韓鳳玉，閆鳳華，張俊飛，馬亮亮，王麗鳳

壓瘡(PU)是由于局部組織長期受壓，繼而發(fā)生持續(xù)性缺血、缺氧及營養(yǎng)不良，從而導(dǎo)致組織發(fā)生了潰爛和壞死的疾病[1]。PU經(jīng)久不愈，延長了患者住院時(shí)間，給患者及家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，此外，PU持續(xù)發(fā)展累及深部組織繼發(fā)感染后引起膿毒癥等會(huì)危及患者生命[2]。歐美等國家研究指出PU已經(jīng)是繼癌癥和心血管疾病之后醫(yī)療花費(fèi)最高的疾病[2]。隨著中國老齡化發(fā)展PU患者也越來越多，這給患者及家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前關(guān)于PU的治療主要包括藥物療法、手術(shù)、電刺激、封閉負(fù)壓引流療法和紅外線光療等方法[3]。相比于手術(shù)等西醫(yī)治療方案，中醫(yī)藥外用膏劑、散劑、煎劑、艾灸、針灸和內(nèi)服藥物等方法在治療PU方面也取得了很好的效果，并且患者治療費(fèi)用和接受度更高[4]。產(chǎn)自寧夏的地區(qū)的枸杞是我國傳統(tǒng)名貴中藥之一，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)枸杞中提取的多種天然化合物具有多種藥理活性，其中枸杞多糖(LBP)因具有抗氧化，抗衰老，抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用備受關(guān)注[5]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)LBP在治療皮膚損傷和潰瘍中都表現(xiàn)出良好化學(xué)活性[6]。但是LBP對PU治療的作用機(jī)制依然不清，因此，本研究擬通過局部缺血再灌注損傷構(gòu)建PU大鼠模型，探討LBP促進(jìn)創(chuàng)面愈合的可能機(jī)制，從而為LBP臨床治療PU提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要儀器與試劑:枸杞多糖(純度：50%，批號(hào)MCA2016157)、ELISA試劑盒[IL-6(批號(hào)P1042)、IL-1β(批號(hào)P1037)、TNFα(批號(hào)P1003)和VEGF(批號(hào)P1012)]購于上海善然生物科技有限公司；多聚甲醛(粉末，純度大于95%)購于美國Sigma公司(批號(hào)158127)； IL-6、TNFα、VEGF和β-actin引物由上海英杰生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR(批號(hào)D7268S)、總RNA抽提試劑(批號(hào)R0011)、RIPA裂解液(批號(hào)P0013B)購買碧云天生物技術(shù)公司。實(shí)時(shí)定量Agilent PCR 儀購于美國安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性Wistar大鼠[(SCXK(寧)2015-0001)]50只，6～8周齡。實(shí)驗(yàn)通過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020-096)，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物研究。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備:10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將其背部皮膚剃毛至表面無毛發(fā)，備皮區(qū)域面積約為10 cm×5 cm。將其背部皮膚(松軟)沿正中線提起，對稱性扣上強(qiáng)力磁鐵(直徑25 mm,圓形)，靠磁鐵的強(qiáng)大磁力作用對其進(jìn)行壓力損傷，造成壓迫缺血，采用夾(缺血)12h再松(灌注)12 h，連續(xù)3循環(huán)的造模方法對大鼠的皮膚造成損傷制備PU模型[4]。

1.3.2 分組和給藥:將大鼠隨機(jī)分為五組，每組6只大鼠。對照組、模型組、治療組(高、中、低劑量)。模型組和治療組大鼠采用模型制備方法進(jìn)行PU模型制備。將枸杞多糖粉末溶于生理鹽水配制成枸杞多糖溶液，高劑量組按照[100 mg/(kg·d)]，中劑量為[75 mg/(kg·d)]，低劑量按照[50 mg/(kg·d)]劑量連續(xù)灌胃干預(yù)2周。對照組和模型組采用同等體積生理鹽水給予連續(xù)灌胃2周。實(shí)驗(yàn)執(zhí)行期間所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均正常飲水飲食。末次給藥后12 h 10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后進(jìn)行組織取材，取材后采用頸椎脫位處死大鼠。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 創(chuàng)面愈合率的測定：參考高翔[7]等研究方法進(jìn)行大鼠PU創(chuàng)面愈合率計(jì)算[愈合率=(造模后PU面積-治療后PU面積)/造模后PU面積×100%]。通過Image J軟件進(jìn)行輔助計(jì)算。

1.4.2 ELISA檢測：大鼠麻醉后,通過腹主動(dòng)脈對各組大鼠進(jìn)行血液采集，離心保存血清后按照ELISA試劑盒說明書分別進(jìn)行IL-6、IL-1β、TNFα和VEGF水平檢測。

1.4.3 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT - qPCR)檢測：對各組大鼠PU創(chuàng)面皮膚組織進(jìn)行取材后，參考于澤洋[11]等研究方法進(jìn)行，主要包括提取組織中總RNA后按照相關(guān)操作試劑盒進(jìn)行cDNA合成，最后采用熒光定量PCR試劑盒在反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR檢測。相對表達(dá)水平采用2-ΔΔCt分析方法測定，各基因引物序列見表1。

表1 基因引物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)以“Mean±SD”表示，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LBP對PU大鼠創(chuàng)面愈合的影響:與模型組相比，LBP對PU大鼠創(chuàng)面均具有很好的治療效果，隨著劑量增加創(chuàng)面愈合率也明顯提高，具有一定的劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 LBP對PU大鼠創(chuàng)面愈合率的影響

2.2 LBP對PU大鼠血清TNFα、IL-6、IL-1β和VEGF水平的影響:LBP對PU大鼠治療后可以明顯降低血清TNFα、IL-6和IL-1β水平，隨著劑量增加降低效果明顯提高，具有一定的劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)與模型組相比，LBP提高了PU大鼠血清VEGF水平并隨著劑量增加VEGF表達(dá)水平也逐漸提高，具有一定劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 LBP對PU大鼠血清TNFα、IL-6、IL-1β和VEGF水平的影響

2.3 LBP對PU大鼠皮膚創(chuàng)面組織中TNFα 、IL-6和VEGF的mRNA表達(dá)的影響:與模型組相比，LBP治療后PU大鼠創(chuàng)面組織中TNFα mRNA和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯下降并隨著LBP劑量增加而下降，具有劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，LBP治療后PU大鼠創(chuàng)面組織中VEGF mRNA表達(dá)水平明顯升高并隨著LBP劑量增加而升高，具有劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1(封二)。

3 討論

PU又稱為壓力性潰瘍，目前對其定義中明確提出了“三力學(xué)說”即壓力、剪切力、摩擦力，各因素可單獨(dú)或復(fù)合存在作用。雖然PU的具體發(fā)病機(jī)制依然不清，但是目前主要認(rèn)為其與皮膚缺血損傷、缺血再灌注損傷、代謝障礙和細(xì)胞變形等機(jī)制相關(guān)[2]。其中缺血再灌注損傷在PU的發(fā)生機(jī)制中受到了越來越多的關(guān)注，本文前期研究與其他人研究都采用缺血再灌注損傷方法進(jìn)行了模型制備，病理結(jié)果顯示模型穩(wěn)定可靠，為后續(xù)研究提供了保障[4]。對于PU創(chuàng)面治療中，損傷皮膚組織的治愈率是判斷藥物治療成功的主要指標(biāo)之一，本研究中通過給予LBP連續(xù)治療后，與模型組相比，PU大鼠創(chuàng)面愈合率明顯提高，并在本文所用劑量范圍內(nèi)，隨LBP劑量增高，愈合率增高越明顯，具有劑量依賴性。研究結(jié)果與其他中醫(yī)藥治療方法接近[7]。在創(chuàng)面修復(fù)過程中VEGF被認(rèn)為發(fā)揮重要作用，它可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)微血管通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致血漿蛋白廣泛滲漏，包括纖維蛋白原、纖溶酶原和纖維蛋白等。這些蛋白質(zhì)直接或間接地改變細(xì)胞外主要成分，形成臨時(shí)的新基質(zhì)來支持內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的遷移，從而促進(jìn)傷口愈合[8]。在慢性創(chuàng)面?zhèn)谥蠽EGF表達(dá)水平下調(diào)，導(dǎo)致血管生成速率下降，降低了組織修復(fù)能力[9]。本研究中，給予LBP治療后PU大鼠血清和創(chuàng)面組織中VEGF表達(dá)水平都高于模型組，并隨LBP劑量增高，VEGF水平增高越明顯，具有劑量依賴性。我們的結(jié)果與Zhou[10]等研究相近。

有研究表明，在PU的創(chuàng)面中炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生后會(huì)破壞組織完整性相關(guān)的酶，使創(chuàng)面細(xì)胞基質(zhì)和纖維連接蛋白降解，從而使創(chuàng)面經(jīng)久不愈。汪漣[10]等對壓瘡患者的組織樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA表達(dá)明顯高于正常對照組，表明炎癥因子在壓瘡發(fā)生中扮演著重要角色。易倩[11]等采用濕潤燒傷膏聯(lián)合銀離子抗菌敷料對壓瘡患者創(chuàng)面進(jìn)行治療后取得滿意效果，提高了創(chuàng)面治愈率，并且降低了壓瘡患者血清IL-6、IL-8、TNFα及hs-CRP的表達(dá)，表明降低炎癥因子是提供創(chuàng)面愈合的有效手段。戢艷瓊[12]等研究發(fā)現(xiàn)瑰及乳膏可以通過抑制壓瘡創(chuàng)面炎癥介質(zhì)IL-6、IL-1β引起的炎癥反應(yīng)來減輕創(chuàng)面損傷，并提高BFGF及FN的合成來促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織新生而加速創(chuàng)面組織修復(fù)。本研究也表明，LBP可以有效降低PU大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNFα表達(dá)水平并具有劑量依賴性，同時(shí)對創(chuàng)面組織中IL-6和TNFα的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示LBP可以降低組織中IL-6和TNFα的mRNA表達(dá)水平并具有劑量依賴性，結(jié)果與血清中表達(dá)相一致。這表明LBP對PU大鼠創(chuàng)面損傷具有很好的抗炎作用。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，LBP作為枸杞主要成分已經(jīng)被證明具有多種藥理活性。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)LBP在PU大鼠創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮了明顯的抗炎作用并促進(jìn)了血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，為創(chuàng)面修復(fù)提供了良好的內(nèi)環(huán)境。