楊柳 ，楊艷 ，高奇 ，文雯 ，王麗 ，楊小生 ，楊娟 （1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 55005；.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴陽 550014）

石胡荽為菊科石胡荽屬石胡荽Centipeda minima（L.）A. Braun et Aschers.的全草，又名鵝不食草，主要分布于我國廣西、湖北、浙江等地[1]。其味辛、性溫，歸肺、肝經(jīng)，具有發(fā)散風寒、通鼻竅、鎮(zhèn)痛消炎、止咳、解毒等功效，用于治療百日咳、鼻炎和鼻竇炎、瘧疾、關(guān)節(jié)扭傷、風濕疼痛等癥[2]。石胡荽中已報道的化學(xué)成分主要為倍半萜類、三萜及其苷類、黃酮及其苷類、揮發(fā)油類等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，三萜類化合物具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低膽固醇等多種生物活性[4―5]。近年來，關(guān)于石胡荽三萜類化合物的化學(xué)成分組成[6―8]、藥理作用[9―12]、臨床應(yīng)用及質(zhì)量控制[13―14]等方面的研究已有較多報道。成光宇等[15]曾利用加熱回流提取法和正交實驗優(yōu)化石胡荽總?cè)圃碥盏奶崛」に?，但正交實驗存在實驗次?shù)多、未考慮因素之間的相互影響等不足。響應(yīng)面法目前被廣泛應(yīng)用于中藥提取工藝研究中[16―18]，該法可通過將實驗結(jié)果進行方差分析、回歸分析來尋求最佳工藝參數(shù)，實現(xiàn)實驗設(shè)計、回歸分析、預(yù)測優(yōu)化的功能，可彌補正交實驗的缺陷。本研究擬在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法進一步綜合分析影響熱回流提取石胡荽醇提物的關(guān)鍵因素，確定最佳工藝參數(shù)；在此基礎(chǔ)上，采用系統(tǒng)溶劑萃取法得到石胡荽醇提物的不同萃取部位，并初步考察不同萃取部位的抗炎活性，以期為該植物資源的合理開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司），OSB-2200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA株式會社），BT25S型電子分析天平（德國Sartorius公司），DK-98-Ⅱ型恒溫水浴鍋（美國Trisite公司），CCL-170B-8型CO2細胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO公司），TS2 FL型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），EPOCH型多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 主要藥品與試劑

石胡荽藥材購自云南中藥市場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為石胡荽C. minima （L.） A.Braun et Aschers.的干燥全草；藥材標本存放于貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室（標本號為CM202106）。齊墩果酸對照品（批號PS0236-0100，純度≥99.0%）購自成都普思生物科技股份有限公司；地塞米松對照品（批號 D4902-25MG，純度≥97.0%）、脂多糖、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（批號PS0236-0100）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MTT試劑購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、二甲基亞砜均為國產(chǎn)分析純，水為純化水。

1.3 細胞

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自上海中喬新舟生物科技有限公司，凍存于貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室。

2 方法與結(jié)果

2.1 石胡荽總?cè)坪繙y定方法的確定

根據(jù)2020年版《中國藥典》（一部）中三萜含量的測定方法[19]，并結(jié)合中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《靈芝總?cè)坪康臏y定分光光度法：NY/T 3676-2020》[20]，確定本研究以齊墩果酸為對照品，采用紫外分光光度法（波長550 nm）測定石胡荽總?cè)频暮俊?/p>

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品5.00 mg，置于25 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的齊墩果酸對照品貯備液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取石胡荽粗粉1.00 g，置于150 mL錐形瓶中，加70%乙醇40 mL，稱定質(zhì)量后加熱回流提取2.0 h。提取完畢后將提取液靜置，冷卻后再次稱質(zhì)量并補足減失的質(zhì)量，過濾除雜；濾液減壓濃縮干燥后用乙醇轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中并定容，得到供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標準曲線的繪制 準確移取齊墩果酸對照品貯備液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于10 mL試管中。將試管置于90 ℃的水浴鍋中揮干溶劑，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.10 mL、高氯酸0.80 mL，混勻后于60 ℃水浴中保溫顯色20 min，取出后迅速置于冰水浴中冷卻5 min，終止顯色反應(yīng)。然后加入5.00 mL冰醋酸，混勻，室溫放置10 min。以相應(yīng)試劑為空白對照，于550 nm波長處測定吸光度。以齊墩果酸質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為 y＝61.899 0x－0.0465 9（R2＝0.999 4）。結(jié)果表明，齊墩果酸在0.003 1～0.019 0 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取對照品貯備液適量，按“2.3.1”項下方法操作，連續(xù)測定6次吸光度。結(jié)果顯示，吸光度的RSD為 0.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液適量，按“2.3.1”項下方法操作，分別在顯色后0、10、20、40、60、80 min時測定吸光度。結(jié)果顯示，吸光度的RSD為0.78%（n＝6），表明供試品溶液顯色后在80 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密稱取6份同一批石胡荽粗粉1.00 g，按照最優(yōu)制備工藝制備供試品溶液，然后按“2.3.1”項下方法操作，測定吸光度，按照標準曲線法計算含量。結(jié)果顯示，含量的RSD為1.29%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 石胡荽總?cè)铺崛÷实臏y定

在最佳工藝條件下，精密吸取供試品溶液適量，按“2.3.1”項下方法操作，作為待測溶液，以相應(yīng)試劑為空白對照，在550 nm波長處測定其吸光度，將吸光度代入“2.3.1”項下回歸方程計算出石胡荽總?cè)频馁|(zhì)量濃度，并按照下列公式計算石胡荽總?cè)频奶崛÷剩▂）：y（%）＝（xv1f/1 000v2m）×100%。式中，x為從標準曲線上查得的樣品反應(yīng)液的總?cè)瀑|(zhì)量濃度（mg/mL），v1為樣品定容時加入的乙醇體積（mL），f為樣品溶液稀釋倍數(shù)，v2為比色測定時移取的樣品提取液體積（mL），m為樣品的質(zhì)量（g）。

2.5 單因素實驗篩選石胡荽醇提物的制備工藝因素

因乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比、提取次數(shù)4個因素對總?cè)铺崛÷视绊戄^大[21―23]，故本研究以石胡荽總?cè)铺崛÷蕿橹笜?，以乙醇體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、料液比（1︰10、1︰20、1︰30、1︰40、1︰50，g/mL）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）為因素，在固定其余3個因素不變的條件下進行單因素實驗，平行3次，以確定各因素的優(yōu)化區(qū)間，詳見圖1。

圖1 各因素對石胡荽總?cè)铺崛÷实挠绊懀╪＝3）

2.5.1 乙醇體積分數(shù)的影響 由圖1A可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，石胡荽總?cè)铺崛÷食氏壬仙笙陆档内厔?。在乙醇體積分數(shù)為70%時，石胡荽總?cè)铺崛÷蔬_到最高，故本研究選擇乙醇體積分數(shù)60%～80%進行后續(xù)實驗。

2.5.2 提取時間的影響 由圖1B可知，隨著提取時間的延長，石胡荽總?cè)铺崛÷食氏壬仙笙陆档内厔?。當提取時間為2.0 h時，總?cè)频奶崛÷首罡?；繼續(xù)延長提取時間，石胡荽總?cè)铺崛÷书_始降低。因此，本研究選擇提取時間1.5～2.5 h進行后續(xù)實驗。

2.5.3 料液比的影響 由圖1C可知，隨著料液比的增加，石胡荽總?cè)铺崛÷食氏壬仙笙陆档内厔?，當料液比?∶40時，總?cè)频奶崛÷首罡撸时狙芯窟x擇料液比1∶30～1∶50（g/mL）進行后續(xù)實驗。

2.5.4 提取次數(shù)的影響 由圖1D可知，隨著提取次數(shù)的增加，石胡荽總?cè)铺崛÷食噬仙厔?，但當提取次?shù)達3次時上升趨于平緩。這說明藥材中的總?cè)埔鸦咎崛⊥耆僭黾犹崛〈螖?shù)也難以使石胡荽總?cè)铺崛÷视休^大改變，考慮到提取成本問題，故本研究將提取次數(shù)固定為3次進行后續(xù)實驗。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化石胡荽醇提物的制備工藝

以石胡荽總?cè)铺崛÷剩╕）為響應(yīng)值，以乙醇體積分數(shù)（A）、提取時間（B）、料液比（C）為響應(yīng)因素，利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面實驗以優(yōu)化石胡荽醇提物的提取工藝。響應(yīng)面實驗設(shè)計的因素與水平見表1，實驗方案和結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計的因素與水平

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案和實驗結(jié)果

表3 響應(yīng)面實驗方差分析結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行回歸擬合分析，得到回歸方程為Y＝1.160+0.077A+0.022B+0.043C+0.013AB+0.01AC－0.049BC－0.15A2－0.038B2－0.083C2。由表3可知，失擬項P＝0.182 4＞0.05，表明失擬不顯著，即該模型對本實驗擬合程度良好；R2＝0.905 8，說明石胡荽總?cè)铺崛÷实淖兓?0.58%來自所選的因素。因此，因素A、B、C對石胡荽總?cè)铺崛÷视绊懼鞔雾樞驗椋篈＞C＞B，即乙醇體積分數(shù)＞料液比＞提取時間。

在其他因素不變的情況下，選取2個交互因素對石胡荽總?cè)铺崛÷蔬M行響應(yīng)面分析，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖（圖2）。結(jié)果顯示，A與C的交互作用顯著，即這2個因素的交互作用對石胡荽總?cè)铺崛÷实挠绊戯@著。

圖2 各因素交互作用對石胡荽總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖和等高線圖

2.7 最佳制備工藝的確定與驗證

利用Design Expert 8.0.6軟件進行計算，得出石胡荽醇提物的實際最優(yōu)制備工藝為：乙醇體積分數(shù)69.93%，提取時間2.09 h，料液比1∶39.50（g/mL），同時預(yù)測出石胡荽總?cè)铺崛÷蕿?.161%。結(jié)合實際操作的方便性，選擇乙醇體積分數(shù)70%、提取時間2.0 h、料液比1∶40（g/mL）為石胡荽總?cè)拼继嵛锏淖罴阎苽涔に嚒?/p>

取石胡荽粗粉1.00 g，按照該工藝條件平行操作3次進行驗證，所得石胡荽總?cè)频奶崛÷史謩e為1.092%、1.165%、1.127%，平均提取率為1.134%（RSD＝0.03%），與預(yù)測值的相對誤差為0.02%。這說明該方法穩(wěn)定、可靠，可用于石胡荽總?cè)拼继嵛锏闹苽洹?/p>

2.8 石胡荽醇提物不同萃取部位的抗炎活性測定

2.8.1 樣品的制備 按照最佳工藝制備石胡荽醇提物，得率為11.42%。濃縮后，用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取得到不同萃取部位及萃取后剩下的水部位，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的總?cè)坪糠謩e為0.410%、0.455%、0.182%、0.109%。各部位干燥后分別稱取1.0 mg樣品，用二甲基亞砜溶解，備用。

2.8.2 不同萃取部位對RAW264.7細胞活力的影響 采用MTT法進行檢測。通過前期預(yù)實驗，本研究設(shè)置空白組和以萃取物濃度計的5個不同濃度（50、25、12.5、9.375、6.25 μg/mL）的藥物組，于490 nm波長處測定各組吸光度，具體方法參考文獻[24]。計算細胞活力：細胞活力（%）＝（藥物組吸光度/空白組吸光度）×100%。當細胞活力＞90%時，認為藥物是在安全濃度范圍內(nèi)[25]。結(jié)果顯示，石油醚部位質(zhì)量濃度為6.25 μg/mL、乙酸乙酯部位質(zhì)量濃度為9.375 μg/mL、正丁醇部位質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL及水部位質(zhì)量濃度為25 μg/mL時，RAW 264.7細胞的活力均大于90%，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），故本研究選擇以上濃度進行后續(xù)實驗。結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取部位對RAW264.7細胞活力的影響（±s，n＝3）

2.8.3 不同萃取部位對RAW264.7細胞NO生成的影響 利用脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細胞建立細胞炎癥模型[26]，設(shè)置空白組、加1 μg/mL脂多糖致炎的模型組和不同給藥濃度的藥物組，采用Griess試劑法于540 nm波長處測定不同組別的吸光度，以NO生成抑制率評價石胡荽總?cè)拼继嵛锊煌腿〔课坏目寡谆钚?，具體方法參考文獻[27]。NO生成抑制率（%）＝（模型組吸光度－藥物組吸光度）/（模型組吸光度－空白組吸光度）×100%。實驗重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以±s表示，并通過Graphpad Prism 5.0軟件計算各藥物組的半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果顯示，在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各部位的抗炎活性強弱排序依次為乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位，其對NO生成的IC50分別為2.22、2.44、＞100、＞100 μg/mL。石油醚部位、乙酸乙酯部位可不同程度地抑制NO生成，且其IC50均低于陽性對照藥物地塞米松（7.65 μg/mL）。正丁醇部位和水部位各個濃度對NO的生成無抑制作用，計算其IC50＞100 μg/mL，判斷這2個部位均無抗炎活性。結(jié)果見表4。

表4 各萃取部位對RAW264.7細胞NO生成的影響及IC50測定結(jié)果（n＝3）

3 討論

在前期研究中，筆者先是采用超聲輔助提取法對甲醇、乙醇進行考察，結(jié)果顯示，乙醇對石胡荽總?cè)铺崛÷瘦^高。隨后，筆者以乙醇為溶劑，對回流提取法、超聲輔助提取法和冷浸漬法的提取效果進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種提取方法中回流提取法提取率較后兩者高，故本研究采用乙醇回流提取法作為提取方法。經(jīng)單因素實驗和響應(yīng)面法分析發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分數(shù)和料液比是影響石胡荽總?cè)铺崛÷实闹饕蛩?。通過響應(yīng)面法確定乙醇體積分數(shù)70%、提取時間2.0 h、料液比1∶40（g/mL）、提取次數(shù)3次為最佳工藝，該工藝操作簡單、提取率高、可行性強，具有較強的實際應(yīng)用價值。

NO是十分重要的炎癥介質(zhì)，脂多糖在刺激RAW 264.7細胞產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)的過程中會釋放大量的NO[28]。文獻報道，石胡荽粗提物[29―31]和部分三萜類化合物具有抗炎作用[32]。本研究采用地塞米松作為陽性對照藥物，比較了石胡荽醇提物不同萃取部位（石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位）的體外抗炎活性。結(jié)果顯示，抗炎活性強弱排序依次為乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位。其中，石油醚部位、乙酸乙酯部位均能較好地抑制脂多糖誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細胞生成炎癥介質(zhì)NO，且其IC50均低于陽性對照藥物地塞米松。

綜上所述，優(yōu)化后的石胡荽醇提物制備工藝穩(wěn)定可行，其石油醚部位、乙酸乙酯部位具有一定的抗炎活性。但本文結(jié)論仍需設(shè)計更為嚴密的藥理實驗加以驗證。