王奇升，但阿康，羅海濤，田永奇*，汪少蕓，鄧尚貴

（1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州 350108 2 浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江舟山 316000）

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）通過正常的代謝活動(dòng)產(chǎn)生。 當(dāng)ROS 過量時(shí)，機(jī)體氧化-還原平衡被打破，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且ROS過量會(huì)導(dǎo)致衰老，以及增加各種人類疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，維持機(jī)體ROS 水平處于動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要[1]。在國內(nèi)發(fā)生的食品安全問題中，最為嚴(yán)重的是由微生物污染造成的食物中毒，現(xiàn)有研究表明，我國約81%的食源性疾病由食用不潔食品導(dǎo)致細(xì)菌感染引起，細(xì)菌性食源性疾病年發(fā)病量超過9 400萬例次[2]。清除和控制食品接觸表面的食源性致病菌顯得尤為重要。

石花菜 （Gelidium amansii） 屬于石花菜科（Gelidiaceae）石花菜屬（Gelidium），分布在我國福建、浙江、山東和臺(tái)灣等沿海地區(qū)[3]。石花菜生長(zhǎng)于低潮帶下2～4 m 處的珊瑚礁上，是溫帶重要的經(jīng)濟(jì)性海藻[4]。 石花菜中含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖和脂肪酸等，在食品、生物技術(shù)和美容等領(lǐng)域都得到廣泛應(yīng)用[5]。石花菜可藥食兩用，具有清熱解毒、抗腫瘤和防便秘等功效，閩南地區(qū)將其制成石花膏食用，山東地區(qū)則制成美味的涼粉[6-7]。石花菜作為全球的經(jīng)濟(jì)紅藻之一，其研究主要集中在多糖等大分子，醇溶性小分子等成分常被當(dāng)作副產(chǎn)物而丟棄。 其實(shí)，石花菜醇提物有很高的利用價(jià)值，其蘊(yùn)含的化合物很可能作為功能食品或藥品的先導(dǎo)物。Seo 等[8]及Lee 等[9]研究發(fā)現(xiàn)石花菜醇提物能有效抑制活性氧的生成。 王慧等[10]研究發(fā)現(xiàn)石花菜多糖對(duì)糖尿病大鼠有降血糖作用。 此外，林雄平等[11]研究發(fā)現(xiàn)石花菜提取物對(duì)黑曲霉有較強(qiáng)的抑制作用。

本研究以石花菜為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法探究石花菜醇提物的提取工藝，比較石花菜醇提物不同萃取相清除DPPH 自由基、ABTS+自由基和羥基自由基的能力，并探究其對(duì)食源性致病菌的抑菌活性，為石花菜高值化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石花菜來自于福建福州、漳州海域；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （DPPH）、2，2-聯(lián)氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），上海源葉生物科技有限公司；酶標(biāo)板（96 孔），上海百千生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC （B） 26003、 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）CICC 21528、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 8739、 弗尼斯弧菌（Vibrio furnissii）ATCC 35016，保藏于福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲清洗儀（KQ5200DE），昆山超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA），上海亞榮生化儀器廠；超純水機(jī)（QYSW-10A），寶爾水處理有限公司；電子天平（HZK-FA2105），梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；pH 計(jì)（FE20），河南愛博特科技發(fā)展有限公司； 紫外可見光分光光度計(jì)（Genesys10s），美 國Thermo Fisher Scientific 公司；粉碎機(jī)（RS-FS1406），合肥榮事達(dá)小家電有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 用清水漂洗石花菜后，置于陰涼處自然風(fēng)干。 稱取1 kg 石花菜，用粉碎機(jī)將其打碎，制成石花菜粉末，過100 目篩，得石花菜粗粉。稱取該粗粉，按比例與不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液混合，在不同溫度下，超聲浸提不同時(shí)間，浸提結(jié)束后，8 500 r/min 離心10 min，取上清液減壓濃縮后，獲得石花菜醇提物。以石花菜醇提物得率及DPPH 自由基清除率（質(zhì)量濃度為2 mg/mL）為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 稱取10 g 石花菜粗粉，以1 ∶25 的料液比加入體積分?jǐn)?shù)分別為40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液，攪拌均勻后在超聲波功率為300 W，45 ℃下，恒溫?cái)嚢杼崛?0 min。

1.3.2.2 料液比的選擇 準(zhǔn)確稱取10 g 石花菜粗粉，分別以1∶20，1∶25，1∶30，1∶5，1∶40 的料液比，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，攪拌均勻后，在超聲波功率為300 W，45 ℃下，恒溫?cái)嚢杼崛?0 min。

1.3.2.3 超聲時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取10 g 石花菜粗粉，以1∶35 的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，45 ℃下，恒溫?cái)嚢璺謩e處理20，40，60，80，100 min。

1.3.2.4 超聲功率的選擇 準(zhǔn)確稱取10 g 石花菜粗粉，以1∶35 的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，45 ℃下，分別選用不同超聲波功率200，250，300，350，400 W 處理60 min。

1.3.2.5 提取溫度的選擇 準(zhǔn)確稱取10 g 石花菜粗粉，以1∶35 的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，分別在25，35，45，55，65 ℃下，選用超聲波功率350 W 處理60 min。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[12]和[13]利用Design-Expert V8.0.6 進(jìn) 行Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，以提取時(shí)間（A）、超聲波功率（B）和提取溫度（C）為自變量，響應(yīng)值分別選擇醇提物得率（Y1）和DPPH 自由基清除率（Y2），采用3 因素3 水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法擬合模型，得出最佳工藝參數(shù)。響應(yīng)面因素和水平取值見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor levels of response surface methodology

1.3.4 石花菜醇提物體外抗氧化活性分析

1.3.4.1 樣品溶液配制 使用DMSO 溶解樣品，配制成2 mg/mL。

1.3.4.2 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]和[15]中的檢測(cè)方法并做適當(dāng)調(diào)整。 將DPPH用乙醇溶解并用磁力攪拌器攪拌30 min，于A517nm處調(diào)節(jié)吸光度為0.5～0.6，采用二倍稀釋法，配制不同濃度的石花菜醇提物溶液。 100 μL 樣品溶液中加入100 μL 的DPPH 混勻后記為A1樣品組。100 μL 樣品溶液中加入100 μL 乙醇記為A2參比組。100 μL 的DPPH 中加入100 μL 乙醇混勻后記為A0空白組。 25 ℃避光條件下靜置孵育30 min，517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。 按公式（1）計(jì)算：

式中，A1——樣品組測(cè)定吸光值；A2——樣品參比組測(cè)定吸光值；A0——空白組測(cè)定吸光值。

1.3.4.3 ABTS+自由基清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]中的測(cè)定方法做適當(dāng)修改。 配制ABTS+自由基工作溶液。采用二倍稀釋法，配制不同濃度的石花菜醇提物溶液。 100 μL 樣品溶液中加入100 μL ABTS+自由基工作溶液，快速振蕩混勻，25 ℃避光孵育10 min，在734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)p。 同時(shí)用甲醇試劑代替ABTS+自由基工作液，其所測(cè)吸光值記為Ac；用甲醇試劑代替樣品溶液，作為空白組對(duì)照組，其所測(cè)吸光值記為Amax。 用甲醇試劑調(diào)零。 所得結(jié)果按公式（2）計(jì)算：

式中，Ap——樣品工作液組吸光度；Ac——樣品工作液參比組吸光度；Amax——空白對(duì)照組吸光度。

1.3.4.4 羥自由基（·OH）清除能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[17]中的檢測(cè)方法并做適當(dāng)調(diào)整。0.5 mL 樣品與150 μL FeSO4（8 mmol/L），0.5 mL 水楊酸（3 mmol/L）和125 μL H2O2（20 mmol/L）混合，并在37 ℃下孵育30 min。 用水冷卻后，添加225 μL 蒸餾水以使總體積達(dá)到1.5 mL，然后以3 000 r/min 離心10 min。在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量上清液的吸光度，并且使用甲醇代替樣品作為空白對(duì)照A0。 所得結(jié)果按公式（3）計(jì)算：

式中，A0——空白組吸光度；Ai——樣品組吸光度。

1.3.5 石花菜醇提物不同溶劑萃取相抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 石花菜醇提物不同溶劑萃取相的制備將制備的石花菜醇提物分別加入石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇中萃取，4 000 r/min 條件下，離心10 min，取上清液，蒸發(fā)濃縮至近干，DMSO 溶解配制成40 mg/mL 萃取相溶液，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 參見1.3.4.2 節(jié)的方法。

1.3.5.3 ABTS+自由基清除率的測(cè)定 參見1.3.4.3節(jié)的方法。

1.3.5.4 羥自由基（·OH）清除率的測(cè)定 參見1.3.4.4 節(jié)的方法。

1.3.6 石花菜醇提物不同溶劑萃取相的抑菌活性評(píng)價(jià)

1.3.6.1 抑菌圈測(cè)定 參考文獻(xiàn)[18]中的檢測(cè)方法并做適當(dāng)調(diào)整。 將石花菜醇提物不同溶劑萃取相溶于DMSO，配制樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL。分為石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和剩余的水相。 試驗(yàn)中細(xì)菌培養(yǎng)用LB 培養(yǎng)基，將已滅菌好的固體培養(yǎng)基趁熱傾注入培養(yǎng)皿內(nèi)，在無菌條件下吸取菌液0.1 mL 滴在培養(yǎng)皿內(nèi)搖勻。待平板凝固后用無菌打孔器（直徑6 mm）在平板上打孔，用無菌鑷子小心挑去培養(yǎng)基以做成圓孔，向孔中注入10 μL 樣品，細(xì)菌放置37 ℃培養(yǎng)24 h。測(cè)量抑菌圈直徑，每組樣品重復(fù)3 次，得出抑菌圈直徑平均值。

1.3.6.2 MIC 和MBC 參照文獻(xiàn)[19]中的檢測(cè)方法并做適當(dāng)調(diào)整，采用二倍稀釋法測(cè)定石花菜醇提物石油醚相和乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌的MIC，設(shè)立只加菌液的陽性對(duì)照組，只加石花菜醇提物不同溶劑萃取相的陰性對(duì)照組，只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照組，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，用肉眼觀測(cè)，所有透明且澄清的96 孔板中，含最小的石花菜醇提物不同萃取相濃度的96 孔板所設(shè)定的濃度值，即為MIC。采用斜面滴液法測(cè)定MBC，從MIC 試驗(yàn)中所有澄清的試管中吸取0.05 mL 點(diǎn)滴到瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察，無菌落生長(zhǎng)的培養(yǎng)基區(qū)域所對(duì)應(yīng)的萃取相濃度為MBC。

1.3.6.3 抑菌成分對(duì)菌生長(zhǎng)曲線的影響 參照文獻(xiàn)[20]和[21]中的檢測(cè)方法并做適當(dāng)調(diào)整，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食源性致病菌，用LB 肉湯稀釋至吸光度為0.06～0.08 之間（LB 肉湯調(diào)零）。 吸取1 mL菌液到30 mL 的LB 肉湯中，加入樣品并使其終濃度為MIC。 并將LB 肉湯設(shè)置為空白組。 置于恒溫?fù)u床中37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)。 每隔2 h，測(cè)定各組吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。 Design-Expert V8.0.6 Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面表格的制作，GraphPad Prism 8 繪制各影響因素間的互作圖，最后利用SPSS 19.0 進(jìn)行概率單位分析得出IC50，并且對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醇提物得率及DPPH 自由基清除率的影響 由圖1a 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，石花菜醇提物得率達(dá)到最大值0.0149 g/g，DPPH 自由基清除率達(dá)到最大值57.52%。 因此，石花菜醇提物提取的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.1.2 料液比對(duì)醇提物得率及DPPH 自由基清除率的影響 由圖1b 可知，當(dāng)料液比為1∶35 時(shí)，石花菜醇提物得率達(dá)到最大值0.0145 g/g，DPPH 自由基清除率也達(dá)到最大值56.48%。 因此，石花菜醇提物提取的最適料液比為1∶35。

2.1.3 超聲波處理時(shí)間對(duì)醇提物得率及DPPH 自由基清除率的影響 由圖1c 可知，當(dāng)超聲波處理時(shí)間為60 min 時(shí)，石花菜醇提物得率達(dá)到最大值0.0149 g/g，DPPH 自由基清除率也達(dá)到最大值56.37%。因此，石花菜醇提物提取的最適超聲波處理時(shí)間為60 min。

圖1 不同因素對(duì)石花菜醇提物得率和DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 Effects of different factors on the yield and DPPH radical scavenging rate of G.amansii ethanol extract

2.1.4 超聲波處理功率對(duì)醇提物得率及DPPH 自由基清除率的影響 由圖1d 可知，當(dāng)超聲波處理功率為350 W 時(shí)，石花菜醇提物得率達(dá)到最大值0.0163 g/g，DPPH 自由基清除率也達(dá)到最大值61.43%。因此，石花菜醇提物提取的最適超聲波處理功率為350 W。

2.1.5 浸提溫度對(duì)醇提物得率及DPPH 自由基清除率的影響 由圖1e 可知，當(dāng)浸提溫度為55 ℃時(shí)，石花菜醇提物得率達(dá)到最大值0.0157 g/g，DPPH 自由基清除率也達(dá)到最大值58.77%。因此，石花菜醇提物提取的最適浸提溫度為55 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析 利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2 的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到石花菜醇提物得率（Y1）和DPPH 自由基清除率（Y2）對(duì)提取時(shí)間（A）、超聲功率（B）和提取溫度（C）的二次多元回歸模型。

表2 響應(yīng)面分析優(yōu)化Table 2 Optimization of response surface analysis

Y1=1.67+0.0961A+0.2108B+0.0271C-0 .0525AB -0.0083AC -0.0475BC -0.3620A2-0.4652B2-0.2995C2，R2=0.9969。

Y2=58.37+1.10A+2.43B+0.3731C+1.05AB+0.0668AC-0.0397BC-2.01A2-7.04B2-3.32C2，R2= 0.9922。

回歸模型Y1的R2和Y2的R2接近于1，說明該模型可以較好地?cái)M合。

由表3 可知，回歸模型的P<0.0001，得知模型所得方程與實(shí)際數(shù)據(jù)非常擬合，可用該模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化石花菜醇提物得率提取工藝。 根據(jù)Y1發(fā)現(xiàn)，該擬合方程F 檢驗(yàn)極顯著（P<0.0001），各種因素之間存在著一定的交互作用。 其中A、B、A2、B2和C2影響極為顯著（P<0.01），AB、BC 影響顯著（P<0.05）。 根據(jù)模型方差分析中可知A、B 和C 的F 值分別為65.90，316.79，5.25，在因素水平內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)石花菜醇提物得率的影響順序?yàn)槌暡üβ剩˙）>提取時(shí)間（A）>提取溫度（C）。 考慮各因素的交互作用，對(duì)石花菜醇提物得率的影響順序?yàn)锳B>BC>AC。

表3 石花菜醇提物得率方差分析表Table 3 Analysis of variance of yield of G.amansii ethanol extract

從表4 可知，回歸模型的P<0.0001，得知模型所得方程與實(shí)際數(shù)據(jù)非常擬合，可用該模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化石花菜醇提物的DPPH 自由基清除率提取工藝。 3 個(gè)因素對(duì)石花菜醇提物的DPPH 自由基清除率的影響機(jī)理復(fù)雜。 根據(jù)Y2發(fā)現(xiàn)，該擬合方程F 檢驗(yàn)極顯著（P<0.0001），各種因素之間存在著一定的交互作用。 其中A、B、A2、B2、C2影響極為顯著（P<0.01），AB 影響顯著（P<0.05）。 根據(jù)模型方差分析中可知A、B、C 的F 值分別為24.19，117.52，2.78，在因素水平內(nèi)，3 個(gè)因素對(duì)石花菜醇提物的DPPH 自由基清除率的影響順序?yàn)槌暡üβ剩˙）>提取時(shí)間（A）>提取溫度（C）。 考慮各因素的交互作用，對(duì)石花菜醇提物的DPPH自由基清除率的影響順序?yàn)锳B>AC>BC。

表4 石花菜醇提物DPPH 自由基清除率方差分析表Table 4 Analysis of variance on DPPH radical scavenging rate of G.amansii ethanol extract

2.2.2 因素間交互作用 3 個(gè)因素中固定其中1個(gè)因素，分析另外2 個(gè)因素，得到相應(yīng)的響應(yīng)曲面。 根據(jù)擬合的二次多項(xiàng)式模型，使用Design-Expert 8.0.6 軟件繪制二維等高線圖和三維效應(yīng)圖，根據(jù)提取時(shí)間、超聲波功率和提取溫度3 個(gè)因素構(gòu)成的響應(yīng)面圖，可以直觀地反映兩因素交互作用對(duì)石花菜醇提物得率和DPPH 自由基清除率的影響。

2.2.2.1 提取時(shí)間（A）、超聲波功率（B）和提取溫度（C）對(duì)石花菜醇提物得率（Y1）的影響 根據(jù)圖2 可以直觀地看出各因素交互作用對(duì)石花菜醇提物得率的影響，若曲面越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)斤@著，此因素的交互作用對(duì)石花菜醇提物得率影響越大；反之曲面坡度越平緩，操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小。 溫度在0 水平時(shí)，超聲功率在350 W 附近時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，石花菜醇提物得率先上升后下降；超聲功率在0 水平時(shí)，時(shí)間在60 min 附近時(shí)，隨著溫度的升高，石花菜醇提物得率先上升后下降；提取時(shí)間在0 水平時(shí)，溫度在55 ℃附近時(shí)，隨著超聲功率的增加，石花菜醇提物得率先上升后下降。超聲功率與時(shí)間交互作用對(duì)石花菜醇提物得率影響更為顯著。

圖2 等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.2 Contour plot and response surface plot

2.2.2.2 提取時(shí)間（A）、超聲波功率（B）和提取溫度（C）對(duì)石花菜醇提物DPPH 自由基清除率（Y2）的影響 根據(jù)圖3 可以直觀地反映出各因素交互作用對(duì)石花菜醇提物DPPH 自由基清除率的影響。 溫度在0 水平時(shí)，超聲功率在350 W 附近時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，石花菜醇提物DPPH 自由基清除率先升高后降低；超聲功率在0 水平時(shí)，時(shí)間在60 min 附近時(shí)，隨著溫度的升高，石花菜醇提物DPPH 自由基清除率先升高后降低； 提取時(shí)間在0 水平時(shí)，溫度在55 ℃附近時(shí)，隨著超聲功率的增加，石花菜醇提物DPPH 自由基清除率先升高后降低。 超聲功率與時(shí)間交互作用對(duì)石花菜醇提物DPPH 自由基清除率影響更為顯著。

圖3 等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.3 Contour plot and response surface plot

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 該試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為： 提取時(shí)間63.71 min，超聲功率359.89 W，提取溫度55.42 ℃。 結(jié)合試驗(yàn)條件的可行性，將實(shí)際操作改良為提取時(shí)間64 min，超聲功率350 W，提取溫度55 ℃，在此條件下重復(fù)3 次試驗(yàn)，石花菜醇提物的得率為0.0165 g/g（n=3），石花菜醇提物DPPH 自由基清除率為58.29%（n=3）與理論得率接近，表明響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取條件可用于提高石花菜醇提物得率與DPPH 自由基清除率。

2.3 石花菜醇提物不同溶劑萃取相抗氧化活性分析

2.3.1 石花菜醇提物不同溶劑萃取相對(duì)DPPH 自由基清除作用的比較 由圖4a 可知，質(zhì)量濃度為0～10 mg/mL 時(shí)，石花菜醇提物不同溶劑萃取相清除DPPH 自由基能力隨質(zhì)量濃度增大而增大。 由圖4b 可知，乙酸乙酯萃取相清除DPPH 自由基的IC50最小，為672.4 μg/mL。 正丁醇萃取相、石油醚萃取相和萃取后剩余的水相，IC50分別為1 759.4，3 372.9，3 461.2 μg/mL。 綜上，乙酸乙酯萃取相清除DPPH 自由基能力最好，水相清除DPPH 自由基能力最弱。

圖4 不同溶劑萃取相清除DPPH 自由基能力及IC50Fig.4 DPPH radical scavenging ability and IC50 of different solvent extraction phases

2.3.2 石花菜醇提物不同溶劑萃取相對(duì)ABTS+自由基清除作用的比較 由圖5a 可以看出，質(zhì)量濃度為0～0.35 mg/mL 時(shí)，石花菜醇提物不同溶劑萃取相隨著質(zhì)量濃度增加，萃取相清除ABTS+自由基能力增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到0.2 mg/mL 時(shí)，清除率均大于80%，此后，清除ABTS+自由基能力隨質(zhì)量濃度增加的遞增趨勢(shì)逐漸變緩。 由圖5b 可知，不同溶劑萃取相清除ABTS+自由基的IC50大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴?正丁醇>粗提物>石油醚>水，表明乙酸乙酯萃取相清除ABTS+自由基能力最好，其IC50為14.1 μg/mL。

圖5 不同溶劑萃取相清除ABTS+自由基能力及其IC50Fig.5 ABTS+ radical scavenging ability and IC50 of different solvent extraction phases

2.3.3 石花菜醇提物不同溶劑萃取相對(duì)羥自由基清除能力清除作用的比較 由圖6a 可以看出，質(zhì)量濃度為0～2 mg/mL 時(shí)，石花菜醇提物不同溶劑萃取相隨著質(zhì)量濃度增加，萃取相清除羥自由基（·OH）清除能力增強(qiáng)。 由圖6b 可知，不同溶劑萃取相清除羥自由基（·OH）的IC50大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴?正丁醇>水>粗提物>石油醚，表明乙酸乙酯萃取相清除羥自由基（·OH） 能力最好，IC50為599.7 μg/mL。

圖6 不同溶劑萃取相清除羥自由基（·OH）能力及IC50Fig.6 Hydroxyl radical scavenging ability and IC50 of different solvent extraction phases

2.4 石花菜醇提物不同溶劑萃取相的抑菌作用

由圖7 和表5 可知，石油醚相和乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌具有一定抑制效果，而對(duì)大腸桿菌和弗尼斯弧菌無明顯抑菌活性。其余萃取相對(duì)4 種菌均無明顯抑制活性。 石油醚相對(duì)金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的抑菌圈大小為（6.21±0.39）mm 和（7.41±0.47）mm；乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的抑菌圈大小為（11.43±0.45）mm 和（8.92±0.61）mm。 乙酸乙酯相抑菌圈顯著大于石油醚相抑菌圈，表明石花菜醇提物乙酸乙酯相抑菌活性最強(qiáng)，且乙酸乙酯相中含有抑制金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的活性物質(zhì)。

表5 不同萃取相對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌和弗尼斯弧菌的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of different extracts of G.amansii ethanol extract on S.aureus，V.parahaemolyticus，E.coli，and V.furnissii

圖7 石花菜醇提物不同萃取相對(duì)菌的抑菌圈大小Fig.7 Inhibition zone size of different extracts of G.amansii ethanol extract on bacteria

2.5 MIC 和MBC 結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果可得，石油醚相對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的MIC 為0.6250，0.1563 mg/mL。 乙酸乙酯相為0.1563，0.1563 mg/mL。 由圖8 可知，石油醚相對(duì)金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的MBC 分別為>0.6250 mg/mL 和0.6250 mg/mL。 乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的MBC 分別為0.6250 mg/mL 和0.3125 mg/mL。 表明石花菜醇提物乙酸乙酯相殺菌能力最強(qiáng)。

圖8 石花菜醇提物對(duì)食源性致病菌的最小殺菌濃度Fig.8 MBC of different extracts of G.amansii ethanol extract against bacteria

2.6 石花菜石油醚萃取相和乙酸乙酯萃取相對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

由圖9 可知，金黃色葡萄球菌空白組在0～8 h，快速繁殖，在8～24 h，繁殖速度減緩。 副溶血性弧菌空白組在0～4 h，快速繁殖，在4～24 h，繁殖速度減緩。 濃度為MIC 的石油醚萃取相和乙酸乙酯萃取相能明顯抑制金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的生長(zhǎng)。 試驗(yàn)表明石油醚萃取相和乙酸乙酯萃取相能抑制金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的生長(zhǎng)，2 個(gè)萃取相中均含有抑菌活性物質(zhì)，其中乙酸乙酯相中含有抑菌能力更強(qiáng)的活性物質(zhì)，值得后續(xù)深入研究。

圖9 不同萃取相對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線（a）、副溶血弧菌的生長(zhǎng)曲線（b）的影響Fig.9 Effects of different extraction phases of G.amansii ethanol extract on the growth curve of S.aureus （a），V.parahaemolyticus （b）

3 結(jié)論與討論

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化石花菜醇提物的提取工藝，并研究石花菜醇提物不同萃取相的抗氧化和抑菌活性。結(jié)果顯示，石花菜醇提物的最佳提取工藝為：提取時(shí)間64 min，超聲功率350 W，提取溫度55 ℃，60%乙醇溶液，料液比1∶35，所得石花菜醇提物得率為0.0165 g/g，DPPH 自由基清除率為58.29%（質(zhì)量濃度為2 mg/mL）。 石花菜醇提物不同萃取相的抗氧化能力依次為乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相。石花菜醇提物抑菌能力依次為乙酸乙酯相>石油醚相>正丁醇相。其中，乙酸乙酯相抗氧化能力和抑菌能力均為最高，值得后續(xù)深入研究。

目前，對(duì)于石花菜的研究多集中在多糖等大分子，而小分子化學(xué)成分研究較少。 試驗(yàn)結(jié)果表明，石花菜醇提物與石花菜多糖相比，具有更強(qiáng)的抗氧化活性和抑菌活性[1]。 因此，對(duì)石花菜醇提物抗氧化和抑菌活性進(jìn)行更加系統(tǒng)深入的研究，并以此指導(dǎo)天然抗氧化劑、 防腐劑的開發(fā)應(yīng)用具有重要意義。本試驗(yàn)研究對(duì)象均為粗提物，其活性成分物質(zhì)并未詳細(xì)明確的指出，后續(xù)研究可以通過藥物化學(xué)手段詳細(xì)闡明其具有活性的化學(xué)成分，并且深入到石花菜醇提物體內(nèi)抗氧化活性和抗菌機(jī)制的研究。本研究表明，石花菜醇提物具有作為天然抗氧化劑和防腐劑的應(yīng)用潛力，可為石花菜高值化利用提供理論參考。