吳雅瓊，張春紅，楊海燕，閭連飛，李維林，吳文龍*

（1 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所 果樹研究中心 南京 210014 2 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037）

樹莓是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）重要經(jīng)濟(jì)林小漿果類落葉灌木，又名覆盆子、山莓果和懸鉤子等，是世界四大小漿果類型之一，亦是新興的第3 代水果之王[1-3]。樹莓的適應(yīng)性較強(qiáng)，栽培和管理相對粗放，且產(chǎn)量穩(wěn)定，結(jié)果較早，定植第2年即可結(jié)果，經(jīng)濟(jì)收益可觀。樹莓果實(shí)富含多種維生素、 氨基酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，樹莓的根、莖和葉皆可入藥，樹莓提取物具有降血糖、抗氧化、抗菌和抗癌等作用[3-4]。 樹莓除鮮食外，還可加工成果汁、果醬、果醋、果酒和果粉等產(chǎn)品，深受人們的喜愛[5-6]。隨著人們生活水平的提高，藥用產(chǎn)業(yè)和食品加工業(yè)的不斷發(fā)展，如何充分利用樹莓中的各種次生代謝物，已成為研究重點(diǎn)。按照樹莓果實(shí)成熟時(shí)的顏色，分為紅樹莓、黃樹莓、紫樹莓和黑樹莓4 類[7]。分析不同類型樹莓果實(shí)內(nèi)含物的差異，可為其差異化精深加工利用提供重要參考。

植物中的代謝物質(zhì)既包括糖類、 氨基酸和蛋白質(zhì)等初級(jí)代謝物，又包含黃酮類等多酚化合物和萜類化合物等重要次生代謝物，這些物質(zhì)經(jīng)過研究和提取具有不同的藥理作用[8]。樹莓功能因子中關(guān)于花色苷的研究最多，研究表明隨著果實(shí)成熟度的增加，花色苷的種類和含量不斷豐富和提高；花色苷有抗氧化和抗癌等作用，也可作為天然的食品著色劑，保證花色苷的生物利用率，助于綜合開發(fā)利用[5，9]。 吳繼軍等[10]利用固相微萃取-氣質(zhì)譜聯(lián)用方法對紅樹莓和黃樹莓揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行差異研究，得出黃樹莓的揮發(fā)性成分比紅樹莓復(fù)雜。 代謝組學(xué)是對某一生物或細(xì)胞在特定生理或發(fā)育狀態(tài)下，所有低分子量代謝同時(shí)進(jìn)行定量和定性分析的一門學(xué)科，是定量評價(jià)果蔬品質(zhì)的有效途徑之一[11]。 基于質(zhì)譜平臺(tái)的檢測方式是現(xiàn)階段代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)展的主要方向[12]。 本文采用非靶向LC-MS 檢測方法對紅樹莓和黃樹莓的初生代謝物和次生代謝物進(jìn)行比較分析，明確主要的差異代謝物質(zhì)和代謝富集通路，以期為樹莓的藥物研究和開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

紅樹莓品種‘Heritage’ 和黃樹莓品種‘Colde Summit’成熟果實(shí)，于2020年6月采收。 每株取3個(gè)果實(shí)為1 個(gè)重復(fù)，3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。 采樣試驗(yàn)地位于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所的溧水科研基地（31°35′ N，119°09′ E）。

甲醛 （≥99.0%）、 乙腈 （≥99.9%），Thermo Fisher Scientific（美國）；2-氯苯丙氨酸（98.5%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸（LC-MS grade），Tokyo Chemical Industry （日本）； 甲酸銨（≥99.9%），Sigma （美國）； 雙蒸水，Millipore （美國）。

1.2 儀器及設(shè)備

H1650-W 冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；QL-866 混勻儀，北京海天友誠科技有限公司； 昆山舒美KQ-100TDV 高頻超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SCIENTZ-48高通量研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；0.2 μm 聚四氟乙烯（PTFE）微孔濾膜，天津津騰有限公司。

1.3 樣品處理和代謝物提取

精確稱取樣本200 mg 后，加入0.6 mL L-2-氯苯丙氨酸（4 ppm），渦旋振蕩30 s 后放入研磨儀中50 Hz 研磨1 min，超聲輔助提取15 min，25 ℃下12 000 r/min 離心10 min，取上清液300 μL，0.22 μm 膜過濾，濾液移入檢測瓶，上樣，進(jìn)行LCMS 檢測。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：采用Thermo Vanquish 儀器，使用ACQUITY UPLCRHSS T3 1.8 μm （2.1 mm×150 mm）色譜柱，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度8 ℃，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL，梯度洗脫具體參數(shù)參見Wu 等[13]的研究方法。

質(zhì)譜條件：使用Thermo Q Exactive Focus 儀器，電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。 毛細(xì)管溫度325 ℃，以分辨率70 000 進(jìn)行全掃描，掃描范圍81～1 000，并采用HCD 進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無必要的MS/MS 信息[14]。

1.5 代謝物的定性、定量分析

為進(jìn)一步了解黃樹莓和紅樹莓化學(xué)成分的差異，對兩組樣品進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用無監(jiān)督的PCA 對兩組樣本間的總體分布進(jìn)行分析。PLS-DA和OPLS-DA 對各組間代謝輪廓的總體差異分析，并找到組間的差異代謝物。此外，采用變量權(quán)重值VIP＞1 和P＜0.05 為識(shí)別差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)，并對差異代謝物通過KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析模型的建立

為了解紅樹莓和黃樹莓果實(shí)中化學(xué)成分的差異，對這兩組樣品進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。無監(jiān)督的主成分分析 （Principal component analysis，PCA）表明，在正離子模式下的前2 個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率為PC1=38.7%，PC2=19.6%，共解釋了58.3%的原始變量信息（圖1a）；而在負(fù)離子模式下的前2 個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率為PC1=38.9%，PC2=22%，能夠代表解釋60.9%的原始變量信息（圖1b）。 PCA 得分圖還直觀地反映出黃樹莓在坐標(biāo)軸的負(fù)方向，而紅樹莓在坐標(biāo)軸的正方向上，二者分別位于坐標(biāo)軸的兩側(cè)，說明黃樹莓和紅樹莓的成熟果實(shí)間的代謝物存在明顯差異。

圖1 黃樹莓和紅樹莓的PCA 分析圖Fig.1 PCA analysis of yellow raspberry and red raspberry

由于PCA 是無監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)分析，主成分是模糊的，不能忽略組內(nèi)誤差和消除隨機(jī)誤差，所以需要采用有監(jiān)督模式識(shí)別的多元統(tǒng)計(jì)方法偏最小二乘判別分析 （Partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA） 和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least -squares discrimination analysis，OPLS-DA）。PLS-DA 可以使組間區(qū)分最大化，有利于尋找差異代謝物，在正離子模式下t1=39%，負(fù)離子模式下t1=31%（圖2a 和2c）。 此外，在確定黃樹莓和紅樹莓果實(shí)的差異成分時(shí)，還需要采用有監(jiān)督的OPLS-DA。 OPLS-DA 分析是以變量的重要性為主要依據(jù)，從而對代謝物質(zhì)進(jìn)行選擇和甄別，更能把握多位數(shù)據(jù)整體的特征以及變異規(guī)律。 OPLS-DA 得分圖顯示 （圖2b 和2 d），正離子模式下R2X=0.578，R2Y=1，Q2Y=0.902；負(fù)離子模式下R2X=0.713，R2Y=0.995，Q2Y=0.709，這些模型參數(shù)指數(shù)均大于0.5，符合試驗(yàn)數(shù)據(jù)模型的預(yù)期，說明建立的OPLS-DA 模型可以有效地說明黃樹莓和紅樹莓成熟果實(shí)中代謝產(chǎn)物的差異和區(qū)別。 通過OPLS-DA 置換驗(yàn)證模型，發(fā)現(xiàn)該模型的可靠性良好（圖3a 和3c），基于載荷圖（Loading plot） 可以篩選出分類貢獻(xiàn)較大的變量，在正離子模式下P1=38%，pOrtho1=38%，而在負(fù)離子模式下P1=19.4%，pOrtho1=19.4%，且在橫坐標(biāo)方向上遠(yuǎn)離原點(diǎn)的變量對兩組樣本的區(qū)分貢獻(xiàn)更大（圖3b 和3d）。

圖2 黃樹莓和紅樹莓的PLS-DA 和OPLS-DA 分析圖Fig.2 PLS-DA and OPLS-DA analysis of yellow raspberry and red raspberry

圖3 黃樹莓和紅樹莓的OPLS-DA 置換檢驗(yàn)圖和載荷圖Fig.3 OPLS-DA displacement test and loading plot diagram of yellow raspberry and red raspberry

2.2 差異代謝物初步分析

基于LC-MS 的代謝物質(zhì)測定和多元統(tǒng)計(jì)分析，在正離子模式下從紅樹莓和黃樹莓成熟果實(shí)中共發(fā)現(xiàn)708 個(gè)差異代謝物質(zhì)，其中98 個(gè)為已知化合物，黃樹莓果實(shí)中有422 個(gè)差異代謝物含量顯著高于紅樹莓，286 個(gè)差異代謝物顯著低于紅樹莓（圖4a）。在負(fù)離子模式下，從紅樹莓和黃樹莓成熟果實(shí)中共發(fā)現(xiàn)780 個(gè)差異代謝物質(zhì)，其中45個(gè)差異代謝物質(zhì)為已知化合物，有515 個(gè)代謝物在黃樹莓中的含量比紅樹莓高（圖4b）。 正離子模式下，有10 個(gè)差異代謝物為羧酸及其衍生物（Carboxylic acids and derivatives），8 個(gè)為類黃酮（Flavonoids），7 個(gè) 為有機(jī)氧化物（Organooxygen compounds）。 負(fù)離子模式下，有7 個(gè)代謝物為有機(jī)氧化物，3 個(gè)為類黃酮化合物，3 個(gè)為羧酸及其衍生物。

圖4 黃樹莓和紅樹莓差異代謝物的熱點(diǎn)圖Fig.4 Hot spot of differentially expressed metabolites between yellow raspberry and red raspberry

2.3 代謝通路相關(guān)主要代謝物分析

通過KEGG 數(shù)據(jù)庫的代謝富集分析，將黃樹莓和紅樹莓成熟果實(shí)中的代謝物進(jìn)行歸類。 結(jié)果表明，有1 566 個(gè)差異代謝物質(zhì)富集在4 大類別上，即新陳代謝（Metabolism，10 個(gè)亞類）、遺傳信息處理 （Genetic information processing，2 個(gè) 亞類）、 環(huán)境信息處理 （Environmental information processing，2 個(gè)亞類） 和人類疾病 （Human diseases，包含1 個(gè)差異代謝物在內(nèi)分泌和代謝性疾病Endocrine and metabolic diseases 亞類中）（圖5a）；紅樹莓和黃樹莓果實(shí)中的差異代謝物質(zhì)共富集在66 個(gè)通路上，前20 個(gè)通路如圖5b 所示，其中34 個(gè)主要差異代謝物質(zhì)分布在代謝途徑上（Metabolic pathways，ko01100），25 個(gè)差異代謝物與次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites，ko01110）相關(guān)，14 個(gè)差異代謝物與不同環(huán)境中的微生物代謝（Microbial metabolism in diverse environments，ko01120）相關(guān)，14 個(gè)差異代謝物與抗生素的生物合成（Biosynthesis of antibiotics，ko01130） 相關(guān)，12 個(gè)差異代謝物與花色苷生物合成（Anthocyanin biosynthesis，ko00942）相關(guān)。

圖5 黃樹莓和紅樹莓差異代謝物的KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed metabolites in yellow raspberry and red raspberry

2.4 果實(shí)顏色相關(guān)的主要差異代謝物分析

果實(shí)顏色的差異主要是花色苷、類胡蘿卜素、丙氨酸、 葉綠素、 黃酮等各種色素占比不同決定的，而這些物質(zhì)的生物合成通路中主要代謝物的差異可能是引起黃樹莓和紅樹莓的果實(shí)顏色差異的主要原因。 對黃樹莓和紅樹莓果實(shí)中的花色苷合成通路、黃酮和黃酮醇生物合成通路、類胡蘿卜素合成通路、苯丙氨酸代謝通路、黃酮生物合成通路、 卟啉與葉綠素代謝通路上的差異代謝物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明黃樹莓果實(shí)中的飛燕草素葡萄糖苷（Delphinidin 3-glucoside）、脫落酸（（S）-Abscisic acid）、氫化肉桂酸（Hydrocinnamic acid）和橙皮素 （Hesperetin） 較紅樹莓果實(shí)中分別下調(diào)了-1.496，-1.632，-1.527 和-0.477 倍（表1）。花色苷生物合成通路中有11 個(gè)代謝物在黃樹莓果實(shí)中含量顯著較高。 4 個(gè)與黃酮和黃酮醇生物合成相關(guān)的代謝物在黃樹莓果實(shí)中含量較高。 卟啉與葉綠素代謝中的原葉綠酸（Protochlorophyllide）在黃樹莓果實(shí)中上調(diào)了10 倍以上。

表1 黃樹莓和紅樹莓果實(shí)著色相關(guān)的主要差異代謝物Table 1 Main differentially expressed metabolites related to fruit coloring of yellow raspberry and red raspberry

3 討論與結(jié)論

代謝組學(xué)分析能夠?qū)χ参飶?fù)雜多重復(fù)樣品的化合物進(jìn)行有效的質(zhì)量控制分析，從而避免未知組分引起各種問題[15]。 本研究通過非靶向LC-MS代謝組學(xué)方法，在正離子模式下從紅樹莓和黃樹莓果實(shí)中得到708 個(gè)差異代謝物質(zhì)（其中98 個(gè)為已知化合物）（圖4a），在負(fù)離子模式下得到780 個(gè)差異代謝物質(zhì) （其中45 個(gè)為已知化合物）（圖4b），為不同樹莓類型或品種中各代謝物質(zhì)詳細(xì)組分的研究奠定了基礎(chǔ)。 通過PCA 和熱點(diǎn)聚類分析，均發(fā)現(xiàn)黃樹莓和紅樹莓的生物學(xué)重復(fù)性較好，同一組內(nèi)的不同生物學(xué)重復(fù)樣品最先聚在一起。通過有監(jiān)督的PLS-DA 和OPLS-DA 模型，能有效地對黃樹莓和紅樹莓成熟果實(shí)的代謝物進(jìn)行差異分析。

差異代謝物所在通路的分析可以為植物代謝物積累過程中復(fù)雜的生物活動(dòng)提供有效參考[16]?；诖x物通路分析，本研究發(fā)現(xiàn)34 個(gè)主要差異代謝物質(zhì)分布在代謝途徑上（Metabolic pathways，ko01100），說明黃樹莓和紅樹莓成熟果實(shí)中的代謝物的活躍性較高且存在較大差異。 吳繼軍等[10]通過對黃樹莓和紅樹莓的揮發(fā)性成分的分析檢測，發(fā)現(xiàn)黃樹莓的色譜峰和揮發(fā)性成分比紅樹莓更復(fù)雜，主要香氣成分也存在顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)黃樹莓中花色苷類次生代謝產(chǎn)物和原葉綠酸的含量較紅樹莓高（表1）。

果實(shí)顏色的差異是由于果實(shí)發(fā)育過程中各種色素（葉綠素、花青素、類黃酮、類胡蘿卜素等）占比不同所致，果實(shí)中的花青素占比高，會(huì)影響果實(shí)中紅色、紫色和藍(lán)色的呈現(xiàn)。而果實(shí)中類黃酮和類胡蘿卜素占比多，一般會(huì)影響果實(shí)中黃色、橙紅色和紅色的呈現(xiàn)。 有研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素的含量積累越多，顏色越深[17-18]。 不同果實(shí)含有的色素種類和占比各不相同，這些天然色素對身體有益[13]。 黃樹莓和紅樹莓的成熟果實(shí)在顏色上存在顯著差異，葉綠素、類胡蘿卜素、黃酮和花色苷的生物合成途徑上的基因表達(dá)和代謝物積累對造成顏色差異有一定影響。 樹莓類小漿果中含有豐富的營養(yǎng)和保健成分，尤其是次生代謝物中的酚類化合物[19]，花色苷和黃酮是其果實(shí)中主要的酚類化合物。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃樹莓果實(shí)中的飛燕草素葡萄糖苷（Delphinidin 3-glucoside）、脫落酸（（S）-Abscisic acid）、氫化肉桂酸（Hydrocinnamic acid）和橙皮素（Hesperetin）較紅樹莓果實(shí)中分別下調(diào)了-1.496，-1.632，-1.527，-0.477 倍。 而卟啉與葉綠素代謝中的原葉綠酸（Protochlorophyllide）和大部分花色苷類代謝物在黃樹莓果實(shí)中比紅樹莓上調(diào)了10 倍以上。