常 姣，隋 怡，孫文娟，何韓嬌，胡書苑，童平珍，易 旭，楊武德，龍 毅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

有柄石韋(Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching)為水龍骨科石韋屬植物，功效為利尿通淋、清肺止咳、涼血止血，主要用于治療熱淋、石淋、血淋等癥[1]。最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名石劍箬、金背茶匙、石皮、石蘭、肺心草等[2]。有柄石韋是常用的民族藥之一，苗胞常稱為“銳貓棍”、“黛口掌”(湖南湘西)或“啊咳知”(貴州銅仁)[3-5]，分布地區(qū)主要為貴州、四川、云南、湖南、湖北等地[6-7]。石韋的種源繁多，在眾多品種的石韋中，有柄石韋相較于其他石韋具有成熟的栽培繁殖技術(shù)，自然界中的儲量多，其黃酮類、多酚類、多糖類含量均較豐富，因其化學(xué)成分的多樣性，從而決定其藥理作用的多樣性，石韋的藥理作用為鎮(zhèn)咳祛痰[8]、抗病毒[9]、抗泌尿系統(tǒng)結(jié)石[10-11]等，具有較大的研究價(jià)值。

糖尿病是因?yàn)橐认僦幸葝u素分泌缺陷或胰腺的生物作用受損而造成的一種代謝性疾病，臨床上以高血糖為主要特征[12]。課題組的前期研究[11]表明有柄石韋具有明顯的利尿通淋的作用，而利尿作用實(shí)際上是藥物對水代謝的促進(jìn)作用，課題組推測有柄石韋對糖代謝也可能具有促進(jìn)的作用，而這一推測得到了課題組前期的生物信息學(xué)研究的支持。故課題組計(jì)劃研究有柄石韋降血糖作用及可能的分子機(jī)制。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近些年藥物機(jī)制研究的重要方法，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算、高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析等技術(shù)基礎(chǔ)上，利用了生物信息學(xué)方法，研究多成分-多靶點(diǎn)-多疾病的整合機(jī)制，因而具有整體性和系統(tǒng)性的優(yōu)勢，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方及單味藥的作用機(jī)制研究中[13]。故本試驗(yàn)利用高血糖小鼠模型，考查該藥物對糖尿病小鼠血糖的影響，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)建立了“成分-疾病-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探究其可能機(jī)制與相關(guān)靶點(diǎn)，為該藥物的后期深入研究提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性KM小鼠30只，體質(zhì)量18～22 g，購自重慶騰鑫有限公司，合格證號SCXK(遼)2015-0001，于溫度22～25 ℃、相對濕度50 %～60 %條件下，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥材

黔產(chǎn)有柄石韋(20210414)采集于貴州省貴陽市南明區(qū)仙人洞，并經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室楊燁副教授鑒定為水龍骨科植物有柄石韋的新鮮葉及根。

1.3 藥品與試劑

檸檬酸、檸檬酸鈉(2019022088，20190320)均購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(20200301)購自重慶萬盛川東化工有限公司。

鏈脲佐菌素(STZ)(1015D057)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；鹽酸二甲雙胍片(ABR2313)購自中美上海施貴寶制藥有限公司；水合氯醛水溶液(1125A21)、多聚甲醛溶液(1217A21)均購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；封閉山羊血清(sl038)、蘇木素染液(G1080)均購自北京索萊寶科技有限公司；EDTA抗原修復(fù)液(ZLI-9068)、兔二步法試劑盒(PV-6001)、DAB顯色液(ZLI-9031)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(BJ08089044)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

FA2204B型電子天平(上海天美天平儀器有限公司)；800Y高速多功能粉碎機(jī)(永康市博歐五金制品有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；306A血測儀(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；SHHW21.600AII三用恒溫水箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；DM3000生物顯微鏡(德國徠卡儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1有柄石韋水提物的制備

取干燥有柄石韋粗粉100 g，置于圓底燒瓶中加入2倍量體積的蒸餾水浸泡30 min后，再加8倍量體積的蒸餾水沒過藥材，加熱連續(xù)回流提取3次，每次1.5 h，趁熱濾過，合并3次濾液，蒸發(fā)濃縮至0.5 g/mL，備用。

1.5.2糖尿病小鼠試驗(yàn)

1.5.2.1糖尿病小鼠模型的建立、分組與給藥

SPF級雄性的KM小鼠30只，隨機(jī)選取6只作為正常組，其余小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素進(jìn)行糖尿病模型的復(fù)制[14]，正常對照組腹腔注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。72 h后測定FBG≥11.1mmol/L，視為造模成功。將造模成功后的小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、有柄石韋高、低劑量組(0.5 g/kg、1.0 g/kg)，每組6只。灌胃(i.g)給藥，連續(xù)14 d，其中正常組及模型組灌胃等體積的蒸餾水。

從給藥開始后，每天監(jiān)測小鼠體質(zhì)量、飲食飲水量的變化情況，并分別于造模前，及造模成功給藥后第7天、14天測定血糖，對比給藥前后血糖含量的變化。

小鼠給藥14 d后處死，迅速取出胰腺組織，用生理鹽水洗滌，吸干水分，迅速放入裝有10 %多聚甲醛的離心管中(液體∶組織=10∶1)，備用。

取出小鼠的胰腺組織，用10 %中性多聚甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)過脫水、透明、包埋、切片和封片后，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡鏡檢，圖像采集后分析。

組織切片進(jìn)行脫蠟至水，切片置于pH 8.0的EDTA緩沖液進(jìn)行熱修復(fù)，滴加適量10% H2O2溶液，避光室溫孵育15 min，使用PBS沖洗。滴加5 %～10 %正常羊血清，室溫孵育5 min，PBS沖洗。加入一抗工作液后置于4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS沖洗。滴加辣根過氧化物酶酶標(biāo)二抗(HRP)，在室溫下孵育30 min，PBS沖洗。1 mL DAB緩沖液中滴加1～2滴DAB原液，混勻后滴加到切片上，鏡下觀察染色程度。浸入蒸餾水終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，自來水充分沖洗。1 %酸化乙醇洗脫，自來水充分沖洗。氨水返藍(lán)，自來水充分沖洗。采用70 %乙醇、90 %乙醇、無水乙醇各2 min進(jìn)行梯度脫水干燥，二甲苯透明，風(fēng)干后中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5.3統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料用(x±s，n=6)來表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異。

1.5.4網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.5.4.1數(shù)據(jù)庫

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP數(shù)據(jù)庫https://tcmspw.com/tcmsp.php)；中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID http://47.100.169.139/tcmid/)；Swiss ADME數(shù)據(jù)庫(http://www.swissadme.ch/)；Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)；OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)；Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)；STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)；DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)；微生信數(shù)據(jù)庫(http://www.bioinformatics.com.cn/basic)

運(yùn)用TCMSP、Swiss ADMD數(shù)據(jù)庫以及查閱文獻(xiàn)檢索石韋、有柄石韋、廬山石韋的化學(xué)成分，如三萜類[15-17]、黃酮類[18-20]、有機(jī)酸類[21-23]等，根據(jù)檢索結(jié)果，根據(jù)限制條件口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選，得到有柄石韋的活性成分。采用Swiss Target Prediction和SEA數(shù)據(jù)庫預(yù)測活性成分的作用靶點(diǎn)，將活性成分與預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行整合，刪除重復(fù)項(xiàng)。

在Genecard數(shù)據(jù)中以“diabetes”為關(guān)鍵詞，搜索糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)的基因名，并以相關(guān)性評分大于等于中位數(shù)進(jìn)行多次篩選，然后再與OMIM中搜索關(guān)鍵詞“diabetes”檢索得到的所有糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)的基因名進(jìn)行去重整合，從而得到糖尿病疾病靶點(diǎn)的基因名。

將有柄石韋對應(yīng)的成分及靶點(diǎn)等匯總分類建立網(wǎng)絡(luò)文件與屬性文件，將兩個(gè)文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，以節(jié)點(diǎn)度值的大小進(jìn)行可視化分析。

將藥物成分靶點(diǎn)與糖尿病疾病靶點(diǎn)通過Venny2.1.0將兩者的靶點(diǎn)進(jìn)行繪制韋恩并取交集，整理共同的靶基因。交集靶點(diǎn)分別和有效成分韋恩交集并取交集靶點(diǎn)，最后匯總所有交集靶點(diǎn)信息。導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件中進(jìn)行可視化分析。

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)自己需求進(jìn)行物種類別及閾值設(shè)置，分別為“Homo sapiens”，“medium confidence(0.400)”，以TSV格式導(dǎo)出結(jié)果，Cytoscape3.9.1軟件進(jìn)行可視化分析。

為了了解成分與疾病的交集靶點(diǎn)可能涉及到的信號通路、生物進(jìn)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)等信息，將“1.5.4.5項(xiàng)”下的結(jié)果導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中，以“OFFICILA_GENE_SYMBOL”為標(biāo)識符，以“Homo sapiens”為物種進(jìn)行GO分析和KEGG信號通路富集分析，下載分析文件，按照Pvalue值排序，最終設(shè)定閾值為P<0.05，篩選相關(guān)信息，分析結(jié)果以氣泡圖形式予以展示。

根據(jù)“1.5.4.7”項(xiàng)下的結(jié)果，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，找出通路對應(yīng)靶點(diǎn)，以及靶點(diǎn)對應(yīng)有效成分，將其文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中進(jìn)行可視化分析，根據(jù)度值大小篩選出核心成分及靶點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖尿病小鼠試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1糖尿病小鼠的一般指標(biāo)

與正常對照組相比較，模型組小鼠毛色灰暗，反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)多飲多食多尿的現(xiàn)象，墊料潮濕。給藥14 d后，各給藥組小鼠體重明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，如表1所示。飲食飲水量變化不明顯，差異不具有顯著性差異(P>0.05)，如表2所示，說明有柄石韋能夠使糖尿病小鼠體質(zhì)量逐漸增加，但短時(shí)間內(nèi)不能有效改善糖尿病小鼠飲食飲水量。

表1 糖尿病小鼠體質(zhì)量Tab.1 Results of body weight(food intake and water intake of diabetic mice)

2.1.2糖尿病小鼠FBG的影響

由表3結(jié)果可知，模型組小鼠的FBG值較正常組小鼠的FBG值明顯升高(P<0.05)；給藥7 d，模型組小鼠的血糖顯著升高，各給藥組之間無顯著性差異。給藥14 d后，與模型組比較，各給藥組小鼠的FBG降低，差異具有極顯著性差異(P<0.01)，說明有柄石韋水提物能有效降低糖尿病小鼠FBG，見圖1。

表3 糖尿病小鼠給藥后FBG結(jié)果Tab.3 Results of FBG in diabetic mice after administration

圖1 糖尿病小鼠給藥第二周FBG結(jié)果柱狀圖Fig.1 Histogram of FBG results in diabetic mice at the second

2.1.3糖尿病小鼠胰腺組織HE染色病理切片觀察

結(jié)果如圖2，和正常組相比較，模型組小鼠的胰島β細(xì)胞核皺縮，排列不規(guī)則，邊界不明顯；與模型組小鼠相比較，給藥組小鼠的胰島β細(xì)胞明顯改善，細(xì)胞形態(tài)較完整，細(xì)胞邊緣較清晰。結(jié)果表明，有柄石韋可以改善糖尿病小鼠胰腺組織的病理損傷，且高劑量組小鼠胰腺改善更明顯。

注：a、b、c、d、e分別為正常組、模型組、二甲雙胍組、有柄石韋低劑量組、有柄石韋高劑量組。圖2 糖尿病小鼠胰胰腺組織HE染色觀察結(jié)果(40X)Fig.2 HE staining of pancreatic tissue in diabetic mice(40X)

2.1.4糖尿病小鼠胰腺組織免疫組化胰島素的表達(dá)

模型組小鼠的胰島細(xì)胞數(shù)目較正常組明顯減少，其結(jié)果與HE染色的結(jié)果一致，此外，還可以觀察到胰島內(nèi)胰島素的表達(dá)明顯減少；與模型組比較，給藥后，胰島內(nèi)胰島素的表達(dá)有不同程度的增加(圖3)。

注：a、b、c、d、e分別為正常組、模型組、二甲雙胍組、有柄石韋低劑量組、有柄石韋高劑量組。圖3 糖尿病小鼠胰腺組織免疫組化觀察(40X)Fig.3 Immunohistochemical observation of pancreatic tissue in diabetic mice (40 X)

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.2.1有柄石韋有效成分及靶點(diǎn)篩選

通過查閱文獻(xiàn)，以及在數(shù)據(jù)庫TCMSP與Swiss ADME中，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，最后篩選出有柄石韋中的9種成分β-谷甾醇、芒果苷、山奈酚、奎寧酸、圣草酚等納入后續(xù)研究(表4)，并采用Swiss Target Prediction 和SEA數(shù)據(jù)庫預(yù)測活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，將活性成分與預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行整合，刪除重復(fù)值后得到321個(gè)成分靶點(diǎn)。

表4 有柄石韋主要有效成分Tab.4 Main active components of P.petiolosa

2.2.2糖尿病靶點(diǎn)篩選

以“糖尿病”為關(guān)鍵詞在Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫挖掘出所有相關(guān)靶點(diǎn)，并下載數(shù)據(jù)，根據(jù)中位數(shù)進(jìn)行多次篩選后得到1687個(gè)靶點(diǎn)，成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集后，共有82個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.2.3靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將上述檢索到的藥物有效成分及對應(yīng)的靶點(diǎn)構(gòu)建有柄石韋藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，由330個(gè)節(jié)點(diǎn)和589條邊組成結(jié)果，如圖4所示。再將交集靶點(diǎn)分別與9個(gè)有效成分靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到162個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)后得到82個(gè)靶點(diǎn)。使用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建疾病-成分-靶點(diǎn)圖，該網(wǎng)絡(luò)由92個(gè)節(jié)點(diǎn)，171條邊組成，按照度值進(jìn)行排序，前三位為山奈酚(度值=30)、奎寧酸(度值=29)、圣草酚(度值=28)，網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)成分都對應(yīng)2個(gè)及以上靶點(diǎn)，說明中藥有柄石韋在治療糖尿病時(shí)，是以多成分、多靶點(diǎn)的共同作用來實(shí)現(xiàn)的(圖5)。

2.2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.1數(shù)據(jù)庫構(gòu)建初始PPI網(wǎng)絡(luò)(a)，導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件進(jìn)行優(yōu)化優(yōu)化后的網(wǎng)絡(luò)由82個(gè)節(jié)點(diǎn)，745條邊組成。選取度值大于30的15個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)一步優(yōu)化，其網(wǎng)絡(luò)圖由15個(gè)節(jié)點(diǎn)，94條邊組成，分別為：AKT1、HIF1A、PPARG、FGF2、PTGS2、GSK3、SRC、EGFR、MTOR、ESR1、PIK3R1、PTPN11、MMP9、MAPK3、VEGFA(圖6)，這些靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)度密切，可能在治療糖尿病占據(jù)重要地位，為治療糖尿病的核心靶點(diǎn)。

注：a、b、c分別表示初始PPI網(wǎng)絡(luò)圖、優(yōu)化PPI網(wǎng)絡(luò)圖、核心子網(wǎng)絡(luò)圖。圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 PPI network diagram

2.2.5KEGG信號通路分析和GO富集分析

將在DAVID數(shù)據(jù)庫中分析得到的數(shù)據(jù)先按P-value值大小排序再以閾值為P<0.005篩選并在微生信中作圖，如圖7所示。KEGG富集分析共有93條信號通路滿足要求，再根據(jù)count值選取前20條進(jìn)行作圖，結(jié)果主要涉及到癌癥中的途徑、阿爾茲海默癥、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等信號通路(a)，前20條通路相關(guān)信息見表7；BP結(jié)果共有76個(gè)條目，主要涉及到RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)運(yùn)的負(fù)調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK級聯(lián)途徑等生物學(xué)過程；CC結(jié)果共有10個(gè)條目，主要與質(zhì)膜胞質(zhì)側(cè)的外部成分、分泌顆粒腔、富含ficolin-1的顆粒腔、晚期胞內(nèi)體等細(xì)胞組分有關(guān)；MF結(jié)果共有31個(gè)條目，主要涉及到DNA結(jié)合、鋅離子結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、ATP結(jié)合等分子功能。GO結(jié)果均取前10個(gè)條目作圖(b)。

圖7 KEGG(Top 20)和GO(Top 10)富集圖Fig.7 enrichment diagram of KEGG(Top 20) and GO(Top 10)

表5 前20條核心靶點(diǎn)富集分析結(jié)果Tab.5 Enrichment analysis results of the first 20 core targets

2.2.6藥物靶點(diǎn)-通路-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)“2.2.5”項(xiàng)的結(jié)果篩選出前20條通路所對應(yīng)的靶點(diǎn)、靶點(diǎn)對應(yīng)的有效成分，結(jié)果如圖8所示。以介度、緊密度以及度值的大小進(jìn)一步分析出有柄石韋治療糖尿病的主要成分及核心靶點(diǎn)。結(jié)果顯示主要成分是奎寧酸quercetin、山奈酚kaempferol、圣草酚eriodictyol、去氫二異丁香酚dehydrodiisoeugenol(表6)。核心靶點(diǎn)前15個(gè)為：AKT1、MAPK3、PIK3R1、MAP2K1、EGFR、RAF1、MTOR、VEGFA、IGF1R、MET、BRAF、SRC、GSK3B、FGF2、ESR1。與PPI網(wǎng)絡(luò)的前15個(gè)核心靶點(diǎn)對比，有9個(gè)共同靶點(diǎn)(AKT1、FGF2、SRC、EGFR、MTOR、ESR1、PIK3R1、MAPK3、VEGFA)。

圖8 藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Drug-target-pathway-disease network

表6 有效成分網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)Tab.6 Active ingredient network topology parameters

3 結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有柄石韋水提物能有效降低STZ所致糖尿病小鼠的FBG，對胰島細(xì)胞具有保護(hù)與修護(hù)作用，并能在一定程度上促進(jìn)胰島素的分泌。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中KEGG富集通路結(jié)果顯示有柄石韋治療糖尿病的過程可能與癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等有關(guān)，且與AKT1、FGF2、SRC、EGFR、MTOR、ESR1、PIK3R1、MAPK3、VEGFA靶點(diǎn)密切相關(guān)。PI3K-Akt信號通路與許多重要的生命活動比如細(xì)胞的生長、凋亡等密切相關(guān)[24]。遲毓婧等[25]的研究中發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號通路是胰島素調(diào)控血糖平衡的關(guān)鍵通路之一。研究顯示，PI3K-Akt信號通路與胰島素抵抗(IR)相關(guān)疾病的關(guān)系密切，胰島素以及其他相關(guān)因素的刺激會導(dǎo)致PI3K和Akt的上調(diào)，均可啟動整個(gè)PI3K-Akt信號通路的傳導(dǎo)[26，27]。而AKT1蛋白參與多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞的增殖、生長、胰島素信號傳導(dǎo)等方面密切相關(guān)[28]，且它激活依賴PI3K途徑，試驗(yàn)結(jié)果也顯示了有柄石韋對胰島β細(xì)胞具有增殖、修復(fù)作用，故推測靶點(diǎn)AKT1可能是有柄石韋治療糖尿病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，從而使有柄石韋對胰島β細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)來達(dá)到降血糖的目的。