劉沛通，丁子元，于慶泉，范佳碩，喬 巖，王海綺，鄭曉衛(wèi)*

（1 中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司 北京 102209 2 中糧長(zhǎng)城桑干酒莊（懷來）有限公司 河北張家口 075499）

酵母菌是葡萄酒發(fā)酵中的核心微生物，代謝葡萄中的糖生成酒精，同時(shí)產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，影響葡萄酒的香氣和口感[1]。 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是參與葡萄酒酒精發(fā)酵的核心酵母菌[2]，在發(fā)酵過程中可以代謝合成醇類、酸類、酯類、醛類、萜烯類等多種風(fēng)味物質(zhì)，構(gòu)成了葡萄酒的主要香氣風(fēng)格，為葡萄酒帶來獨(dú)特而又復(fù)雜的風(fēng)味[3]。醇類物質(zhì)主要包括己醇、苯乙醇、異戊醇等高級(jí)醇，含量適中（<400 mg/L）的高級(jí)醇可增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性[4]。乙酸酯類和乙酯類物質(zhì)是葡萄酒中主要的酯類化合物，前者包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯等，后者包括己酸乙酯、辛酸乙酯等，為葡萄酒帶來果香、花香等愉快的風(fēng)味[5]。 揮發(fā)性脂肪酸以己酸、辛酸、癸酸等為主，可保持葡萄酒的平衡感，增加葡萄酒的香氣復(fù)雜度[4]。

近年來，“風(fēng)土” 成為表征葡萄酒產(chǎn)區(qū)特征的關(guān)鍵詞。作為葡萄酒釀造中的關(guān)鍵微生物之一，產(chǎn)區(qū)本土釀酒酵母直接影響葡萄酒的風(fēng)土特征[6-7]。釀酒酵母在全世界不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)具有顯著的地理分化現(xiàn)象[8-12]，不同產(chǎn)區(qū)的釀酒酵母種群間表現(xiàn)出較高的遺傳差異[13]。 如：B?rlin 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在同一產(chǎn)區(qū)的不同地塊，釀酒酵母種群間也存在顯著的遺傳差異。 Schuller 等[14]甚至在同一地塊的不同取樣點(diǎn)之間發(fā)現(xiàn)了釀酒酵母的遺傳差異性。 產(chǎn)區(qū)本土釀酒酵母會(huì)顯著影響葡萄酒的香氣風(fēng)格和口感特性，不同遺傳性狀的本土酵母可以突出葡萄酒的產(chǎn)區(qū)風(fēng)格，形成葡萄酒的風(fēng)土特征[15]。

當(dāng)前，我國葡萄酒工廠普遍使用進(jìn)口商業(yè)活性干酵母進(jìn)行釀造生產(chǎn)。 商業(yè)活性干酵母可以加強(qiáng)發(fā)酵過程控制，降低腐敗風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)對(duì)葡萄酒香氣不可預(yù)測(cè)的變化。 然而，研究表明，長(zhǎng)期連續(xù)使用商業(yè)酵母，顯著降低了葡萄酒的香氣復(fù)雜性和本土菌株的多樣性，極大削弱了葡萄酒的風(fēng)土特征[16-17]。 本土酵母具有獨(dú)特的區(qū)域特性[18]。 我國本土酵母資源豐富、種類繁多，是我國種業(yè)資源的重要部分，篩選和應(yīng)用本土酵母有利于不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒風(fēng)格的表達(dá)，發(fā)揮我國葡萄酒產(chǎn)區(qū)的風(fēng)土特征。本研究通過小試發(fā)酵、中試釀造評(píng)價(jià)本土酵母的發(fā)酵特性和產(chǎn)香特性，旨在獲得性能優(yōu)良的本土酵母，為提升本土葡萄酒的香氣豐富度和復(fù)雜度，提高葡萄酒品質(zhì)提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料：“雷司令”葡萄（2020年采收于河北沙城，還原糖221.1 g/L），“西拉”葡萄果實(shí)（2020年采收于河北沙城，還原糖238.0 g/L）。

試驗(yàn)菌株：11 株本土釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）篩選自3 個(gè)不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)的自然發(fā)酵過程中，保藏于中糧營養(yǎng)健康研究院酒業(yè)技術(shù)中心（表1）。

表1 本土釀酒酵母分離來源Table 1 Sources of Saccharomyces cerevisiae strains tested

商業(yè)釀酒酵母（S.cerevisiae）VL2、商業(yè)釀酒酵母（S.cerevisiae）RX60，法國Laffort 公司；商業(yè)釀酒酵母（S.cerevisiae）EC1118，法國Lallemand公司。

YPD 培養(yǎng)基（1 L）：酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，pH 6.0，115 ℃高壓滅菌20 min。

葡萄汁模擬培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖100 g，果糖100 g，檸檬酸0.3 g，L-蘋果酸0.3 g，酒石酸3 g，一水合硫酸錳4 mg，COCl2·6H2O 0.4 mg，一水合硫酸鋅4 mg，（NH4）6MO7O24·4H2O 1 mg，五水合硫酸銅1 mg，硫酸銨0.3 g，天冬酰胺0.6 g，磷酸二氫鉀2 g，碘化鉀1 mg，硼酸1 mg，肌醇0.3 g，對(duì)氨基苯甲酸1 mg，生物素0.04 mg，維生素B11 mg，維生素B61 mg，泛酸1 mg，煙酸1 mg，pH 值調(diào)至5.8，過濾除菌。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260 系列高效液相色譜儀、可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器 （G7114A）、 示差折光檢測(cè)器（G7162A）、8890-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；T6 新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司； 離子交換色譜柱HPX-87H（300 mm×7.8 mm），美國Bio-Rad Laboratories 公司；HP-INNOWAX （60 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管柱，美國J&W Scientific 公司；二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭，美國Supelco 公司；PAL-RSI85-SPME 自動(dòng)進(jìn)樣器，瑞士CTC Analytics 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化 取保藏菌株在YPD 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)獲得單菌落，挑取單菌落接種于5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。以1%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。

1.3.2 小試發(fā)酵試驗(yàn) 低溫（4 ℃）離心（8 000 r/min，10 min） 收集菌體，經(jīng)無菌水洗滌后以106CFU/mL 接種于300 mL 葡萄汁模擬培養(yǎng)基中，使用發(fā)酵栓液封，靜置培養(yǎng)10 d 左右（25 ℃），至最終還原糖含量小于4 g/L 即為發(fā)酵終點(diǎn)。在發(fā)酵過程中，測(cè)定菌體密度（OD600nm）及發(fā)酵液還原糖含量以監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)程[19]。 發(fā)酵結(jié)束后離心取上清葡萄酒，分別檢測(cè)理化指標(biāo)（3 mL 葡萄酒）及揮發(fā)性物質(zhì)含量（15 mL 葡萄酒）。 每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3 中試釀造試驗(yàn) 分別使用“雷司令”葡萄和“西拉” 葡萄在長(zhǎng)城桑干酒莊中試平臺(tái)進(jìn)行100 L中試釀造試驗(yàn)。葡萄果實(shí)經(jīng)過穗選、粒選后，“雷司令”葡萄輕度破碎，入氣囊壓榨機(jī)，取自流汁入發(fā)酵容器，澄清后分離清汁轉(zhuǎn)至100 L 發(fā)酵罐；“西拉”葡萄除梗、破碎后，加入100 L 發(fā)酵罐進(jìn)行5 d冷浸漬（10 ℃），自然回溫至20 ℃左右，帶皮發(fā)酵。

取保藏菌株和商業(yè)酵母在YPD 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)獲得單菌落，挑取單菌落接種于5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃下180 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。以1%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃下180 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，以106CFU/mL 活菌數(shù)接種于5 L 葡萄汁中，靜置培養(yǎng)24 h，溫度回升至22 ℃后，得到活化的本土酵母和商業(yè)酵母種子液。 之后將其加入100 L 發(fā)酵罐中啟動(dòng)發(fā)酵，“雷司令” 發(fā)酵溫度14 ℃左右，“西拉”發(fā)酵溫度26～28 ℃。 發(fā)酵過程中監(jiān)測(cè)溫度和比重，發(fā)酵結(jié)束（還原糖質(zhì)量濃度<4 g/L）后，取20 mL 葡萄酒檢測(cè)理化指標(biāo)（3 mL 葡萄酒）及揮發(fā)性物質(zhì)含量（15 mL 葡萄酒）。 每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 葡萄酒理化指標(biāo)分析 葡萄酒總酸、 揮發(fā)酸測(cè)定參考國標(biāo)方法（GB/T 15038-2006）[19]。

使用0.22 μm 濾膜過濾發(fā)酵結(jié)束后的葡萄酒，使用高效液相色譜1200 測(cè)定葡萄糖、果糖、甘油、乙醇及有機(jī)酸（乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸）含 量[20]。 進(jìn)樣量2 μL，流動(dòng)相為5 mmol/L 的H2SO4溶液，離子交換色譜柱HPX-87H（300 mm×7.8 mm），等度洗脫，流速0.6 mL/min。

乙醇、果糖、葡萄糖、甘油使用示差折光檢測(cè)器測(cè)定，柱溫45 ℃，分析時(shí)間30 min；有機(jī)酸使用可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器測(cè)定，柱溫60 ℃，分析時(shí)間30 min。 每個(gè)樣品設(shè)置2 個(gè)獨(dú)立重復(fù)。

1.3.5 葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)分析 參考Lan 等[21]的方法檢測(cè)葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)。 使用50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭萃取。 15 mL 樣品瓶中加入1 g 氯化鈉和10 μL內(nèi)標(biāo)（4-甲基-2-戊醇），將5 mL 待測(cè)葡萄酒迅速加入樣品瓶后擰緊密封。 180 r/min 平衡30 min（40 ℃），將已活化過的萃取頭（270 ℃老化1 h）插入樣品瓶的頂空部分，攪拌萃取30 min（40 ℃）后，將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)樣口，熱解吸8 min（250 ℃），不分流進(jìn)樣。

用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)。 具體條件為：使用HP-INNOWAX 毛細(xì)管柱，高純氦氣作為載氣，流速1 mL/min。 柱溫箱按照以下升溫程序運(yùn)行：5 min（40 ℃）后以3 ℃/min的速度升溫至200 ℃，保持2 min。 質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式EI，離子能量70 ev，質(zhì)量掃描范圍20～450 u。 每個(gè)樣品設(shè)置2 個(gè)獨(dú)立重復(fù)。

對(duì)于已有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，依據(jù)已建立的相同色譜條件下該化合物的保留時(shí)間、 保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進(jìn)行定性分析。 使用化合物在模擬酒溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2013 作圖。 使用SPSS 25.0 進(jìn)行單因素方法分析（ANOVA），采用Duncan檢驗(yàn)兩兩比較 （P ＜0.05）。 使 用https：//www.metaboanalyst.ca/進(jìn)行PLSDA 分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 本土酵母的小試發(fā)酵試驗(yàn)

分析11 株本土酵母的小試發(fā)酵表現(xiàn)，檢測(cè)其發(fā)酵葡萄酒的理化指標(biāo)及揮發(fā)性物質(zhì)，篩選發(fā)酵性能和產(chǎn)香性能良好的本土酵母。

2.1.1 酵母的生長(zhǎng)及發(fā)酵特性 11 株本土酵母發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄酒中殘?zhí)呛烤∮? g/L，符合干型葡萄酒的標(biāo)準(zhǔn)[19]（表2）。 8 株本土酵母的最大生物量顯著高于商業(yè)酵母。60250、60276 和60282的最大生物量顯著低于商業(yè)酵母，且達(dá)到最大生物量的時(shí)間早于商業(yè)酵母。 11 株本土酵母中，60177、60258 的最大生長(zhǎng)速率最高，其中60258的最大發(fā)酵速率也最高，具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)發(fā)酵活力。

表2 酒精發(fā)酵中不同酵母菌株生長(zhǎng)及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Growth and fermentation kinetic parameters of different yeasts during alcoholic fermentation

2.1.2 葡萄酒的理化指標(biāo) 箱式圖展示了不同酵母菌株發(fā)酵葡萄酒中乙醇、甘油和主要有機(jī)酸（乙酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸）的含量分布（圖1）。11 株本土酵母和1 株商業(yè)酵母的乙醇產(chǎn)量相似，從9.18～9.52 g/L 不等。 所有酵母的甘油產(chǎn)量均處于正常范圍（5～14 g/L）[4]。 乙酸是葡萄酒中主要的揮發(fā)酸，各酵母的乙酸產(chǎn)量在0.2～0.7 g/L，對(duì)葡萄酒香氣有積極貢獻(xiàn)[23]。 檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸是葡萄酒中重要的非揮發(fā)性酸。 檸檬酸在葡萄酒中的含量一般為0.1～0.7 g/L[4]，12 種葡萄酒的檸檬酸含量處于正常范圍。 蘋果酸的含量通常為2～6.5 g/L[24]，60124的蘋果酸含量過高（7.75 g/L），其 余10 株本土酵母的蘋果酸產(chǎn)量均在正常范圍內(nèi)。 琥珀酸在葡萄酒中的含量通常為0.5～1.5 g/L[25]，所有葡萄酒的琥珀酸含量均正常。

圖1 不同酵母菌株發(fā)酵葡萄酒的乙醇、甘油和主要有機(jī)酸含量箱式圖Fig.1 Boxplots of the concentration of ethanol，glycerol and main organic acids in wines fermented with different yeast strains

2.1.3 揮發(fā)性物質(zhì)含量 測(cè)定酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)，共檢測(cè)到20 種香氣物質(zhì)，包括6 種高級(jí)醇，9 種酯類，3 種揮發(fā)性脂肪酸和1 種萜烯類物質(zhì)。 基于揮發(fā)性物質(zhì)的聚類分析，根據(jù)酵母的香氣風(fēng)格可以分為2 個(gè)大類（圖2）。

Cluster1 類物質(zhì)主要由乙酯類物質(zhì) （乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯）、乙酸酯類物質(zhì)（乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯）、其它酯類物質(zhì)（癸酸異戊酯、辛酸異戊酯）、高級(jí)醇（異丁醇、異戊醇）和萜烯類物質(zhì)（香茅醇）組成。 60258 和60268 的Cluster1 類物質(zhì)含量顯著高于其余本土酵母和商業(yè)酵母。

Cluster2 類物質(zhì)主要包括高級(jí)醇（丁醇、辛醇、癸醇）和揮發(fā)性脂肪酸（己酸、辛酸、癸酸、異戊酸）。 與商業(yè)酵母和其它本土酵母相比，60124 和60250 的Cluster2 類物質(zhì)含量較高。

根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的香氣特征，將主要的呈香物質(zhì)整理為6 個(gè)香氣類型，即果香、花香、脂肪味、化學(xué)味、生青味和焦糖味[26]。 將氣味相似的呈香物質(zhì)香氣值累加到一起后，得到不同酵母發(fā)酵葡萄酒的特征香氣雷達(dá)圖（圖3）。

圖3 基于香氣活性值的葡萄酒香氣雷達(dá)圖Fig.3 Aromatic series of wines based on OAVs

本土酵母60258、60250、60268、60282、60244等10 株本土酵母的花香果香得分高于商業(yè)酵母，而60250 的脂肪味得分較高，會(huì)給葡萄酒帶來不愉悅的風(fēng)味。 綜合評(píng)價(jià)，60268、60258 的花香果香得分高，且不良風(fēng)味較少；揮發(fā)性物質(zhì)分析也表明其高產(chǎn)酯類物質(zhì)（圖2），具有發(fā)酵優(yōu)良葡萄酒的潛力，可進(jìn)行下一步的中試釀造試驗(yàn)。

圖2 葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)熱圖Fig.2 The heatmap of volatile compounds in wines

2.2 優(yōu)選本土酵母的中試釀造試驗(yàn)

研究60258 和60268 在白葡萄品種“雷司令”和紅葡萄品種“西拉”中的發(fā)酵和產(chǎn)香特性。

2.2.1 酵母的生長(zhǎng)及發(fā)酵特性 分別監(jiān)測(cè) “雷司令”和“西拉”發(fā)酵中的比重，可以看出，本土酵母60258、60268 均可正常完成發(fā)酵（圖4）。 在“雷司令”發(fā)酵中，60258、60268 與商業(yè)酵母的發(fā)酵趨勢(shì)基本一致；在“西拉”發(fā)酵中，發(fā)酵初期60268 的發(fā)酵速率顯著高于60258 和商業(yè)酵母，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，3 株酵母的發(fā)酵速率趨于一致。

圖4 “雷司令”（a）和“西拉”（b）發(fā)酵過程中的比重變化Fig.4 Specific gravity of Riesling （a） and Syrah （b） during fermentation

2.2.2 葡萄酒的理化指標(biāo) 發(fā)酵結(jié)束后，本土釀酒酵母發(fā)酵的葡萄酒中還原糖含量均低于4 g/L，完成發(fā)酵（表3）。 總酸、揮發(fā)酸等理化指標(biāo)處于正常范圍內(nèi)[19]。 在“雷司令”葡萄酒中，60258 的酒精產(chǎn)量顯著低于其余酵母，然而在“西拉”葡萄酒中并未存在該現(xiàn)象。與商業(yè)酵母相比，本土釀酒酵母60268 發(fā)酵的“雷司令”和“西拉”葡萄酒的甘油產(chǎn)量較高，存在顯著性差異。 60258 和60268 的蘋果酸產(chǎn)量顯著高于商業(yè)酵母，60268 的檸檬酸產(chǎn)量顯著高于60258 和商業(yè)酵母，在2 個(gè)品種的葡萄酒中的表現(xiàn)一致。

表3 葡萄酒理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical parameters of wine

2.2.3 葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)分析 發(fā)酵結(jié)束后，從葡萄酒中共檢測(cè)到17 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括4 種高級(jí)醇、10 種酯類和3 種酸類物質(zhì)（表4）。

己醇和苯乙醇在“西拉”和“雷司令”葡萄酒中的含量超出了閾值（表4）。 在“雷司令”葡萄酒中，60258 的己醇產(chǎn)量顯著高于其它2 株酵母，苯乙醇產(chǎn)量也顯著高于60268。 在“西拉”葡萄酒中，60258 的己醇和苯乙醇產(chǎn)量分別是商業(yè)酵母的2.2 倍和1.6 倍。 60258 和60268 在“西拉”葡萄酒中高產(chǎn)異戊醇，且含量超出閾值，顯著高于商業(yè)酵母。 其中60258 的異戊醇含量是商業(yè)酵母的1.97倍。

“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯含量均高出閾值 （表4）。60258 在“雷司令”葡萄酒中的乙酸己酯含量超出閾值，是商業(yè)酵母的3.92 倍。 60258 高產(chǎn)乙酸酯，其在“雷司令”、“西拉”葡萄酒中的乙酸酯產(chǎn)量均顯著高于商業(yè)酵母。

“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的己酸乙酯和辛酸乙酯均高于閾值（表4）。60258 在雷司令中辛酸乙酯的產(chǎn)量是商業(yè)酵母的1.8 倍，在“西拉”葡萄酒中是商業(yè)酵母的1.7 倍。

己酸、辛酸和癸酸是在“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的濃度均高于閾值（表4）。 在“雷司令”葡萄酒中，商業(yè)酵母的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量最高，在“西拉” 葡萄酒中，60258 產(chǎn)生更多的揮發(fā)性脂肪酸。

表4 酒精發(fā)酵結(jié)束后“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 4 The mass concentrations of volatile compounds in Riesling and Syrah wines after alcoholic fermentation

為了進(jìn)一步分析不同酵母對(duì)葡萄酒風(fēng)格的影響，分別基于“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行偏最小二乘分析（圖5、圖6）。 由圖可知，不同酵母發(fā)酵葡萄酒的風(fēng)格有顯著區(qū)分。 在“雷司令”葡萄酒中，揮發(fā)性脂肪酸（辛酸、癸酸）和酯類物質(zhì)（乙酸酯）是不同酵母間差異的主要揮發(fā)性物質(zhì)。 在“西拉”葡萄酒中，高級(jí)醇（辛醇、己醇、異戊醇）和酯類物質(zhì)（辛酸乙酯）是造成酵母間差異的主要物質(zhì)。 整體而言，在“雷司令”葡萄酒中，本土酵母60258、60268 可產(chǎn)生較高濃度的總酯、乙酸酯等；在“西拉”葡萄酒中，本土酵母60258、60268 可產(chǎn)生較高濃度的酯類物質(zhì)（辛酸乙酯、乙酸異戊酯等）。

圖5 基于“雷司令”葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的偏最小二乘判別分析Fig.5 Partial least squares - discriminant analysis （PLS-DA） based on the volatile compounds in the Riesling wine

圖6 基于“西拉”葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的偏最小二乘判別分析Fig.6 Partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA） based on the volatile compounds in the Syrah wine

根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的香氣特征，將主要的呈香物質(zhì)整理為6 個(gè)香氣類型，將氣味相似的呈香物質(zhì)香氣值累加到一起后，得到不同酵母發(fā)酵葡萄酒的特征香氣雷達(dá)圖（圖7）。 在“雷司令”葡萄酒中（圖7a），本土酵母60258 果香和花香較強(qiáng)，脂肪味較弱。 而本土酵母60268 的果香和花香均弱于商業(yè)酵母。 在“西拉”葡萄酒中（圖7b），本土酵母60258、60268 果香和花香較強(qiáng)，優(yōu)于商業(yè)酵母。

圖7 基于香氣活性值的“雷司令”（a）和“西拉”（b）葡萄酒香氣雷達(dá)圖Fig.7 Aromatic series of Riesling （a） and Syrah （b） wine based on OAVs

3 討論

葡萄酒產(chǎn)區(qū)不同的微氣候塑造了不同特點(diǎn)的本土酵母，表現(xiàn)出各異的區(qū)域特征，從而影響葡萄酒最終的香氣特性和口感特性。本研究中，采用小試發(fā)酵試驗(yàn)評(píng)估了11 株本土酵母的發(fā)酵特性和產(chǎn)香特性。 11 株本土酵母中均可完成干型葡萄酒的發(fā)酵（殘?zhí)呛?4 g/L）[19]，其中60258 生長(zhǎng)活力和發(fā)酵活力較強(qiáng)（表2）。 11 株本土酵母的乙醇產(chǎn)量與商業(yè)酵母相似，甘油、有機(jī)酸（乙酸、檸檬酸和琥珀酸）產(chǎn)量均處于葡萄酒的正常范圍內(nèi)（圖1）。通過揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析將11 株本土酵母分為兩大類，其中60258 和60268 高產(chǎn)酯類物質(zhì)，60124 和60250 高產(chǎn)高級(jí)醇和揮發(fā)性脂肪酸 （圖2）。結(jié)合基于葡萄酒香氣雷達(dá)圖，最終篩選出2 株果香、花香得分最高，且脂肪味和化學(xué)味得分較低的本土酵母（60258 和60268）進(jìn)行中試釀造試驗(yàn)。60258 和60268 在“雷司令”和“西拉”中的發(fā)酵趨勢(shì)一致（圖4），均可完成干型葡萄酒的發(fā)酵。 甘油主要在酒精發(fā)酵初期產(chǎn)生，是酵母正常發(fā)酵副產(chǎn)物之一，具有甜味和黏稠度，可提高葡萄酒圓潤飽滿的口感[33]。 葡萄酒中的甘油通常為4～15 g/L[4]。60268 在“雷司令”和“西拉”中的甘油產(chǎn)量分別是商業(yè)酵母的1.2 倍和1.1 倍，在一定程度上可以改善葡萄酒的口感（表3）。 檸檬酸和蘋果酸是葡萄酒中重要的非揮發(fā)性酸。 檸檬酸由酵母在發(fā)酵初期產(chǎn)生，在葡萄酒中的含量為0.1～0.7 g/L[4]。2 株本土酵母的檸檬酸產(chǎn)量均在正常范圍，顯著低于商業(yè)酵母。蘋果酸具有生青味和尖苛感，可通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵被乳酸菌降解為更為柔和的乳酸[24]。 酒精發(fā)酵結(jié)束后，60258 和60268 的蘋果酸含量顯著高于商業(yè)酵母（表3），可為蘋果酸-乳酸發(fā)酵提供更多的底物。

高級(jí)醇主要由釀酒酵母通過Ehrlich 途徑代謝氨基酸生成[34]，是葡萄酒中重要的發(fā)酵香氣物質(zhì)。 當(dāng)高級(jí)醇濃度適宜時(shí)可增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，然而當(dāng)質(zhì)量濃度高于400 mg/L 時(shí)，會(huì)給葡萄酒帶來不愉快的醇味和溶劑味[4]。中試釀造結(jié)果表明，60258 高產(chǎn)己醇和苯乙醇（表4）。 己醇為葡萄酒貢獻(xiàn)植物味，苯乙醇可給葡萄酒帶來玫瑰花香和蜂蜜味[35]。 這也導(dǎo)致了西拉葡萄酒中60258的高級(jí)醇總量顯著高于商業(yè)酵母，而并未超過400 mg/L，不會(huì)給葡萄酒帶來不良風(fēng)味[4]。60268 在雷司令葡萄酒中的高級(jí)醇產(chǎn)量較低，然而在西拉葡萄酒中其產(chǎn)量顯著高于商業(yè)酵母，可以增加葡萄酒的香氣復(fù)雜性（表4）。

酯類物質(zhì)主要包括乙酸酯和乙酯[5]。乙酸酯由高級(jí)醇和乙酰輔酶A 在醇?；D(zhuǎn)移酶的催化下縮合而成，主要包括乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯、2-乙酸苯乙酯等[4]，可為葡萄酒帶來果香、花香[35-37]。 60258 在“雷司令”中的乙酸己酯含量是商業(yè)酵母的3.92 倍，該物質(zhì)可為葡萄酒貢獻(xiàn)蘋果、櫻桃等果香[35]。60258 在“雷司令”和“西拉”中的乙酸酯總量分別是商業(yè)酵母的3 倍、1.6 倍。 60268的乙酸酯總量與商業(yè)酵母無顯著性差異。 乙酯由脂酰CoA 和乙醇在酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下縮合而成，常見乙酯包括丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和十二酸乙酯[4-5]。 60258 在“雷司令”和“西拉”中均高產(chǎn)辛酸乙酯，提升葡萄酒的花香、果香[36]，這也導(dǎo)致其乙酯產(chǎn)量顯著高于其余2 株酵母，是商業(yè)酵母乙酯總量的近2 倍。 與60258 不同，60268 的乙酯產(chǎn)量較低（表4）。 60258 高產(chǎn)酯類物質(zhì)，也使其與60268 和商業(yè)酵母的風(fēng)格顯著區(qū)分開（圖5、圖6）。 結(jié)合葡萄酒香氣雷達(dá)圖（圖7） 可看出，60258 的果香和花香得分高于商業(yè)酵母和60268，與小試結(jié)果一致（圖3）。 60258 可較穩(wěn)定地高產(chǎn)酯類物質(zhì)。

揮發(fā)性脂肪酸為葡萄酒帶來奶酪味、 脂肪味等香氣特征[4]。 在2 種葡萄酒中，60258 產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸總量均顯著高于商業(yè)酵母，而60268僅在“西拉”葡萄酒中高產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸（表4），可在一定程度上提升葡萄酒的香氣復(fù)雜性和平衡性。

整體來看，60258 可穩(wěn)定產(chǎn)生豐富的酯類、高級(jí)醇類及其它揮發(fā)性物質(zhì)，賦予葡萄酒愉悅的果香和花香。 60268 高產(chǎn)甘油，在紅葡萄酒品種“西拉”中的香氣表現(xiàn)優(yōu)于白葡萄品種“雷司令”（圖7）。

4 結(jié)論

開發(fā)中國本土酵母資源，篩選應(yīng)用優(yōu)良本土酵母，對(duì)充分發(fā)揮葡萄酒的風(fēng)土特征，改變國外商業(yè)酵母壟斷的局面具有重要意義。 本研究通過小試發(fā)酵從11 株本土酵母中篩選出2 株發(fā)酵和產(chǎn)香性能良好的本土酵母60258 和60268，應(yīng)用2個(gè)品種的葡萄（白葡萄品種“雷司令”和紅葡萄品種“西拉”）進(jìn)行中試釀造。 結(jié)果表明：60258 可以穩(wěn)定地高產(chǎn)酯類物質(zhì)，提升葡萄酒的花香和果香風(fēng)味特征；60268 可以高產(chǎn)甘油，更適合提升紅葡萄酒的香氣品質(zhì)。 2 株酵母在實(shí)際生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用前景。