邴一凡，張?zhí)炖祝瑢O志偉，楊小龍，李蘇楠，姜雪，曲中原 （哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150076）

過(guò)敏性哮喘是一種機(jī)體受到外界抗原性或非抗原性刺激產(chǎn)生的氣道高反應(yīng)性呼吸道疾病。目前我國(guó)成年人的哮喘發(fā)病率約為1.09%，兒童的患病率也在3.02%左右[1]，這已然成為當(dāng)下我國(guó)面臨的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。過(guò)敏體質(zhì)人群常因受到外界環(huán)境如過(guò)敏原（花粉、植物和塵螨）、食物、藥物、空氣污染等因素的刺激，引發(fā)氣道高反應(yīng)和氣道炎癥，出現(xiàn)反復(fù)的呼吸困難、喘息、胸悶和咳嗽等癥狀[2]。西醫(yī)多通過(guò)使用抗炎或支氣管擴(kuò)張藥物來(lái)達(dá)到緩解病情的目的[3]，但臨床常用的皮質(zhì)類固醇等激素類藥物容易使人體產(chǎn)生耐藥性，且長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂。因此，越來(lái)越多的患者選擇中醫(yī)辨證論治或中西醫(yī)結(jié)合進(jìn)行治療。

中醫(yī)將過(guò)敏性哮喘定義為“哮病”，分為熱哮、寒哮等，其中寒哮的特征與西醫(yī)的過(guò)敏性哮喘比較接近。因此，從治療寒哮的溫肺散寒、化痰定喘類中藥中尋找防治過(guò)敏性哮喘的有效藥物已成為研究熱點(diǎn)[4]。五味子為木蘭科植物五味子 Schisandra chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效[5]。在醫(yī)圣張仲景的射干麻黃湯、小青龍湯以及臨床經(jīng)驗(yàn)方加味過(guò)敏煎、哮喘方等治療過(guò)敏性哮喘的經(jīng)典名方中，五味子均發(fā)揮了斂肺、止咳、平喘之功[6―7]。臨床亦有用五味子單方治療經(jīng)期哮喘的案例[8]。研究表明，五味子中含有木脂素、黃酮、有機(jī)酸、揮發(fā)油等化學(xué)成分[9]；五味子水煎液、五味子木脂素和揮發(fā)油均可通過(guò)抑制輔助型T細(xì)胞2（T helper 2 cell，Th2）相關(guān)炎癥因子、緩解肺部炎癥浸潤(rùn)來(lái)改善哮喘癥狀[10―11]。上述研究提示，五味子治療哮喘的效果可觀，且應(yīng)用前景理想，但其潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還不十分明確。

五味子在臨床常與其他中藥配伍后以水煎液的形式應(yīng)用于治療過(guò)敏性哮喘。因此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)分析不同批次五味子水煎液中的共有成分，并采用灰色關(guān)聯(lián)度和Pearson相關(guān)性分析法探討其共有峰與治療過(guò)敏性哮喘之間的關(guān)系，篩選活性成分，旨在初步闡明五味子治療過(guò)敏性哮喘的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有ACQUITY型UPLC儀（美國(guó)Waters公司）、液相色譜-G6500系列四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）、BSA型萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）、iMark型酶標(biāo)儀（上海伯樂(lè)生命醫(yī)藥產(chǎn)品有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

10批五味子藥材分別購(gòu)自各地藥材市場(chǎng)或自采，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院曲中原教授鑒定均為木蘭科植物五味子S. chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果實(shí)，藥材具體來(lái)源信息見(jiàn)表1。五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)MUST-18031905）、戈米辛 J對(duì)照品（批號(hào) MUST-18041102）和戈米辛M2對(duì)照品（批號(hào)MUST-18010412）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%；五味子醇乙對(duì)照品（批號(hào)AM407S）、五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)AM268S）、五味子乙素對(duì)照品（批號(hào)AB266S）和五味子丙素對(duì)照品（批號(hào)AM509W）均購(gòu)自天津一方科技有限公司，純度均大于98%；卵白蛋白（ovalbumin，OVA；批號(hào)9006-59-1）購(gòu)自北京博奧生物集團(tuán)有限公司；百令膠囊（批號(hào)18010016，規(guī)格每粒0.5 g）購(gòu)自杭州中美華東制藥有限公司；γ干擾素（interferonγ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）和免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為elisa3578、elisa1033、elisa2444）均購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈購(gòu)自德國(guó)Merck KGaA公司，色譜級(jí)甲酸購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，其他試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

表1 五味子藥材樣品的來(lái)源信息

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，共104只，體質(zhì)量為170～190 g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)為SCXK（吉）-2018-0007。飼養(yǎng)室空氣狀況良好，溫度適宜，相對(duì)濕度為40%～70%，12 h/12 h光照晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)前連續(xù)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中食物和水充足。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施（批準(zhǔn)號(hào)為201803009）。

2 方法

2.1 不同批次五味子水煎液的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

2.1.1 供試品溶液的制備 分別取10批五味子供試品粉末各1 g，按料液比1∶10（g/mL，下同）加水回流提取1 h，過(guò)濾后濾渣再按1∶8的料液比加水回流提取1 h，過(guò)濾后合并2次濾液，置于水浴鍋上濃縮成浸膏（得率為13.5%～14.3%）。取全部浸膏，加適量乙腈定容于10 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.1 g/mL（按生藥量計(jì)）的五味子供試品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液，并記為SG1～SG10，備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛J、戈米辛M2對(duì)照品各3.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加乙腈超聲（功率200 W，頻率40 kHz）5 min溶解，待冷卻后，用乙腈定容，得到各對(duì)照品質(zhì)量濃度均為0.3 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件 采用ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～3 min，23%B；3～7 min，23%B→40%B；7～8 min，40%B→42%B；8～11 min，42%B→55%B；11～13 min，55%B→65%B；13～14 min，65%B→75%B；14～19 min，75%B→100%B；19～23 min，100%B→23%B）；流速為0.2 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm。

2.1.4 質(zhì)譜條件 離子化模式為電噴霧正離子模式；離子源電壓為5 500 V；離子源溫度為550 ℃；裂解電壓為80 V，碰撞能量為35 eV；氣簾氣壓力為35.0 psi；離子源氣體1壓力為55.0 psi，離子源氣體2壓力為5.0 psi；一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）80～1 500；信息依賴式采集（information-dependent acqusition，IDA）設(shè)置響應(yīng)值超過(guò)100 cps的8個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為m/z 50～1 500。

2.1.5 化學(xué)成分解析 在CNKI、PubChem、ChemSpider等數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢五味子中化學(xué)成分的名稱、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)式等信息，建立五味子成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。將UPLC-Q-TOF-MS/MS分析中化學(xué)成分的一級(jí)離子峰、二級(jí)碎片離子及保留時(shí)間等信息與所建立的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)結(jié)合對(duì)照品數(shù)據(jù)信息和文獻(xiàn)資料對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。

2.2 不同批次五味子水煎液治療過(guò)敏性哮喘的藥效比較研究

2.2.1 試藥的制備 取10批五味子樣品，分別按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備浸膏。取適量浸膏加水溶解，制成質(zhì)量濃度為0.9 g/mL（按生藥量計(jì)）的灌胃溶液，并記為C1～C10。

2.2.2 大鼠過(guò)敏性哮喘模型的建立及給藥 取SD大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥（百令膠囊）組和10批樣品給藥組，分別編號(hào)為A1～A13組，每組8只。除A1組外，其余各組大鼠均參照文獻(xiàn)[12－13]方法造模：分別于實(shí)驗(yàn)第1、8、14天腹腔注射新鮮配制的生理鹽水混懸液[含OVA 60 mg（5%）和氫氧化鋁凝膠100 mg（10%）]，每次每只大鼠注射1 mL。并從實(shí)驗(yàn)第15天起連續(xù)16 d將大鼠放入自制霧化箱中，吸入含1%OVA的生理鹽水進(jìn)行霧化激發(fā)（20 min）。A1組以生理鹽水代替混懸液進(jìn)行腹腔注射和霧化激發(fā)。于實(shí)驗(yàn)第15天起，在霧化激發(fā)前，A1～A2組大鼠灌胃給予生理鹽水，A3組大鼠灌胃給予百令膠囊0.92 g/kg[本研究按成人（體質(zhì)量60 kg）百令膠囊的臨床用藥最大劑量9 g，換算成大鼠等效劑量約為0.92 g/kg]；A4～A13組大鼠分別灌胃給予10批五味子水煎液1.23 g/kg（以生藥量計(jì)），劑量依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。

2.2.3 大鼠一般行為學(xué)觀察 末次霧化1 h后，觀察各組大鼠的皮毛光澤度、精神狀態(tài)以及是否有呼吸急促、搔鼻、打噴嚏等現(xiàn)象。

2.2.4 血清中IFN-γ、IL-4和IgE含量測(cè)定 末次霧化1 h后，大鼠摘眼球取血（每只大約取5～8 mL），分別放于EP管中，在室溫條件下靜置30 min，然后以3 000 r/min離心15 min。用移液槍小心吸取上層血清，按試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定血清中IFN-γ、IL-4和IgE的含量。

2.3 不同批次五味子共有成分與血清藥效指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3.2 Pearson相關(guān)性分析 將各共有峰的峰面積定義為X，IFN-γ、IL-4和IgE的含量定義為Y，采用SPSS 25.0軟件對(duì)X和Y進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 不同批次五味子水煎液的UPLC-Q-TOF-MS/MS化學(xué)成分鑒定結(jié)果

在正離子模式下采集五味子不同批次樣品的質(zhì)譜信息，分別提取其基峰離子色譜圖（base peak chromato‐gram，BPC）并進(jìn)行疊加，BPC疊加圖見(jiàn)圖1。通過(guò)與相關(guān)文獻(xiàn)和對(duì)照品比對(duì)，最終在10批樣品間共確定21個(gè)共有峰（依次記為F1～F21），主要為木脂素類、有機(jī)酸類和倍半萜類化合物（表2）。

表2 10批五味子水煎液的共有成分

圖1 10批五味子樣品的BPC疊加圖和共有峰

3.2 不同批次五味子水煎液治療過(guò)敏性哮喘的藥效考察結(jié)果

3.2.1 一般行為學(xué)觀察結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)第1～14天腹腔注射OVA致敏期間，各組大鼠均沒(méi)有出現(xiàn)明顯癥狀；于實(shí)驗(yàn)第15天霧化激發(fā)開(kāi)始后，與A1組比較，A2組大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸急促、咳嗽、打噴嚏等現(xiàn)象，同時(shí)伴有皮毛無(wú)光澤、身體消瘦、精神不振、蜷臥等癥狀。給藥前，A3～A13組大鼠的一般情況與A2組大鼠無(wú)明顯差別；給藥16 d后，A3～A13組大鼠皮毛顏色光亮，呼吸急促、咳嗽、打噴嚏和蜷縮等癥狀減輕，整體狀態(tài)得到改善。

3.2.2 血清中IFN-γ、IL-4和IgE含量測(cè)定結(jié)果 與A1組比較，A2組大鼠血清中IFN-γ含量顯著降低（P＜0.01），IL-4、IgE含量均顯著升高（P＜0.01）。與A2組比較，A3～A13組大鼠血清中IFN-γ含量均顯著升高（P＜0.01），IL-4、IgE含量均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠血清中IFN-γ、IL-4和IgE含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）

3.3 不同批次五味子共有成分與血清藥效指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果顯示，有11個(gè)峰與IFN-γ、IL-4和IgE關(guān)聯(lián)度的平均值（rˉ）＞0.8，這11個(gè)共有峰的平均關(guān)聯(lián)度大小為峰18＞峰9＞峰3＞峰7＞峰5＞峰4＞峰12＞峰6＞峰19＞峰17＞峰20。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，峰3～7、9、19、20與IFN-γ的含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），峰3～7、9、18～20與IL-4的含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），峰3、4、6、7、9、18～20與IgE的含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），該結(jié)果提示潛在的活性成分為峰3、4、6、7、9、19、20代表的成分。將上述2種分析結(jié)果取交集，最終篩選出峰3、4、6、7、9、19、20代表的成分可能為五味子治療過(guò)敏性哮喘的潛在藥效物質(zhì)（圖3）。

圖3 五味子各共有峰與藥效指標(biāo)灰色關(guān)聯(lián)度和Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

4 討論

過(guò)敏性哮喘是一種常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病。在變應(yīng)原誘導(dǎo)的哮喘中，IgE介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴的炎癥反應(yīng)機(jī)制起了主要作用。近年來(lái)，有學(xué)者提出哮喘發(fā)作與Th1/Th2類細(xì)胞因子比例失衡相關(guān)。哮喘發(fā)作時(shí)患者體內(nèi)Th1細(xì)胞亞群百分比降低，Th2細(xì)胞亞群百分比升高，導(dǎo)致Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如IFN-γ）的表達(dá)量降低，Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如IL-4）的表達(dá)量升高。Th1/Th2比例失衡，致使Th2細(xì)胞過(guò)度分化，這將會(huì)誘導(dǎo)B細(xì)胞合成IgE，同時(shí)抑制T細(xì)胞向Th1分化，進(jìn)而加劇Th1/Th2比例失衡[20―21]。因此，本研究選擇 IFN-γ、IL-4和IgE含量作為指標(biāo)來(lái)進(jìn)行治療過(guò)敏性哮喘的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。在本研究中，A2組大鼠出現(xiàn)呼吸急促、咳嗽、精神不振等哮喘相關(guān)癥狀，同時(shí)血清中IFN-γ含量顯著低于A1組，IL-4和IgE含量均顯著高于A1組。然而相比于A2組，A3～A13組大鼠喘咳等癥狀明顯減輕，血清中IFN-γ含量均顯著升高，IL-4和IgE含量均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，10批不同產(chǎn)地五味子均能夠改善過(guò)敏性哮喘模型大鼠Th1/Th2比例的失衡，進(jìn)而抑制IgE生成，減輕呼吸道炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度和Pearson相關(guān)性分析結(jié)果，推測(cè)出五味子醇甲、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛M2、戈米辛J、前戈米辛和當(dāng)歸酰戈米辛H這7種成分可能為五味子治療過(guò)敏性哮喘的有效成分。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，筆者發(fā)現(xiàn)五味子醇甲有舒緩氣道平滑肌的作用[22]，且可能通過(guò)阻斷鈣離子通道發(fā)揮作用[22]。五味子乙素可通過(guò)減少嗜酸性粒細(xì)胞，抑制氧化應(yīng)激，改善肺部炎癥因子表達(dá)，改善哮喘癥狀[23]。呂希等[24]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究篩選出五味子丙素為五味子中治療哮喘的靶標(biāo)成分，這與本研究結(jié)果相互印證。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究這7種成分治療過(guò)敏性哮喘的藥效和機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支持和理論支撐。

綜上，本研究運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析得到10批五味子水煎液之間的21個(gè)共有成分，并結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，采用相關(guān)性分析方法篩選出五味子醇甲、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛M2、戈米辛J、前戈米辛和當(dāng)歸酰戈米辛H可能為五味子治療過(guò)敏性哮喘的藥效物質(zhì)。但此結(jié)果僅根據(jù)藥效指標(biāo)與共有峰峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后得出的，具有一定的片面性和不確定性，有待于進(jìn)一步建立動(dòng)物哮喘模型進(jìn)行驗(yàn)證。

（利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突）