李旭，郝迪，王梓，李楠 （天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

心腎綜合征（cardiorenal syndrome，CRS）指心臟和腎臟中一個(gè)器官對(duì)另一個(gè)器官的功能損害不能進(jìn)行代償時(shí)，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致心臟和腎臟功能的共同損害；其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，心腎纖維化是其終末期的主要病理改變，目前尚無(wú)特效藥物進(jìn)行治療[1―3]。姜黃素（curcumin，Cur）可減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化和腎間質(zhì)纖維化[4―5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Cur還可改善CRS模型大鼠的心肌肥大、腎功能以及肺組織損傷[6]。Cur的生物利用度極低（＜1%）且難溶于水（溶解度為0.6 μg/mL），在生理pH下的吸收和穩(wěn)定性較差，且代謝快、易消除[7―8]，從而限制了其體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用。

固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）以脂質(zhì)作為載體材料將藥物包裹在其中，可避免藥物與外界環(huán)境接觸，增加藥物的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)藥物的半衰期，從而提高藥物的生物利用度[9―11]。本課題組前期采用微乳法制備了Cur-SLN[12]，現(xiàn)采用尾靜脈注射Cur-SLN的方法，觀察Cur在大鼠心、腎、肺和肝組織的分布情況，以期為Cur-SLN治療CRS的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-2010型高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadzu公司），XW-80A型渦旋混合儀（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），XW-80A型定時(shí)恒溫磁力攪拌器（上海瀘西分析儀器廠），PHS-3C型精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），SZ-100型納米粒度儀（日本Horiba公司），AB135型十萬(wàn)分之一電子天平、AL204型萬(wàn)分之一電子分析天平、PL203型精密電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

Cur對(duì)照品、大黃素對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)分別為110823-201004、110756-200110，純度均大于98%）；Cur原料藥（批號(hào)TZSW200317-1，純度99.0%）購(gòu)自西安通澤生物科技有限公司；其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為娃哈哈純凈水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，共90只，雄性，體質(zhì)量220～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0006。所用動(dòng)物均活動(dòng)正常且毛發(fā)柔順，攝食、飲水均正常。本研究獲得天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)為IMPS-EAEP-Z-18JCQNJC13500-01。

2 方法與結(jié)果

2.1 Cur-SLN混懸液的制備

參考本課題組前期方法制備Cur-SLN混懸液[12]：稱(chēng)取處方量的Cur和硬脂酸，于65 ℃熔化，加入2 mL相同溫度的聚山梨酯80-乙醇溶液（質(zhì)量比1∶4）和8 mL水，渦旋1 min，即得水包油型微乳。在電磁攪拌（1 020 r/min）下，將上述熱微乳以每5 s 1滴的速度滴入2 ℃的分散介質(zhì)水中，當(dāng)微乳全部加入后繼續(xù)以2 ℃保溫?cái)嚢?5 min，即得Cur-SLN混懸液（每毫升Cur-SLN中含Cur原料藥約0.77 mg，載藥量為7.72%，包封率為87.73%）。本研究所制Cur-SLN的理化性質(zhì)良好，平均粒徑為（168.9±1.0） nm，Zeta電位為－（19.60±0.35） mV，多分散系數(shù)為0.212±0.020。

2.2 生物樣品中Cur含量測(cè)定方法的建立

采用HPLC法檢測(cè)大鼠各組織樣品中Cur的含量。

2.2.1 色譜條件 以DIKMA Diamonsil C18（250 mm×4.6 μm，5 mm）為色譜柱，以乙腈-0.50%磷酸溶液（58∶42，V/V）為流動(dòng)相；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為426 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）Cur對(duì)照品貯備液：精密稱(chēng)取Cur對(duì)照品13.21 mg于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.321 mg/mL的Cur對(duì)照品貯備液，于4 ℃冰箱中保存。臨用前用甲醇稀釋制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）大黃素對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)大黃素對(duì)照品20 mg于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為200 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃避光保存。

2.2.3 組織樣品的處理 將大鼠的心、肺、腎和肝剪碎后，按照稱(chēng)定質(zhì)量的2倍加入生理鹽水勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 000 r/min離心10 min，吸取上清液180 μL，精密加入大黃素對(duì)照品溶液20 μL、乙酸乙酯-甲醇混合溶劑（體積比為9∶1）1 mL，渦旋3 min后，以12 000 r/min離心10 min；小心吸取上層有機(jī)溶劑900 μL轉(zhuǎn)移至另一離心管中，以氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)蛹状?00 μL復(fù)溶，渦旋2 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣測(cè)定。

2.2.4 專(zhuān)屬性考察 取空白心、肺、腎和肝組織樣品，各空白組織+Cur（0.647 5 μg/mL）樣品以及大鼠給藥后0.5 h的組織樣品各適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理（空白組織樣品不需要添加內(nèi)標(biāo)）后，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，Cur和大黃素的保留時(shí)間分別約為10.1、15.0 min，2個(gè)色譜峰互不干擾且峰形良好，理論板數(shù)以Cur和大黃素計(jì)均不低于2 000，且各樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾Cur的測(cè)定，表明該色譜條件下專(zhuān)屬性良好。結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 空白組織樣品的HPLC圖

圖2 空白組織+Cur+內(nèi)標(biāo)的HPLC圖

圖3 給藥后0.5 h各組織樣品+內(nèi)標(biāo)的HPLC圖

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系、定量下限、檢測(cè)限的考察 取質(zhì)量濃度為1.321 mg/mL的Cur對(duì)照品貯備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為1 295.00、647.50、323.75、129.50、64.75、12.95、6.475、1.295、0.647 5 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取心、腎和肝組織的空白勻漿液180 μL，加入上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，然后按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，即得Cur質(zhì)量濃度分別為129.5、64.75、32.375、12.95、6.475、1.295、0.647 5、0.129 5、0.064 75 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)心、腎、肝組織樣品溶液。同法精密吸取肺組織空白勻漿液，加入647.50、323.75、129.50、64.75、12.95、6.475、1.295、0.647 5 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，同前處理，得Cur質(zhì)量濃度分別為64.75、32.375、12.95、6.475、1.295、0.647 5、0.129 5、0.064 75 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)肺組織樣品溶液。將上述組織樣品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以組織樣品中Cur的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、Cur與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，以線(xiàn)性范圍最低值為定量下限，以信噪比3∶1計(jì)算檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同組織中Cur的線(xiàn)性關(guān)系、定量下限、檢測(cè)限的考察結(jié)果

2.2.6 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取Cur對(duì)照品適量，加入空白組織樣品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備含Cur定量下限質(zhì)量濃度的組織樣品溶液以及含Cur低、中、高質(zhì)量濃度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的組織樣品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備6份。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，考察各樣品中Cur質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；連續(xù)3 d進(jìn)樣，考察批間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，各樣品日內(nèi)、日間RSD均小于15%（n＝6），準(zhǔn)確度均值在標(biāo)示值的±15%之內(nèi)，符合生物樣品定量分析的要求[13]。

2.2.7 提取回收率 按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制含Cur低、中、高質(zhì)量濃度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的組織樣品溶液，各6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄Cur峰面積（As）和大黃素（內(nèi)標(biāo)）峰面積（Ai）。另取空白組織樣品，同法預(yù)處理至氮?dú)獯蹈?，在殘?jiān)屑尤氲?、中、高質(zhì)量濃度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的Cur對(duì)照品貯備液20 μL，大黃素對(duì)照品溶液20 μL、甲醇60 μL，渦旋2 min；以12 000 r/min離心10 min，各質(zhì)量濃度平行6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄未經(jīng)提取的Cur峰面積（As’）和大黃素峰面積（Ai’）。分別計(jì)算Cur和大黃素的提取回收率：Cur提取回收率（%）＝As/As’×100%；大黃素提取回收率（%）＝Ai/Ai’×100%。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度的Cur在心臟組織中的提取回 收 率 分 別 為（89.72±2.13）% 、（92.68±0.74）% 、（97.31±1.45）%，在肺組織中分別為（91.77±1.86）%、（96.27±1.07）%、（98.11±0.37）%，在腎組織中分別為（90.56±2.64）%、（95.19±0.93）%、（97.81±0.11）%，在肝組織中分別為（93.80±3.62）%、（97.77±1.07）%、（95.46±3.47）%，RSD均小于5%（n＝6）；大黃素在心、肺、腎、肝組織中的提取回收率分別為95.21%、94.38%、96.12%、95.72%，RSD均小于4%（n＝6），符合生物樣品定量分析的要求[13]。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備含Cur低、中、高質(zhì)量濃度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的組織樣品溶液，各3份，考察其于25 ℃放置24 h、－40 ℃放置24 h、反復(fù)凍融（－40 ℃～室溫）3次的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各樣品測(cè)得質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的相對(duì)誤差（RE）均在±15%范圍內(nèi)，提示樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好[13]。

2.3 Cur-SLN在大鼠心、腎、肺、肝組織的分布考察

2.3.1 分組、給藥與樣品采集 將大鼠隨機(jī)分為Cur原料藥組和Cur-SLN組，每組45只。于給藥前12 h開(kāi)始禁食不禁水，參考文獻(xiàn)[14―15]給藥方法，兩組大鼠分別尾靜脈注射Cur原料藥混懸液（以含0.5%聚山梨酯80的生理鹽水溶液溶解，臨用現(xiàn)配）和Cur-SLN混懸液，以Cur計(jì)注射劑量為25 mg/kg。分別于給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h時(shí)，各組分別取5只大鼠用乙醚麻醉，然后處死，解剖分離大鼠的心、肺、腎和肝組織，用生理鹽水將組織表面的殘血洗凈，定性濾紙吸干后精確稱(chēng)質(zhì)量，然后置于離心管內(nèi)，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 Cur-SLN給藥后的組織分布 取給藥后不同時(shí)間點(diǎn)各組織樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)各組織樣品中Cur的含量。采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果顯示，與Cur原料藥相應(yīng)組織樣品組比較，Cur-SLN組大鼠心、腎、肺（0.25～24 h各時(shí)間點(diǎn)）和肝（0.25～1 h、12～24 h各時(shí)間點(diǎn)）組織樣品中Cur的含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；而肝（2～8 h各時(shí)間點(diǎn)）組織樣品中Cur的含量則顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠給藥不同時(shí)間點(diǎn)后各組織樣品中Cur含量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝5，μg/mL）

表2 各組大鼠給藥不同時(shí)間點(diǎn)后各組織樣品中Cur含量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝5，μg/mL）

a：與Cur原料藥組同時(shí)間點(diǎn)同組織樣品比較，P＜0.05；b：與Cur原料藥組同時(shí)間點(diǎn)同組織樣品比較，P＜0.01

樣品Cur原料藥組心臟組織Cur原料藥組肺組織Cur原料藥組腎組織Cur原料藥組肝組織Cur-SLN組心臟組織Cur-SLN組肺組織Cur-SLN組腎組織Cur-SLN組肝組織24 h 0.41±0.21 0.23±0.12 1.63±0.35 0.62±0.10 12.57±0.43b 11.24±0.81b 10.92±1.01b 7.82±0.59b 0.25 h 2.67±1.25 0.95±1.34 7.21±2.99 1.82±0.35 7.19±1.18a 13.35±1.13b 18.95±0.31b 25.07±1.17b 0.5 h 6.46±1.87 2.98±1.78 13.32±1.62 8.77±0.40 16.42±1.97b 27.12±1.79b 32.97±1.43b 32.63±0.86b 1 h 13.24±2.51 4.35±1.01 18.09±7.27 42.17±1.17 36.79±0.41b 31.63±0.33b 42.51±2.12b 47.17±1.35b 2 h 16.34±4.11 8.21±0.92 21.75±1.24 75.40±2.21 43.84±0.55b 44.97±0.21b 57.35±3.61b 67.77±1.40b 4 h 12.72±1.44 4.86±1.02 13.35±0.46 120.43±1.92 50.12±3.99b 49.21±0.27b 63.38±1.41b 75.43±0.76b 6 h 7.31±1.23 3.77±0.56 10.13±0.31 63.73±1.40 68.91±0.46 b 56.42±2.30b 80.64±2.49b 52.14±1.57b 8 h 3.92±1.31 2.18±1.59 6.46±1.25 28.87±1.25 21.32±0.68b 22.62±0.39b 25.31±2.23b 23.47±0.93b 12 h 1.09±0.12 0.59±1.20 5.42±1.98 3.48±0.30 16.41±2.11b 17.21±0.61b 16.51±3.17a 10.01±0.73b

3 討論

納米技術(shù)的迅速發(fā)展為人類(lèi)很多重大疾病的治療提供了新機(jī)會(huì)。納米藥物能夠提高難溶性藥物的有效性和安全性，在藥物遞送系統(tǒng)中起著非常重要的作用[16]。Cur具有多種藥理活性，且毒性低、藥源充足，但其生物利用度低，限制了其在臨床中的應(yīng)用[17]。SLN是一種針對(duì)低生物利用度活性成分的理想遞藥系統(tǒng)[18]，能在一定程度上提高藥物的生物利用度。

本課題組前期采用微乳法制備了Cur-SLN，并對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)和體外釋藥研究，其包封率為87.73%、載藥量為7.72%、平均粒徑為（168.9±1.0） nm、多分散系數(shù)為0.212±0.02[12]，表明本課題組所制的Cur-SLN粒度均勻，理化性質(zhì)良好。本研究以Cur原料藥為參照，采用大鼠尾靜脈給藥后，考察Cur-SLN在大鼠心、腎、肺和肝組織中的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Cur原料藥組比較，Cur-SLN組大鼠心、腎、肺（0.25～24 h各時(shí)間點(diǎn)）和肝（0.25～1 h、12～24 h各時(shí)間點(diǎn)）組織樣品中Cur的含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；而肝（2～8 h各時(shí)間點(diǎn)）組織樣品中Cur的含量則顯著降低（P＜0.01）。由此可知，采用SLN負(fù)載Cur后，增加了Cur在心、腎、肺組織中的分布，延長(zhǎng)了其在心、腎、肺組織中的相對(duì)滯留時(shí)間，有利于提高Cur在體內(nèi)的生物利用度。靜脈給藥1 h后，Cur在肝組織中的分布先明顯減少，12 h后又顯著增加，這可能是由于各個(gè)組織中的藥物濃度和藥量分布是一個(gè)變化的過(guò)程，帶負(fù)電荷的SLN易在肝組織中蓄積，從而出現(xiàn)肝組織藥物分布的雙峰現(xiàn)象。

綜上所述，本研究將Cur制成SLN后，增加了其在心、腎、肺組織的分布。