劉 麗，左艷麗，李占濤，蔣敏之，王曉麗，周 斌，張佳雪，何生存

失眠癥是臨床上最為常見(jiàn)的一種睡眠障礙，成人發(fā)病率高達(dá)10%～15%，其中有半數(shù)以上失眠患者病程可長(zhǎng)達(dá)10年以上[1]。失眠會(huì)嚴(yán)重?fù)p害患者的身心健康，對(duì)其正常的工作和生活會(huì)有不良影響[2-3]。在失眠患者中，肝郁型失眠占很大比例，疏肝安神法成為治療失眠的常用方法[4-5]。寧神安臟飲是賈孟輝教授臨床治療失眠癥的經(jīng)驗(yàn)方，該藥方由柴胡、黃芩、黃連、酸棗仁、郁金等14味中藥構(gòu)成，具有寧神清心，調(diào)和肝脾之功效，在臨床上運(yùn)用多年，且療效顯著。近年來(lái)有研究表明，寧神安臟飲對(duì)頑固性失眠患者有延長(zhǎng)患者睡眠時(shí)間，提高睡眠質(zhì)量的作用[6]。但目前對(duì)于此方治療失眠癥的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究采用多因素復(fù)合法制備肝郁脾虛型失眠模型，通過(guò)觀察寧神安臟飲對(duì)模型大鼠行為學(xué)和下丘腦γ-氨基丁酸(GABA)及谷氨酸(GLU)含量的變化，探討寧神安臟飲對(duì)肝郁脾虛型失眠的改善作用及機(jī)制，以期為中醫(yī)藥防治失眠提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：80只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量180～210 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(寧)2020-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，室溫(26±1)℃，濕度(50±10)%，可自由飲水?dāng)z食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組、模型組、艾司唑侖組、寧神安臟飲組共4組，每組20只。

1.2 藥物：寧神安臟飲。組成及用量為(按成人60 kg體質(zhì)量計(jì)算)柴胡15 g、黃芩9 g、黃連9 g、生龍骨25 g、生牡蠣25 g、黨參15 g、茯神15 g、磁石30 g、白芍15 g、白術(shù)15 g、醋香附15 g、當(dāng)歸15 g、郁金10 g、夜交藤30 g、炒酸棗仁30 g，諸藥均先經(jīng)蒸餾水浸泡40 min，生龍骨、生牡蠣、磁石先煎1 h，后納入其余諸藥，煎煮兩次(45 min/次)，期間將兩次藥液紗布過(guò)濾，合并，水浴加熱濃縮至含生藥量為2.28 g/mL濃度的藥液，貯存于4 ℃冰箱內(nèi)備用，臨用前置于20 ℃環(huán)境下預(yù)熱，以上藥物均由寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供并鑒定，符合《中華人民共和國(guó)藥典(一部)》[7]標(biāo)準(zhǔn)。艾司唑侖片(生產(chǎn)批號(hào)2360712，山東信誼制藥有限公司，1 mg/片)。

1.3 失眠大鼠模型的建立和給藥：采用大鼠夾尾刺激+飲食失聯(lián)+PCPA腹腔注射復(fù)合因素造模法[8-12]，器械刺激，分別用止血鉗輕夾大鼠尾部，致使大鼠激惹相互打斗，45 min/d，打斗以不破皮流血為宜，同時(shí)隔日喂食(隔日禁食，隔日足量給食)，持續(xù)20 d，于造模第16天起，對(duì)模型組及各給藥組的大鼠給予對(duì)氯苯丙氨酸(D-4-Chlorophenylalanine，PCPA)(Sigma，美國(guó))，PCPA按300 mg/kg溶于弱堿性生理鹽水中，配置成混懸液，以10 mL/(kg·d)腹腔注射，連續(xù)2 d，大鼠晝夜活動(dòng)不停，睡眠減少直至消失，神疲乏力、納少便溏表示造模成功。正常組以生理鹽水替代PCPA進(jìn)行腹腔注射。如果大鼠白天夜晚活動(dòng)不停，而對(duì)照組晝夜節(jié)律正常，表明模型復(fù)制成功。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后灌胃給藥，根據(jù)人和動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量，寧神安臟飲組大鼠按每次2.28 g/kg給藥，艾司唑侖組大鼠每次按劑量0.18 mg/kg給藥，均每日2次，連續(xù)給藥7 d；正常組及模型組給予等體積生理鹽水灌胃[13-14]。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 一般狀態(tài)：于實(shí)驗(yàn)第0、7、14、21天觀察大鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)、睡眠、皮毛光澤度、飲食飲水量、體重變化及對(duì)外界刺激的反應(yīng)等。

1.4.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性糖水訓(xùn)練。各組大鼠實(shí)驗(yàn)前禁水24 h，第21天上午9：00在鼠籠中放置外觀一致、體積相同的水瓶，1瓶純凈水，1瓶2%蔗糖水溶液(先檢查飲水瓶是否滴水)。1 h后測(cè)量各組大鼠的水消耗量，糖水偏好率(%)=糖水消耗量(mL)/糖水消耗量+純凈水消耗量(mL)×100%。

1.4.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):自制場(chǎng)地規(guī)格為長(zhǎng)×寬×高=120 cm×90 cm×50 cm的曠場(chǎng)反應(yīng)箱，箱底及四周均為黑色不能透光，在安靜、光強(qiáng)度溫和的房間內(nèi)，連續(xù)給藥7 d 后，將各組大鼠分別緩慢放入曠場(chǎng)反應(yīng)箱中央，使用鼠博士分析系統(tǒng)分析各組大鼠5 min內(nèi)的總活動(dòng)距離、中央格停留時(shí)間、直立次數(shù)、修飾次數(shù)。每只大鼠測(cè)試完畢后，及時(shí)清理曠場(chǎng)箱底和側(cè)壁的排泄物以防止前面大鼠殘留的氣味及排泄物干擾后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):水迷宮為直徑×高=170 cm×50 cm圓形水池，池內(nèi)水溫控制在24 ℃左右，內(nèi)設(shè)直徑×高=10 cm×25 cm逃逸平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持環(huán)境安靜，連續(xù)給藥7 d后，將各組大鼠面壁以第二象限標(biāo)記處固定位置逐一放入水中，每日進(jìn)行游泳訓(xùn)練1 min內(nèi)找到逃逸平臺(tái)，訓(xùn)練成功后，在造模前后連續(xù)測(cè)試3 d，第4天撤除逃逸平臺(tái)正式測(cè)試，記錄1 min內(nèi)大鼠從水面自由爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期，并且記錄大鼠的錯(cuò)誤次數(shù)。每只大鼠測(cè)試完畢后，及時(shí)清理排泄物以防止前面大鼠殘留的氣味及排泄物干擾后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.5 透射電鏡觀察大腦下丘腦:連續(xù)給藥7 d，最后一次給藥第7 d前禁食12 h，觀察給藥后各組大鼠的自主活動(dòng)，于灌胃后60 min用10%水合氯醛按0.3 g/kg劑量進(jìn)行腹腔注射后，在冰上迅速取出各組大鼠的下丘腦組織，常規(guī)透射電鏡樣品制備(鋨酸固定2 h，0.1 mmol PBS漂洗，50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐級(jí)脫水，純丙酮置換，Epon812包埋，60 ℃聚合48 h，超薄切片經(jīng)鈾-鉛雙染)，使用透射電鏡觀察下丘腦組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.6 免疫組化染色:取含下丘腦的組織塊進(jìn)行石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，用胰酶修復(fù)液(37 ℃)修復(fù)20 min，0.01M PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；用3%過(guò)氧化氫(消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶)，室溫(20 ℃)處理10 min，0.01M PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；0.3%Triton×100室溫(20 ℃)孵育10 min，0.01M PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；將載玻片放入濕盒，滴加正常山羊血清封閉液，室溫(20 ℃)放置30 min，1 h，不洗；傾去血清，按1∶50滴加γ-氨基丁酸(GABA)多克隆抗體(批號(hào)：KGP22222，購(gòu)自中國(guó)南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，4 ℃孵育過(guò)夜后，0.01MPBS緩沖液洗滌3次/5 min(用振蕩器搖晃清洗)；滴加兔抗大鼠IgG(批號(hào)KGAA35，購(gòu)自中國(guó)南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，室溫(20 ℃)孵育30 min，0.01MPBS緩沖液洗滌3次/ 5 min；滴加SABC，室溫(20 ℃)孵育30 min，0.01MPBS緩沖液洗滌3次。室溫下用新鮮配制的DAB顯色液顯色5～10 min，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，以GABA陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕黃色、背景為淡黃色為度，自來(lái)水充分水洗，蒸餾水洗5～10 s，蘇木素復(fù)染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性塑膠封片后顯微鏡觀察各組大鼠下丘腦組織切片，每組隨機(jī)取3張切片，每張切片在400倍視野下隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)視野，圖像輸入計(jì)算機(jī)，采用彩色圖像分析系統(tǒng)，分別計(jì)GABA染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)。檢測(cè)谷氨酸(GLU)的步驟同上(GLU多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠模型一般狀態(tài)的影響：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前各組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏、毛色有光澤。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組大鼠的精神狀態(tài)良，反應(yīng)迅速，毛色有光澤，進(jìn)食進(jìn)水正常，二便正常。模型組大鼠精神狀態(tài)差，毛色干枯無(wú)光澤，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食進(jìn)水不積極，活動(dòng)明顯減少，喜倚靠鼠籠角落，甚至小便失禁，大便稀薄不成形，形體瘦弱，表現(xiàn)出“肝郁脾虛證”的特點(diǎn)；寧神安臟飲組和艾司唑侖組在精神狀態(tài)、毛發(fā)、體重、飲食飲水、二便等方面均較模型組有改善，表現(xiàn)為精神狀態(tài)較好，反應(yīng)尚可，毛發(fā)整潔，進(jìn)食進(jìn)水較正常，大便可成形等。

2.2 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠模型不同時(shí)間體重的影響：與正常組大鼠體重相比，模型組和寧神安臟飲組、艾司唑侖組大鼠在造模1周后，體重增長(zhǎng)緩慢(P<0.05)。與同時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠體重相比，寧神安臟飲組和艾司唑侖組大鼠在造模2周、給藥1周后，體重相對(duì)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與同時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠體重相比，寧神安臟飲組和艾司唑侖組大鼠在造模3周、給藥2周后，體重明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠模型不同時(shí)間體重的影響

2.3 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠模型糖水偏好率的影響：與正常組影響，模型組大鼠糖水消耗量和糖水偏好率均降低(P<0.05)；與模型組比較，寧神安臟飲組、艾司唑侖組大鼠的糖水消耗量和糖水偏好率均增加(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠模型糖水偏好率的影響

2.4 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠模型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響：與正常組比較，模型組的總活動(dòng)距離、中央格停留時(shí)間、直立次數(shù)、修飾次數(shù)均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，寧神安臟飲組、艾司唑侖組的總活動(dòng)距離、中央格停留時(shí)間、直立次數(shù)、修飾次數(shù)均增加(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠模型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

2.5 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響：與正常組比較，模型組的平均逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P<0.05) ；與模型組比較，寧神安臟飲組和艾司唑侖組能明顯縮短逃避潛伏期(P<0.05)，減少錯(cuò)誤次數(shù)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

2.6 寧神安臟飲對(duì)失眠各組大鼠模型腦組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響：正常組腦細(xì)胞形狀規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，呈圓形或棒槌形，內(nèi)嵴排列整齊、清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)散在分布，表面有密集的核糖體附著，胞核形狀規(guī)則，核膜完整，核孔清晰可見(jiàn)，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好。模型組腦細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫，部分結(jié)構(gòu)破壞，染色質(zhì)濃集、邊聚、胞漿濃縮。寧神安臟飲組腦細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，水腫明顯減輕，偶見(jiàn)局部膜崩解。艾司唑侖組腦細(xì)胞細(xì)胞核稍有固縮，基質(zhì)固密，無(wú)空泡，見(jiàn)圖1(目錄后)。

2.7 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠模型下丘腦GABA及GLU表達(dá)的影響：顯微鏡下胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。與正常組比較，模型組的GABA及GLU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，寧神安臟飲組和艾司唑侖組的GABA及GLU的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表5，圖2至圖3(目錄后)。

表5 寧神安臟飲對(duì)失眠大鼠模型下丘腦GABA及GLU表達(dá)的影響

3 討論

寧神安臟飲全方共奏輕清與重降并用、溫涼與補(bǔ)瀉兼施之義。有研究表明頑固性失眠多為氣郁體質(zhì)，而氣郁日久易化火傷肝體、耗肝血。脾氣實(shí)則五臟安和、神智寧謐[15]。思慮過(guò)度則損傷脾胃，且胃不和則臥不安，故治療頑固性失眠在寧神清心的基礎(chǔ)上，兼顧調(diào)和肝脾。組方中柴胡味苦微寒，為半表半里和解之藥，能升發(fā)肝膽之氣，肝膽在調(diào)節(jié)人體陰陽(yáng)氣血的正常運(yùn)轉(zhuǎn)中起到軸樞的作用[16]，可樞轉(zhuǎn)氣機(jī)，疏肝解郁，使清氣上行，陰氣下降；黃芩藥性苦寒，能清中、上二焦之郁火，和解樞機(jī)不利之郁熱。柴胡與黃芩相配，一清一散，一升一降，以清散郁火、清心寧神；黃連味苦微寒，主降心火，與黃芩相配，能清上、中、下三焦之郁火；生龍骨、生牡蠣、磁石為重鎮(zhèn)安神藥，可引陽(yáng)破陰，使陰陽(yáng)相交，神明安矣；半夏辛溫，與黃芩相配可辛開(kāi)苦降，調(diào)達(dá)中焦氣機(jī)；黨參性味甘平，有補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄之功[6]；白術(shù)味甘味苦，可健脾益氣；酌加生地、當(dāng)歸養(yǎng)血安神，炒酸棗仁、郁金、夜交藤解郁安神，全方共奏寧神清心、調(diào)和肝脾之效。

正常大鼠經(jīng)夾尾刺激+飲食失聯(lián)+PCPA多因素干預(yù)后，正常的睡眠-覺(jué)醒周期遭到破壞，出現(xiàn)焦慮、煩躁等不良情緒，這與以往實(shí)驗(yàn)研究失眠大鼠建模結(jié)果一致[17]。模型組的大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)差，反應(yīng)遲鈍，喜倚靠鼠籠角落，活動(dòng)減少，毛色干枯無(wú)光澤，進(jìn)食進(jìn)水不積極，體重增加緩慢，甚至小便失禁，大便稀薄不成形，加之飲食不節(jié)，脾胃失調(diào)，表現(xiàn)出肝郁脾虛證的特點(diǎn)。研究表明，寧神安臟飲能夠改善失眠癥大鼠的精神狀態(tài)及睡眠時(shí)間，增加失眠癥大鼠的體重及糖水消耗量。

此外，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是研究大鼠情緒反應(yīng)的常用方法，可反應(yīng)動(dòng)物探索學(xué)習(xí)、恐懼警覺(jué)等行為特征，其中總活動(dòng)距離反映大鼠的探究能力和興奮性，中央格停留時(shí)間反應(yīng)大鼠的趨避性、焦慮或抑郁心理以及認(rèn)知功能狀態(tài)，直立次數(shù)和修飾次數(shù)反映大鼠的空間認(rèn)知和警覺(jué)性[18-20]。與模型組比較，寧神安臟飲組大鼠的總活動(dòng)距離、中央格停留時(shí)間、直立次數(shù)、修飾次數(shù)均增高，故推斷出寧神安臟飲可改善失眠癥大鼠自主探究行為、精神意志運(yùn)動(dòng)遲鈍等行為學(xué)表現(xiàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)是測(cè)試空間學(xué)習(xí)和記憶的常用方法[21]，與模型組比較，寧神安臟飲組能明顯縮短模型組大鼠的逃避潛伏期，減少錯(cuò)誤次數(shù)，故推斷寧神安臟飲可提高失眠癥大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究通過(guò)透射電鏡觀察到寧神安臟飲能夠改善失眠癥大鼠下丘腦組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)。下丘腦是公認(rèn)的“覺(jué)醒中樞”和“睡眠中樞”，多種神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(GLU)等通過(guò)中樞對(duì)睡眠發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[22]。其中，GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[23]，GABA在大腦組織中的含量與睡眠-覺(jué)醒的深度呈正相關(guān)[24]；實(shí)驗(yàn)表明，與正常組比較，模型組較正常組GABA和GLU的含量降低(P<0.05)；與模型組比較，寧神安臟飲組GABA和GLU的含量均相對(duì)升高(P<0.05)，提示寧神安臟飲對(duì)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)氨基酸類(lèi)遞質(zhì)含量的調(diào)解作用顯著，并可以改善失眠狀況。

綜上所述，寧神安臟飲可明顯改善肝郁脾虛型大鼠的行為學(xué)，激發(fā)大鼠自發(fā)活動(dòng)能力和探究能力，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)失眠大鼠下丘腦GABA和GLU的含量，進(jìn)而平衡中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能有關(guān)。本研究為臨床推廣使用寧神安臟飲治療失眠提供了參考。