皮美辰 陳文馨 柳周 汪長(zhǎng)華 孫圣榮

乳腺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的女性原發(fā)惡性腫瘤之一[1]，在20～59歲女性中的發(fā)病率居于首位，并且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)[2]。尋找乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展的新機(jī)制，為乳腺癌治療探索方向顯得尤為重要。N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(NDRG2)蛋白是N-myc下游調(diào)節(jié)基因家族的成員，在惡性腫瘤的增殖、分化和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3]。巨噬細(xì)胞由于其巨大的可塑性，在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[4]。乳腺微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可在不同刺激下極化為抑瘤型M1或促瘤型M2。M2型巨噬細(xì)胞被認(rèn)為與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)[5]。探究巨噬細(xì)胞極化導(dǎo)致乳腺癌進(jìn)展的機(jī)制或許能為乳腺癌治療帶來(lái)新的方向。

材料與方法

一、材料與方法

1.病人樣本：本研究獲得了武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)2018K-C09)。實(shí)驗(yàn)使用的所有乳腺癌及癌旁組織標(biāo)本均來(lái)自武漢大學(xué)人民醫(yī)院。

2.細(xì)胞共培養(yǎng)：在孔徑為0.4 μm的Transwell培養(yǎng)板(Millipore)中進(jìn)行小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞和小鼠乳腺癌細(xì)胞4T-1共培養(yǎng)，上室為RAW264.7細(xì)胞，下室為4T-1細(xì)胞。共培養(yǎng)48小時(shí)后，對(duì)乳腺癌細(xì)胞4T-1進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。

3.生物信息學(xué)分析：乳腺癌病人的mRNA數(shù)據(jù)譜和臨床病理特征來(lái)自癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)。

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：含有小鼠NDRG2野生型(WT)或NDRG2突變型(MUT)的質(zhì)粒購(gòu)自GeneChem Biotechnology公司。靶向小鼠NDRG2的小干擾RNA(siRNA)由QIAGEN公司合成。根據(jù)生產(chǎn)商的方案，使用Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)中使用的siRNA及其配對(duì)對(duì)照最有效的序列如下：5′-CCGUGGUGGAAUGUAACUCAATT-3′， 5′-CAGGAAGAGCUUUCUGGAAAUTT-3′。

5.細(xì)胞增殖：經(jīng)過(guò)前期處理后，按每孔2 000個(gè)將4T-1細(xì)胞鋪于96孔板中，培養(yǎng)3天。每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育細(xì)胞2小時(shí)，然后在450 nm處測(cè)定樣品的吸光度。

6.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：將共培養(yǎng)完成的乳腺癌細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至100%匯合度時(shí)，用200 μl移液器吸頭劃破細(xì)胞層，細(xì)胞表面可見(jiàn)一直線劃痕，在0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)分別用顯微鏡觀察劃痕并拍照，使用Image J軟件測(cè)量劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。

7.Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲：方法如前所示[6]。Western blot方法如前所示[6]。

二、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

1.NDRG2在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與不良預(yù)后的關(guān)系：從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘NDRG2 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，NDRG2在乳腺癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)低于正常乳腺組織(圖1A)。用Western blot法檢測(cè)乳腺癌病人癌組織和癌旁組織樣本發(fā)現(xiàn)，與生物分析結(jié)果一致，NDRG2在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織。(圖1B～C)。生存分析顯示，無(wú)論是總生存期(overall survival，OS)，還是無(wú)復(fù)發(fā)生存期(relapse-free survival，RFS)，NDRG2低水平組都比NDRG2高水平組的預(yù)后差(圖1D)。

2.NDRG2與乳腺癌病人臨床病理特征的關(guān)系：依據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析顯示，NDRG2的表達(dá)與乳腺癌病人的性別、轉(zhuǎn)移、分期和分子分型有關(guān)。男性乳腺癌病人和出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌病人表現(xiàn)出更低的NDRG2水平(圖2A～B)。與其他分型比較，HER2陽(yáng)性型的乳腺癌病人表現(xiàn)出最低的NDRG2水平(圖2C)，并且隨著腫瘤進(jìn)展，NDRG2的水平持續(xù)下降(圖2D)。

3.NDRG2敲低促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化：為了探究NDRG2對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，用NDRG2 siRNA和其配對(duì)對(duì)照(scramble siRNA)轉(zhuǎn)染了Raw264.7巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示，與scramble siRNA組相比，NDRG2 siRNA組M2型巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志物CD206的表達(dá)顯著增加，M1型巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志物CD80的表達(dá)顯著降低(圖3A～B),這表明巨噬細(xì)胞內(nèi)NDRG2敲低會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化。

4.NDRG2G過(guò)表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化：為了加強(qiáng)結(jié)論，我們還利用含有NDRG2 cDNA的質(zhì)粒過(guò)表達(dá)這個(gè)基因觀察巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的改變。見(jiàn)圖4A～B。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，NDRG2過(guò)表達(dá)組CD206的表達(dá)被顯著抑制，CD80的表達(dá)卻增加。表明NDRG2過(guò)表達(dá)會(huì)抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化。

5.巨噬細(xì)胞內(nèi)NDRG2缺失促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移：為了探究NDRG2是否能通過(guò)影響微環(huán)境免疫狀態(tài)的改變而影響乳腺癌進(jìn)展，我們模擬乳腺微環(huán)境將巨噬細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞4T-1共培養(yǎng)以觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)NDRG2的缺失對(duì)4T-1細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響，結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞內(nèi)NDRG2的缺失顯著增加了乳腺癌細(xì)胞4T-1的增殖、遷移和侵襲(圖5A～C)。

6.巨噬細(xì)胞內(nèi)NDRG2過(guò)表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移：為了加強(qiáng)結(jié)論，用含有NDRG2 cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞以過(guò)表達(dá)NDRG2，隨后再與4T-1細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，NDRG2過(guò)表達(dá)組乳腺癌細(xì)胞4T-1的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制(圖6A～C)?？傊@些結(jié)果表明乳腺腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞NDRG2的減少促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

A.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌病人與正常人中NDRG2 mRNA的表達(dá)。B、C.Western blotting檢測(cè)乳腺癌組織及配對(duì)癌旁組織中NDRG2蛋白表達(dá)。D.NDRG2表達(dá)對(duì)乳腺癌OS及RFS的影響。aP<0.01，bP<0.0001

圖2 NDRG2表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移、性別、腫瘤分期和分子亞型的關(guān)系。aP<0.05，bP<0.001，cP<0.000 1

A、B.Raw264.7細(xì)胞系中NDRG2的敲低效率，NDRG2敲低對(duì)巨噬細(xì)胞生物標(biāo)志物CD80和CD206蛋白水平的影響。aP<0.01，bP<0.001

A、B.Raw264.7細(xì)胞系中NDRG2的敲低效率，NDRG2敲低對(duì)巨噬細(xì)胞生物標(biāo)志物CD80和CD206蛋白水平的影響。aP<0.05，bP<0.01圖4 過(guò)表達(dá)NDRG2抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化

A.通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖。B.通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定遷移(×40)。C.通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定侵襲(×200)。aP<0.05，bP<0.001

A.通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖。B.通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定遷移(×40)。C.通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定侵襲(×200)。aP<0.01，bP<0.000 1。圖6 過(guò)表達(dá)巨噬細(xì)胞內(nèi)NDRG2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

討論

目前，乳腺癌已經(jīng)成為全球女性中最常見(jiàn)的癌癥[7-8]。 巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞類型之一。因?yàn)闃O好的清除和修復(fù)作用，巨噬細(xì)胞對(duì)于先天性免疫應(yīng)答至關(guān)重要。然而，當(dāng)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞時(shí)，這些作用反而會(huì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[9-10]。巨噬細(xì)胞能在不同的刺激條件下極化為經(jīng)典的M1抗腫瘤表型或替代激活的M2促腫瘤表型，M2巨噬細(xì)胞的聚集往往代表著不良臨床預(yù)后[11]。因此，闡明巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制及對(duì)乳腺癌的影響對(duì)乳腺癌預(yù)后改善具有積極意義。

生信分析的結(jié)果表明，NDRG2可能在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用。乳腺癌組織中存在大量的巨噬細(xì)胞，組織中NDRG2 mRNA的變化可能也包括巨噬細(xì)胞中NDRG2 mRNA的變化，由于NDRG2水平改變會(huì)影響巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的改變，而巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)又會(huì)直接影響乳腺微環(huán)境的免疫狀態(tài)。所以本研究進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)以探究巨噬細(xì)胞內(nèi)NDRG2下調(diào)對(duì)乳腺癌進(jìn)展的影響。結(jié)果表明，NDRG2缺失不僅促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化還促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

乳腺癌中NDRG2表達(dá)下調(diào)，NDRG2缺失促進(jìn)微環(huán)境中巨噬細(xì)胞向M2型極化隨后促進(jìn)乳腺癌的增殖、遷移和侵襲。