。正如預(yù)期的那樣，miR-497-5p mimics 逆轉(zhuǎn)了lncRNA VIM-AS1過表達(dá)對(duì)HG誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞表型的影響。本研究所有的結(jié)果都提供了支持DR中存在lncRNA VIM-AS1/miR-497-5p 調(diào)節(jié)軸的證據(jù)。

眾所周知，失調(diào)的miRNA結(jié)合靶mRNA來抑制基因表達(dá)，從而調(diào)控DR 進(jìn)展［33-34］。因此，本研究旨在探索miR-497-5p 在調(diào)節(jié)DR 進(jìn)展中的下游靶點(diǎn)。FBXW7 作為胎球蛋白A 的E3 泛素連接酶，參與維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，其在肥胖患者肝臟中的表達(dá)對(duì)葡萄糖代謝具有多種有益作用；同時(shí)，敲除正常肝臟中的FBXW7會(huì)導(dǎo)致葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損［35］。更重要的是，據(jù)報(bào)道，F(xiàn)BXW7 可抑制DR 中的血管生成［19］。本研究發(fā)現(xiàn)HG 處理的ARPE-19 細(xì)胞中FBXW7 的表達(dá)顯著降低。FBXW7 是miR-497-5p 的直接靶標(biāo)，F(xiàn)BXW7 調(diào)節(jié)靶蛋白泛素化和降解，F(xiàn)BXW7 的底物包括幾種廣泛研究的癌蛋白，例如MYC、Notch、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR，mTOR），F(xiàn)BXW7與底物構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移［36］。FBXW7 敲低消除了miR-497-5p 抑制ARPE-19 細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)。因此，lncRNA VIM-AS1/miR-497-5p/FBXW7 軸可能是DR發(fā)展的關(guān)鍵參與者。

本研究證明了lncRNA VIM-AS1 通過海綿化miR-497-5p 上調(diào)FBXW7。重要的是，lncRNA VIMAS1 的過表達(dá)促進(jìn)了HG處理的ARPE-19細(xì)胞的增殖和遷移，并通過miR-497-5p/FBXW7 軸抑制細(xì)胞凋亡，最終影響DR進(jìn)展。然而，本研究仍有一些不足之處，如FBXW7調(diào)控ARPE-19細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的具體通路是什么？未來需要進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)。此外，需要探索lncRNA VIMAS1/miR-497-5p/FBXW7 軸對(duì)DR 新生血管的潛在影響。