黃梨婷，王珠強(qiáng)，王依婷，范衛(wèi)鋒，董更婷，彭偉文（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 中山 528400）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種進(jìn)行性、致命性的疾病，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積、肺間質(zhì)纖維瘢痕化和肺部重塑[1]。近年來，IPF發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且隨年齡的增加而升高[2]。中醫(yī)將IPF歸為“肺痿”和“肺痹”，其治法為益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、活血化瘀[3]。研究表明，諸多中藥成分（如黃芩素、雷公藤內(nèi)酯、芍藥苷等）都顯現(xiàn)出了較好的IPF治療效果[4―7]。以中醫(yī)藥理論和傳統(tǒng)用法為線索，從中藥成分中開發(fā)治療IPF新藥的前體化合物具有重要價(jià)值。

黑面神Breynia fruticosa（Linn.）Hook.f為大戟科黑面神屬植物，以干燥嫩枝葉及根入藥，其性涼，微苦，歸心、肝、肺經(jīng)[8]。黑面神具有抗炎、抗病毒和免疫抑制等藥理作用[9]，由其組成的相關(guān)制劑可用于治療慢性支氣管炎[10]。本課題組前期從黑面神提取物中分離出了多種化合物，并進(jìn)行初步藥效篩選后發(fā)現(xiàn)其中的蒙花苷具有良好的抗肺纖維化藥效。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蒙花苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗衰老等作用[11]，而肺纖維化與炎癥、氧化等有密切關(guān)聯(lián)[1]。肺纖維化伴隨著炎癥發(fā)生和細(xì)胞因子釋放。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）作為主要致肺纖維化的細(xì)胞因子，可促進(jìn)膠原蛋白產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致纖維沉積[12]。TGF-β1致肺纖維化作用與其下游的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路密切相關(guān)，在多種肺纖維化模型和病理組織中均發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK（p-ERK）表達(dá)上調(diào)[13]。因此，本研究通過構(gòu)建體內(nèi)外肺纖維化模型，探討蒙花苷對(duì)肺纖維化的改善作用，并基于炎癥和ERK通路初步考察其作用機(jī)制，為抗IPF的新藥研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有HY-LWH03型微量液體氣管內(nèi)霧化裝置（北京元森凱德生物技術(shù)有限公司）；MULTISKAN型酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；ECLIPSE TI2-A型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；2-16R型低溫高速離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）；MCO-18AICUUV型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本PHCbi公司）；ChemiDoc MP型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有蒙花苷對(duì)照品（四川萃益潤(rùn)生物科技有限公司，批號(hào)CYR-M0074210415，純度98.5%），注射用鹽酸博萊霉素（日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)Y00720，規(guī)格15 mg/瓶），吡非尼酮膠囊（北京康蒂尼藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20211105，規(guī)格100 mg/顆），TGF-β1（美國(guó)Peprotech公司，批號(hào)1020209），HFL1細(xì)胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司），兔源α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（type Ⅰ collagen，Collagen Ⅰ）多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國(guó)Cell Signaling公司，批號(hào)分別為8685T、72026T、7074P2），兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceral‐dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）抗體（美國(guó)Affinity公司，批號(hào)分別為AF7021、AF0155、AF1015），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)分別為A28220233、A98111123），白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號(hào)202203），二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzi‐dine，DAB）顯色試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，貨號(hào)G1212）；水為自制純化水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，共40只，8周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2022-0002，質(zhì)量合格證號(hào)為44007200100881。檢疫合格后將其飼養(yǎng)于中山市中醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房中（屏障環(huán)境），動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（粵）2020-0109。飼養(yǎng)條件為環(huán)境溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，明暗交替各12 h。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程均通過中山市中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，批準(zhǔn)文號(hào)為AEWC-2022034。

1.4 細(xì)胞株

人胚肺成纖維細(xì)胞HFL1購自武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號(hào)CL-0106）。

2 方法

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量大小采用區(qū)間隨機(jī)分組法分成正常組、模型組、蒙花苷低劑量組、蒙花苷高劑量組和陽性對(duì)照組，每組8只。除正常組外，其余各組小鼠均腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，然后將其固定于操作臺(tái)上，通過微量液體氣管內(nèi)霧化裝置迅速給予每只小鼠50 μL博萊霉素（劑量為3 mg/kg）制備肺纖維化模型[14]；正常組小鼠則以同樣方式給予等體積生理鹽水。造模24 h后，蒙花苷低、高劑量組小鼠灌胃12.5、25 mg/kg蒙花苷（溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），陽性對(duì)照組小鼠灌胃200 mg/kg吡非尼酮（溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，劑量為臨床等效劑量），正常組和模型組小鼠灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。每日給藥1次，連續(xù)14 d。實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠自由飲水及進(jìn)食。

2.1.2 小鼠一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)過程中，每天觀察各組小鼠的活動(dòng)、毛發(fā)、飲食、體質(zhì)量等一般情況。

2.1.3 取材 末次給藥前，記錄各組小鼠的體質(zhì)量。末次給藥2 h后，麻醉小鼠并摘眼球取血，將得到的全血在4 ℃條件下靜置2 h，然后以3 500 r/min離心15 min，收集上層血清，將其凍存于－80 ℃冰箱中待測(cè)。采血后，處死小鼠，并解剖剝離其肺組織。

2.1.4 肺指數(shù)測(cè)定 稱定剝離得到的干凈肺組織的質(zhì)量，按下列公式計(jì)算小鼠肺指數(shù)：肺指數(shù)（mg/g）＝肺質(zhì)量（mg）/末次給藥前小鼠體質(zhì)量（g）。

2.1.5 肺組織病理學(xué)檢查 取各組小鼠左肺組織適量，置于福爾馬林溶液中固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）后，常規(guī)進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和Mas‐son染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理形態(tài)并采集圖像。參照Ashcroft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行肺纖維化評(píng)分，評(píng)分越高表明肺纖維化程度越嚴(yán)重：0分——正常肺組織；1分——肺泡壁或支氣管壁輕微增厚；3分——肺泡壁或支氣管壁中度增厚，但肺泡結(jié)構(gòu)沒有明顯破壞；5分——條索狀纖維帶或小范圍纖維灶形成，肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞；7分——肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形，廣泛的纖維灶形成，呈“蜂窩肺”；8分——肺組織全視野纖維化病變；2、4、6分的病變嚴(yán)重程度介于相應(yīng)分?jǐn)?shù)之間[15]。

2.1.6 血清及肺組織中炎癥指標(biāo)檢測(cè) 取“2.1.3”項(xiàng)下血清，常規(guī)解凍后按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清中TGF-β1、TNF-α水平；取右肺組織，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）制備組織勻漿，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)肺組織勻漿中IL-6水平。

2.1.7 肺組織中ERK及炎癥相關(guān)通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。制備小鼠肺組織切片（厚度3 μm），常規(guī)脫蠟及處理后，分別加入TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ、p-ERK1/2抗體（稀釋比例均為1∶200），按照試劑盒說明方法操作，封片后顯微鏡觀察，采集圖像并進(jìn)行分析。以棕黃色顆粒沉積為陽性表達(dá)，用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各蛋白的平均光密度值。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HFL1細(xì)胞接種于HFL1細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d進(jìn)行傳代換液1次，保證細(xì)胞活力為最佳狀態(tài)。

2.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的HFL1細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)，常規(guī)培養(yǎng)，次日貼壁后，將細(xì)胞分為空白組、模型組和蒙花苷低、中、高濃度組。其中，空白組加培養(yǎng)基；模型組加入TGF-β1（10 ng/mL）溶液刺激形成肺纖維化細(xì)胞模型[16]；蒙花苷低、中、高濃度組分別加入3.7、7.4、14.8 mg/L蒙花苷（質(zhì)量濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），同時(shí)加入TGF-β1（10 ng/mL）溶液。培養(yǎng)48 h后，于倒置顯微鏡下拍照并觀察HFL1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

2.2.3 細(xì)胞中ERK及炎癥相關(guān)通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。HFL1細(xì)胞的接種、分組及給藥方式均同“2.2.2”項(xiàng)下。培養(yǎng)結(jié)束后加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min），收集上清液，采用BCA法測(cè)定上清液中總蛋白濃度，加入Loading buffer，96 ℃金屬浴煮10 min使蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白組分（電壓70～120 V，時(shí)間1.5 h），濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上（恒流300 mA，時(shí)間2 h），用5%脫脂奶粉封閉2 h，以PBST洗膜3次；加入α-SMA、Collagen Ⅰ、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，以PBST洗膜3次；加入二抗（稀釋比例為1∶10 000），室溫孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以p-ERK1/2蛋白與ERK1/2蛋白條帶灰度值的比值表示p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平，其余則以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 蒙花苷對(duì)小鼠一般情況及肺指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組小鼠攝食量、飲水量日漸減少，行動(dòng)遲緩，皮毛粗糙、脫落嚴(yán)重，行為懶散，且身體機(jī)能有明顯下降，主要表現(xiàn)為肢體協(xié)調(diào)性差、動(dòng)作不靈敏，出現(xiàn)呼吸不暢、異常呼吸音，體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，蒙花苷高劑量組和陽性對(duì)照組小鼠的上述癥狀和表現(xiàn)均明顯好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05）。肺指數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肺指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，蒙花苷高劑量組和陽性對(duì)照組小鼠肺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠的體質(zhì)量、肺指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）

表1 各組小鼠的體質(zhì)量、肺指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組蒙花苷低劑量組蒙花苷高劑量組陽性對(duì)照組體質(zhì)量/g 21.64±0.39 15.35±0.74a 16.91±0.65b 17.13±0.43 17.99±0.41b肺指數(shù)/（mg/g）6.37±0.11 22.61±1.47a 19.18±1.16 15.91±0.98b 17.02±0.63b

3.1.2 蒙花苷對(duì)肺組織病理學(xué)變化的影響 正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無病理相關(guān)的炎癥浸染、細(xì)胞壞死、纖維化等現(xiàn)象；與正常組比較，模型組小鼠肺泡壁顯著增厚，肺泡均呈病理狀態(tài)，存在大量炎癥浸染及細(xì)胞纖維化病變（見圖1、圖2箭頭處），HE染色評(píng)分和Masson染色評(píng)分均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織炎癥病變均顯著減輕，肺泡壁增厚顯著改善，纖維化沉積顯著減輕，炎癥浸染顯著改善，HE染色評(píng)分和Masson染色評(píng)分均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、圖2、表2。

圖1 蒙花苷對(duì)模型小鼠肺組織纖維化的影響（HE染色，×100）

圖2 蒙花苷對(duì)模型小鼠肺組織纖維化的影響（Masson染色，×100）

表2 各組小鼠肺組織HE染色和Masson染色評(píng)分結(jié)果（±s，n＝8，分）

表2 各組小鼠肺組織HE染色和Masson染色評(píng)分結(jié)果（±s，n＝8，分）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組蒙花苷低劑量組蒙花苷高劑量組陽性對(duì)照組HE染色1.17±0.30 5.67±0.33a 4.17±0.47b 3.33±0.42b 3.83±0.40b Masson染色1.33±0.21 5.33±0.21a 4.33±0.21b 3.66±0.21b 3.83±0.31b

3.1.3 蒙花苷對(duì)小鼠血清及肺組織中炎癥因子水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清中TGF-β1、TNF-α及肺組織中IL-6水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠血清中TNF-α、TGF-β1及肺組織中IL-6水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8，pg/mL）

表3 各組小鼠血清中TNF-α、TGF-β1及肺組織中IL-6水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8，pg/mL）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

肺組織IL-6 26.62±0.82 38.08±1.99a 31.92±1.57b 32.49±1.43b 32.85±1.47b組別正常組模型組蒙花苷低劑量組蒙花苷高劑量組陽性對(duì)照組血清TNF-α 21.79±0.97 31.08±2.17a 22.45±1.76b 19.32±2.27c 24.19±2.66b血清TGF-β1 87.15±4.31 132.50±5.43a 86.74±5.58c 72.58±3.63c 98.02±2.01c

3.1.4 蒙花苷對(duì)肺組織中ERK及炎癥相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肺組織中α-SMA、TGF-β1、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織中上述蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、表4。

表4 各組小鼠肺組織中ERK及炎癥相關(guān)通路蛋白表達(dá)的光密度值測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）

表4 各組小鼠肺組織中ERK及炎癥相關(guān)通路蛋白表達(dá)的光密度值測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組蒙花苷低劑量組蒙花苷高劑量組陽性對(duì)照組α-SMA 0.13±0.01 0.22±0.01a 0.19±0.02b 0.17±0.01b 0.14±0.01b TGF-β1 0.12±0.01 0.17±0.01a 0.16±0.01b 0.14±0.01b 0.13±0.01b CollagenⅠ0.16±0.01 0.26±0.01a 0.16±0.01b 0.15±0.01b 0.19±0.01b p-ERK1/2 0.15±0.02 0.20±0.01a 0.16±0.01b 0.13±0.01b 0.17±0.02b

圖3 各組小鼠肺組織中α-SMA、TGF-β1、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的免疫組化圖（×100）

3.2 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 蒙花苷對(duì)HFL1細(xì)胞形態(tài)的影響 與空白組比較，模型組HFL1細(xì)胞的密度變大，增殖明顯，細(xì)胞形態(tài)從邊界清晰、規(guī)則梭形變成邊界模糊、扁平化梭形結(jié)構(gòu)。與模型組比較，蒙花苷各濃度組細(xì)胞的密度變小，增殖明顯受到抑制，細(xì)胞形態(tài)逐漸接近空白組，且呈濃度依賴性趨勢(shì)，這說明蒙花苷可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HFL1細(xì)胞的增殖和分化。結(jié)果見圖4。

圖4 各組HFL1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察顯微圖（×100）

3.2.2 蒙花苷對(duì)HFL1細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ及p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，蒙花苷高濃度組細(xì)胞中上述蛋白及蒙花苷中濃度組細(xì)胞中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖5、表5。

圖5 各組細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的電泳圖

表5 各組細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

表5 各組細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與空白組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05；d：與模型組比較，P＜0.01

p-ERK1/2/ERK1/2 1.00±0.07 1.61±0.11a 1.19±0.07 0.83±0.03c 0.76±0.08c組別空白組模型組蒙花苷低濃度組蒙花苷中濃度組蒙花苷高濃度組α-SMA/GAPDH 1.00±0.15 1.99±0.09a 1.57±0.16 1.57±0.16 1.25±0.14c CollagenⅠ/GAPDH 1.00±0.03 2.11±0.14b 2.15±0.03 1.94±0.17 0.55±0.23d

4 討論

慢性炎癥反應(yīng)是肺纖維化發(fā)病的主要機(jī)制之一，而膠原蛋白合成、致纖維化細(xì)胞因子釋放、纖維沉積等也是目前抗肺纖維化研究的重要途徑[17]。目前，臨床常用吡非尼酮等化學(xué)藥來延緩肺纖維化的進(jìn)展，減少纖維化相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子產(chǎn)生以及降低ECM的合成和積聚[18]，因此本研究選擇吡非尼酮作為陽性藥物進(jìn)行對(duì)照研究。肺纖維化的進(jìn)程與肺組織的炎癥發(fā)生高度相關(guān)，TGF-β1作為致纖維化的一個(gè)關(guān)鍵炎癥因子，一直受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注[19]。在肺組織中，TGF-β1能夠刺激成纖維細(xì)胞促進(jìn)ECM的合成和沉積，進(jìn)而促進(jìn)其他炎癥因子（如TNF-α、IL-6等）的大量釋放，而炎癥因子可以介導(dǎo)纖維增生，并進(jìn)一步活化炎癥細(xì)胞，從而形成一系列連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，最終導(dǎo)致肺纖維化[19]。本研究結(jié)果表明，蒙花苷能夠降低肺纖維化模型小鼠體內(nèi)炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-6的水平。此外，相比于模型組，蒙花苷給藥組小鼠體質(zhì)量、肺指數(shù)均有不同程度改善，說明其具有改善肺纖維化的效果。

在肺纖維化體內(nèi)模型中，肌成纖維細(xì)胞會(huì)過度表達(dá)α-SMA并分泌ECM相關(guān)蛋白，尤其是Collagen Ⅰ蛋白，這會(huì)進(jìn)一步造成ECM沉積，最終演化成纖維化組織[5]。因此，α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白作為肺纖維化的標(biāo)志性蛋白，常作為評(píng)判肺纖維化程度的重要指標(biāo)。TGF-β1是肺纖維炎癥機(jī)制中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，而ERK通路是TGF-β1的下游信號(hào)通路。p-ERK1/2蛋白作為ERK通路的關(guān)鍵蛋白，在ERK通路中起到重要調(diào)控作用[13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生[13]。本研究在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，蒙花苷能夠顯著下調(diào)肺纖維化標(biāo)志性蛋白α-SMA、CollagenⅠ的表達(dá)，降低小鼠肺組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)；而在體外實(shí)驗(yàn)中，Western blot結(jié)果也顯示出了相同的趨勢(shì)。因此，筆者推測(cè)蒙花苷可能是基于ERK通路起到改善肺纖維化的作用。

綜上所述，本研究經(jīng)過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蒙花苷可能是通過調(diào)控ERK及炎癥相關(guān)通路，抑制炎癥因子釋放來改善炎癥浸潤(rùn)，從而發(fā)揮抗肺纖維化作用，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

（利益沖突：所有作者均聲明不存在任何利益沖突）