房心荷，朱德軍，鄒文青，朱金燕

Leber先天性黑矇(LCA)是一種嚴(yán)重致盲性遺傳性視網(wǎng)膜疾病，遺傳性視網(wǎng)膜疾病中Leber先天性黑矇占比5%，是導(dǎo)致兒童先天性早發(fā)性盲的首要疾病[1]。Leber先天性黑矇多表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，臨床表現(xiàn)分為嬰兒型和少年型，主要以眼球震顫、固視障礙、指壓癥陽(yáng)性為特征，ERG表現(xiàn)為明視暗視中重度降低甚至呈熄滅型，具有診斷意義[2]，部分患者可伴有小眼球、圓錐角膜、身體智力發(fā)育遲緩等綜合征表現(xiàn)。本病為單基因遺傳眼病，近年來(lái)相繼發(fā)現(xiàn)了20余個(gè)致病基因可導(dǎo)致Leber先天性黑矇發(fā)病[3]，各種視網(wǎng)膜功能相關(guān)基因突變引起蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能異常而導(dǎo)致視功能嚴(yán)重喪失[4]。國(guó)際罕見(jiàn)病研究聯(lián)盟(IRDiRC)在其愿景中指出，到2020年，所有遺傳疾病患者都應(yīng)得到分子診斷[5]。本研究對(duì)1個(gè)近親結(jié)婚L(zhǎng)eber先天性黑矇家系先證者及家庭成員進(jìn)行基因檢測(cè)，旨在明確分子診斷，綜合分析臨床表型與基因型，提高臨床診斷和基因診斷水平，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集在寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院眼科就診的近親結(jié)婚L(zhǎng)eber先天性黑矇家系共4人(1個(gè)先證者及其正常父母、姐姐)作為研究對(duì)象。先證者及其家庭成員均行裸眼視力、最佳矯正視力、裂隙燈顯微鏡、裂隙燈下前置鏡、眼壓、彩色眼底照相、視野、光相干斷層掃描(OCT)以及全視野視網(wǎng)膜電圖(ERG)和熒光素眼底血管造影(FFA)檢查。記錄先證者及其家庭成員家族史、婚育史以及全身疾病史，繪制家系圖。本研究所涉內(nèi)容遵照赫爾辛基宣言，被納入研究的未成年患兒監(jiān)護(hù)人均被告知研究目的及內(nèi)容，簽署由寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)準(zhǔn)許制定的知情同意書(shū)(2016018)。

1.2 Leber先天性黑矇臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]：①6月齡以下視力嚴(yán)重?fù)p害或盲、伴有固視障礙、眼球震顫或指壓眼球等癥狀的患兒；②視網(wǎng)膜電圖示a、b 波嚴(yán)重降低，甚至呈熄滅型；③視網(wǎng)膜彌漫色素顆粒沉積，呈骨細(xì)胞樣或椒鹽樣改變。

1.3 方法

1.3.1 全基因組外顯子測(cè)序：采集Leber先天性黑矇患者及其家庭成員外周抗凝血6mL，利用Qiamp DNA Blood MiniKit(NO.51106)試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取基因組DNA。行全基因組外顯子捕獲(Agilent SureSelect外顯子捕獲試劑盒)，采用高通量測(cè)序儀 (Illumina)測(cè)序且深度達(dá)到100×。原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Illumina basecalling Software 1.7分析軟件處理后與NCBI人類基因組DNA參照序列(NCBI build 37.1)進(jìn)行比對(duì)。采用SOAP軟件(http://soap.genomics.org.cn)分析單核苷酸變異(SNV) 相關(guān)信息，采用BWA軟件 (http:// bio-bwa.sourceforge.net/)分析插入和缺失變異(Indel)相關(guān)信息，獲得全部變異位點(diǎn)。濾除數(shù)據(jù)庫(kù)(db135)常見(jiàn)變異(MAF>1%)及對(duì)蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)無(wú)影響的變異。經(jīng)過(guò)逐步過(guò)濾，篩選出家系內(nèi)所有先證者共享的變異數(shù)，再過(guò)濾家系無(wú)患病親屬存在的變異，獲得候選致病基因變異。利用Sanger測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證得到致病性突變位點(diǎn)，確保在正常家系成員中呈現(xiàn)共分離。

1.3.2 基因變異致病性分析：利用HGMD(human gene mutation database)、dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)等數(shù)據(jù)庫(kù)工具對(duì)目標(biāo)突變位點(diǎn)進(jìn)行查詢，在HGMD中查看是否為已報(bào)道致病突變，是否已被收錄。如果是未報(bào)道過(guò)的新變異，依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì) (ACMG) 2015年發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對(duì)新發(fā)變異進(jìn)行基因變異致病性評(píng)估。將變異位點(diǎn)放至正常人數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行過(guò)濾篩選，包括正常人群頻率1000 Genomes (http://browser.1000genomes.org)及ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)。在Poly Phen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)、MutationTaster (http://www.mutationtaster.org)等網(wǎng)站上預(yù)測(cè)變異位點(diǎn)對(duì)蛋白功能的影響。運(yùn)用GERP++ (https://bio.tools/gerp)等網(wǎng)站衡量進(jìn)化中跨物種基因序列的保守情況。PolyPhen2預(yù)測(cè)軟件對(duì)突變位點(diǎn)預(yù)測(cè)值范圍為0～1，分值越高越有害。Mutation Taster預(yù)測(cè)軟件對(duì)突變位點(diǎn)預(yù)測(cè)值范圍為0～1，分值越高越有害。氨基酸序列保守性GERP++預(yù)測(cè)值范圍大于2表示比較保守，GERP分?jǐn)?shù)高意味著序列高度保守，因此改變是有害的。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征分析：患者，男，11歲，出生后即出現(xiàn)雙眼球輕度震顫，視力低下。色覺(jué)檢查為全色盲。裸眼視力右眼0.25、左眼0.12，1%阿托品散瞳驗(yàn)光右眼-1.50DS/-0.50DC×150°：0.25，左眼-1.00DS/-1.50DC×175°：0.12，即雙眼矯正視力不提高。雙眼前節(jié)未見(jiàn)異常。雙眼視盤色淡、邊界清，血管纖細(xì)，視網(wǎng)膜內(nèi)未見(jiàn)明顯色素沉積。雙眼黃斑OCT示黃斑形態(tài)正常，層系間分明、清晰可辨。眼底自發(fā)熒光未見(jiàn)明顯異常。進(jìn)行ERG檢查，暗適應(yīng)0.01ERG：b波重度下降；暗適應(yīng)3.0ERG：a、b波均呈熄滅型；暗適應(yīng)3.0震蕩電位：右眼重度下降，左眼中度下降。明適應(yīng)3.0ERG，a波：右眼呈熄滅型，左眼重度下降；b波：右眼呈熄滅型，左眼重度下降；明適應(yīng)3.0閃光ERG:呈熄滅型。先證者父母為近親結(jié)婚，其父母裸眼視力均達(dá)1.0及以上，雙眼前節(jié)及眼底檢查未見(jiàn)異常，全視網(wǎng)膜電流圖正常。

2.2 全基因組外顯子測(cè)序結(jié)果:利用全基因組外顯子測(cè)序及PCR驗(yàn)證，先證者為TULP1基因的純合錯(cuò)義突變c.C1024G(p.R342G)。表型正常的父親、母親及姐姐均攜帶一個(gè)c.C1024G雜合突變，提示基因型和表型共分離,符合常染色體隱性遺傳方式。

2.3 生物信息學(xué)分析：基因檢測(cè)在先證者TULP1基因第11號(hào)外顯子檢測(cè)到純和錯(cuò)義突變c.C1024G(p.R342G)，編碼區(qū)第1024位的核苷酸C(胞嘧啶)變異為G(鳥(niǎo)嘌呤)，變異導(dǎo)致編碼蛋白序列內(nèi)的氨基酸改變p.R342G，第342號(hào)氨基酸由精氨酸(Arg)變異為甘氨酸(Gly)。該變異此前在文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道，在1000基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(1000 Genomes Database)和東亞人口數(shù)據(jù)庫(kù)(ExAC_EAS)的搜索結(jié)果顯示，這個(gè)變異的突變頻率均為0(PM2_Supporting)，是新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)。通過(guò)預(yù)測(cè)軟件分析變異對(duì)蛋白功能的影響，PolyPhen2 評(píng)分為0.9571，表明為有害，MutationTaster 評(píng)分為D，表明為有害，見(jiàn)表1。保守性分析發(fā)現(xiàn)TULP1基因第342位精氨酸，在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守。根據(jù)中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)遺傳咨詢分會(huì)《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)中文版專家共識(shí)指南》，錯(cuò)義突變?cè)u(píng)為PVS1，數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)該變異評(píng)為PM2，符合家系共分離評(píng)為PP1，該突變總致病性評(píng)分均為PVS1+PM2+PP1，為致病性變異。

表1 不同軟件分析TULP1變異對(duì)其蛋白功能的影響

3 討論

Leber先天性黑矇是嚴(yán)重危害兒童視網(wǎng)膜疾病，可導(dǎo)致部分患兒失明，其發(fā)病率為1∶81 000～1∶30 000[8]，患兒多于出生時(shí)或6月齡內(nèi)即出現(xiàn)視力低下、無(wú)固視、眼球震顫、指壓征、眼球內(nèi)陷等。指壓征為用手指多次用力按壓眼球，可能與此動(dòng)作產(chǎn)生的閃光感及幻視使患兒得到較多光刺激有關(guān)，具體的分子機(jī)制尚不明確。這種動(dòng)作持續(xù)按壓眼球，導(dǎo)致眶周脂肪萎縮并眼窩凹陷。眼底表現(xiàn)既可完全正常，也可表現(xiàn)為黃斑牛眼樣外觀、后極部灰白色斑點(diǎn)改變等，部分病例直到病變晚期仍保持正常眼底外觀[9]。ERG表現(xiàn)為熄滅型或者明視暗視反應(yīng)重度下降，具有診斷意義。Leber先天性黑矇臨床表現(xiàn)復(fù)雜，癥狀及體征特異性不強(qiáng)，其他綜合征或非綜合征眼病也可有相似表現(xiàn)，臨床上容易誤診為全色盲、不完全色盲、先天性靜止性夜盲、白化病和視神經(jīng)發(fā)育不全等[10]。Leber先天性黑矇多表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，也有顯性遺傳及X連鎖性遺傳報(bào)道。Leber先天性黑矇具備臨床表型多樣性及遺傳異質(zhì)性的特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為不同的等位基因或者基因突變可引起相似的臨床表現(xiàn)，但有些相同的基因突變，發(fā)生在不同家系或不同位點(diǎn)時(shí)可有不同的臨床表現(xiàn)[11]。

目前，有20余個(gè)與Leber先天性黑矇相關(guān)的致病基因被公布，分別涉及視網(wǎng)膜內(nèi)維生素 A 的代謝循環(huán)、光感受器纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程、視網(wǎng)膜光電信號(hào)的傳導(dǎo)過(guò)程、視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的分化和發(fā)育以及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和分布等[12]。遺傳類疾病的致病基因在不同人種及地域存在很大差別，Eisenberger T[13]等對(duì)歐洲人群中部分Leber先天性黑矇患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TULP1基因突變可致10.7%患者發(fā)病。亞洲人群中TULP1基因突變導(dǎo)致Leber先天性黑矇報(bào)道較少，Li等[14]對(duì)87位中國(guó)患者基因篩查結(jié)果顯示排名前五位的分別為GUCY2D、CRB1、RPGRIPI、RPE65、SPATA7。2016年盛迅?jìng)怺15]等發(fā)現(xiàn)一個(gè)導(dǎo)致Leber先天性黑矇的新的突變基因CCT2，也是一個(gè)涉及光感受器連接纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的基因。

TULP1基因(TUB Like Protein 1)定位于6p21.31，由542個(gè)氨基酸(61kDa)構(gòu)成TUB樣蛋白1，是非綜合征型視網(wǎng)膜纖毛疾病相關(guān)基因，主要在視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞表達(dá)，光感受器細(xì)胞通過(guò)突觸與內(nèi)視網(wǎng)膜進(jìn)行交流，TULP1在光感受器突觸前末端的活性區(qū)表達(dá)最豐富，對(duì)于視紫紅質(zhì)在光感受器內(nèi)外節(jié)之間的分布轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用。TULP1基因變異可導(dǎo)致LCA15型和RP14型[16]。LCA 15型有Leber先天性黑矇的一般特點(diǎn)，疾病嚴(yán)重程度較輕，但發(fā)病年齡早、表型嚴(yán)重于視網(wǎng)膜色素變性。與遺傳性視網(wǎng)膜疾病相關(guān)的TULP1突變至少有59種[17]，本研究中錯(cuò)義突變c.C1024G(p.R342G)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，該突變?cè)谡Ｇ藵h族人群及千人東亞人群中的突變頻率為0，是新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。家系中先證者父母親(I1、I2)及姐姐(II1)均攜帶一個(gè)TULP1雜合突變c.C1024G，表型正常，表明TULP1純和錯(cuò)義突變?yōu)楸炯蚁档闹虏≡?，結(jié)合病史及眼科相關(guān)檢查綜合判斷為L(zhǎng)CA15型(MIM：613843)的可能性大。有研究表明TULP1基因突變是與早發(fā)型視網(wǎng)膜色素變性有關(guān)的一個(gè)基因，但國(guó)內(nèi)暫無(wú)TULP1基因突變與無(wú)色素性視網(wǎng)膜色素變性有關(guān)的報(bào)道，提示TULP1基因不同的變異位點(diǎn)可能存在不同致病機(jī)制，導(dǎo)致臨床表型不同的疾病。具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

本研究從Leber先天性黑矇的臨床表現(xiàn)和遺傳變異水平闡明了1個(gè)近親結(jié)婚家系患者的致病原因，報(bào)道了導(dǎo)致Leber先天性黑矇的新發(fā)變異。進(jìn)一步擴(kuò)充了Leber先天性黑矇的突變位點(diǎn)，擴(kuò)大了Leber先天性黑矇的基因突變頻譜，使該病的分子病理機(jī)制得到了進(jìn)一步理解，為L(zhǎng)CA的精確診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷以及可能的基因治療提供了理論依據(jù)。同時(shí)也說(shuō)明全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)此類疾病具有重要的輔助診斷意義。