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        辣木異硫氰酸酯改善C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗

        2023-02-17 03:29:20毛家英白玉英彭麟杰
        中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2023年1期
        關(guān)鍵詞:肌管氰酸酯辣木

        毛家英,白玉英,彭麟杰,解 靜,田 洋

        (1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明 650201 2 云南省生物大數(shù)據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650201 3 食藥同源資源開(kāi)發(fā)與利用教育部工程中心 昆明 650201)

        2 型糖尿?。═ype 2 diabetes,T2DM)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的非傳染性慢性疾病,是臨床上最為常見(jiàn)的糖尿病類型,占所有糖尿病患者的90%~95%。T2DM 的主要特征為持續(xù)高血糖,可造成腎、足、眼和神經(jīng)等多組織臟器損害,并引發(fā)多種并發(fā)癥[1]。世界衛(wèi)生組織最新公布的權(quán)威數(shù)據(jù)顯示,全球糖尿病患者的人數(shù)預(yù)計(jì)到2025年將達(dá)到3.7 億,并且有夸大化和年輕化的趨勢(shì)。 糖尿病已成為影響人體健康的關(guān)鍵因素,如何醫(yī)治糖尿病是人類共同面臨的問(wèn)題與挑戰(zhàn)[2]。

        胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)是T2DM的主要發(fā)病原因之一,它是胰島素靶器官或組織對(duì)正常水平的胰島素敏感性和反應(yīng)性不足的一種病理狀態(tài),主要表現(xiàn)為外周組織,如脂肪、骨骼肌、肝臟組織等對(duì)葡萄糖的攝取和利用效率降低[3]。研究表明,胰島素抵抗貫穿于糖尿病發(fā)生、 發(fā)展過(guò)程,是造成各種慢性并發(fā)癥的重要病理基礎(chǔ)。如何對(duì)其進(jìn)行有效調(diào)節(jié)是治療糖尿病的重要靶點(diǎn)之一。此外,大量研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激是導(dǎo)致IR 的關(guān)鍵因素,已知在發(fā)生IR 的大鼠中,肝臟超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和總谷胱甘肽(Glutathione peroxidase,GSH)均顯著降低,而代謝產(chǎn)物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)蓄積[4]。

        辣木(Moringa oleifera Lam.)為辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木,在我國(guó)的熱帶和亞熱帶地區(qū),如云南、福建、廣東等地被廣泛種植[5]。 辣木營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,且具有較高的藥用價(jià)值,其各部位如葉、根、種子、樹(shù)皮、果實(shí)、鮮花和未成熟的豆莢等都能入藥,具有降血脂、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保肝護(hù)腎、抗菌和抗病毒等功能[6]。

        異硫氰酸酯是一類含有R-N=C=S 結(jié)構(gòu)的化合物,具有殺菌[7]、抗氧化[8]、抗癌[9]及降血糖和降血脂[10]等生物活性。 最新研究表明,辣木葉和辣木籽中富含異硫氰酸酯[11],具有與其它十字花科蔬菜中的異硫氰酸酯化合物相同的藥效團(tuán) (R-N=C=S),然而,由于辣木異硫氰酸酯存在芳香環(huán)和鼠李糖部分,其在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與其它異硫氰酸酯化合物有一定區(qū)別[12]。辣木異硫氰酸酯(MIC-1)是辣木中含量最高的一種異硫氰酸酯,已有研究證明其具有體外抗炎和抗氧化活性[13]。 此外,大量證據(jù)顯示MIC-1 可能是辣木調(diào)控糖脂代謝的主要活性物質(zhì)[14-15]。 本研究以MIC-1 為試驗(yàn)材料,研究其對(duì)棕櫚酸(Palmitic acid,PA)誘導(dǎo)的C2C12 肌管細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用,明確MIC-1 調(diào)控糖代謝的生物活性。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        C2C12 成肌細(xì)胞從中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所獲得。 辣木籽,云南天佑科技開(kāi)發(fā)有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、無(wú)酚紅DMEM 培養(yǎng)基,Hyclone 公司;胎牛血清(Fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、馬血清(Horse serum,HS),BI 公司;青霉素-鏈霉素、10%SDS、1 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)、1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒,碧云天公司;牛胰島素(Insulin,INS),江蘇萬(wàn)邦生物醫(yī)藥股份有限公司;胰酶-EDTA 消化液、細(xì)胞裂解液、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、棕櫚酸(PA)、 噻唑藍(lán) (MTT)、 一氧化氮 (Nitric oxide,NO)、微量丙二醛(MDA),solarbio 公司;葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒、糖原測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH)測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所; 丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1(Phosphoinositide-dependent protein kinase-1,PDK1)、蛋白激酶B (Protein kinase B,AKT)、 磷酸化AKT(p-AKT)(Ser407) 和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glucose transporter 4,GLUT4)、β-Tubulin 抗體,萬(wàn)類生物科技有限公司;二抗HRp Rabbit Anti-Goat lgG、HRp Mouse Anti-Goat lgG,ABclonal 公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        多功能酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司; 二氧化碳培養(yǎng)箱,蘇州貝茵醫(yī)療器械有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,Invitrogen 有限公司;倒置熒光顯微鏡,蔡康光學(xué)有限公司;恒溫金屬浴,上海一恒科技有限公司;電子分析天平FA2004,沈陽(yáng)龍騰電子有限公司; 紫外分光光度計(jì),日本Shimodzu公司;4 ℃冰箱、-80 ℃冰箱,海爾公司;Z36HK 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),德國(guó)Hermle Labortechnik GmbH 公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 MIC-1 的制備 辣木籽粉碎后用石油醚去油,以料液比(g/mL)1 ∶60,溫度30 ℃,pH 5,時(shí)間9 h 的提取條件獲得酶解提取液,采用萃取、減壓濃縮及重結(jié)晶獲取純凈晶體,備用,純度達(dá)98%[16]。

        1.3.2 C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)、 傳代與分化生長(zhǎng) 細(xì)胞傳代:C2C12 成肌細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),至80%~90%時(shí)進(jìn)行胰酶消化,終止消化后加生長(zhǎng)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,接種傳代。

        細(xì)胞分化: 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%左右,換為2%HS DMEM 分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5~7 d,隔天換液,C2C12 成肌細(xì)胞90%分化為肌管細(xì)胞后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[17]。

        1.3.3 C2C12-IR 模型建立 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 成肌細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度置于96 孔板中。 待細(xì)胞分化為肌管細(xì)胞后,立即加入2%FBS 無(wú)酚紅DMEM 培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,每組8 個(gè)平行。 然后用含不同濃度PA(0.25,0.5,0.75 mmol/L)及含100 nmol/L INS 的2%FBS 無(wú)酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h[18],取上清培養(yǎng)液,采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒檢測(cè)葡萄糖含量,以空白孔葡萄糖含量減去樣品孔葡萄糖含量,計(jì)算出各孔葡萄糖消耗量,確定最佳造模濃度。

        1.3.4 C2C12-IR 細(xì)胞存活率檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 成肌細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接板96 孔板,待細(xì)胞分化為肌管細(xì)胞后,換含2%FBS的無(wú)酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。然后用含不同濃 度 MIC -1 (0,0.5,1,2,4,8,16 μmol/L),100 nmol/L INS 和0.5 mmol/L PA 的2%FBS無(wú)酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞16 h。 棄上清,每孔加入100 μL 的0.5 mg/mL MTT 的培養(yǎng)基4 h,棄去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL DMSO,在492 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

        1.3.5 C2C12-IR 細(xì)胞葡萄糖消耗量檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 成肌細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接板96 孔板,待細(xì)胞分化為肌管細(xì)胞后,換含2%FBS 的無(wú)酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,按上述方法給藥處理細(xì)胞16 h,取上清,采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒,檢測(cè)細(xì)胞上清葡萄糖含量,并計(jì)算得到葡萄糖消耗量。

        1.3.6 C2C12-IR 細(xì)胞糖原含量檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 成肌細(xì)胞以5×105個(gè)/皿的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿,待細(xì)胞分化為肌管細(xì)胞后,換含2%FBS 的無(wú)酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,然后用含不同濃度MIC-1 (0,2,4,8 μmol/L)、100 nmol/L INS 和0.5 mmol/L PA 的2%FBS無(wú)酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞16 h。每組設(shè)3 個(gè)重復(fù),重復(fù)3 次。 給藥16 h 后,收集各組細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次,細(xì)胞勻漿后按BCA 法測(cè)定蛋白含量,并用硫酸蒽酮法測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)糖原含量,按照公式(1)計(jì)算肌糖原含量:

        1.3.7 C2C12-IR 細(xì)胞MDA、NO 含量及GSH 活力檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 成肌細(xì)胞以5×105個(gè)/皿的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞分化為肌管細(xì)胞后,換含2%FBS 的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,按1.3.6 節(jié)的給藥方式處理細(xì)胞,每組設(shè)3 個(gè)重復(fù),重復(fù)3 次。 給藥16 h 后,收集各組細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次,細(xì)胞勻漿后按BCA 法測(cè)定蛋白含量,MDA、NO 含量及GSH 活力的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

        1.3.8 C2C12-IR 細(xì)胞PI3K/AKT 通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 成肌細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞分化為肌管細(xì)胞后,換含2%FBS 的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,按1.3.6 節(jié)的給藥方式處理細(xì)胞,每組設(shè)3 個(gè)重復(fù),重復(fù)3 次。 給藥16 h 后,用預(yù)冷的PBS 漂洗細(xì)胞,每皿加入100 μL 蛋白質(zhì)裂解液,在冰上裂解30 min,將細(xì)胞刮下收集于1.5 mL 離心管中,12 000×g,4 ℃離心10 min,取蛋白質(zhì)上清液,BCA 試劑盒測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,4 ℃過(guò)夜孵育一抗,常溫孵育二抗1 h,顯色拍照,通過(guò)Image J 軟件分析蛋白質(zhì)條帶,定量檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

        試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad prism、ImageJ 等軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),各項(xiàng)指標(biāo)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,組間比較采用單因素方差分析,* 表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 C2C12-IR 細(xì)胞模型的建立

        為了明確C2C12-IR 模型的建立方法,用不同濃度的PA(0.25,0.5,0.75 mmol/L 和100 nmol/L INS 共同處理C2C12 肌管細(xì)胞16 h,并以葡萄糖消耗量為檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果如圖1 所示,與對(duì)照組相比,INS 組葡萄糖消耗量顯著增加 (P<0.01);與INS 組相比,不同劑量PA 組葡萄糖消耗量均顯著降低(P<0.001),且葡萄糖消耗量從INS 組的8.07 mmol/L 分別降低到4.75 mmol/L (P<0.001),2.87 mmol/L(P<0.001),3.82 mmol/L(P<0.001)。 結(jié)果表明,0.5 mmol/L 的PA 誘導(dǎo)的C2C12 細(xì)胞胰島素抵抗程度最強(qiáng),因此選擇0.5 mmol/L 的PA 作用C2C12 肌管細(xì)胞16 h 作為最佳建模條件。

        圖1 不同濃度PA 對(duì)C2C12 肌管細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of PA on glucose consumption of C2C12 myotube cells

        2.2 MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞存活率的影響

        為研究MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞存活率的影響,用不同濃度的MIC-1(0,0.5,1,2,4,8,16 μmol/L)處理C2C12-IR 細(xì)胞16 h,然后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖2 所示,與對(duì)照組相比,INS 增加了細(xì)胞的存活率; 與INS 組相比,PA顯著降低了細(xì)胞的存活率,然而與C2C12-IR 組相比,MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞的存活率沒(méi)有影響,結(jié)果表明,MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞沒(méi)有毒性。

        圖2 不同濃度的MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of MIC-1 on the survival rate of C2C12-IR cells

        2.3 MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

        為了明確MIC-1 是否具有改善胰島素抵抗的作用,用不同濃度的MIC-1(0,0.5,1,2,4,8,16 mol/L)處理C2C12-IR 細(xì)胞16 h,采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)葡萄糖消耗量。結(jié)果如圖3 所示,與對(duì)照組相比,INS 顯著增加肌管細(xì)胞葡萄糖消耗量(P<0.001); 與INS 組相比,C2C12-IR 組葡萄糖消耗量顯著降低(P<0.001);然而與C2C12-IR 組相比,MIC-1 呈劑量依賴的方式顯著增加C2C12-IR 細(xì)胞葡萄糖消耗量,且葡萄糖消耗量從C2C12-IR組的4.48 mmol/L 分別增加到6.33 mmol/L(P<0.001),6.47 mmol/L (P<0.001),7.05 mmol/L(P<0.001),9.43 mmol/L(P<0.001)。 以上結(jié)果表明MIC-1 具有改善IR 的作用。

        圖3 MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.3 Effect of MIC-1 on glucose consumption in C2C12-IR cells

        2.4 MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞肝糖原含量的影響

        為了明確MIC-1 是否能促進(jìn)C2C12-IR 細(xì)胞對(duì)糖的儲(chǔ)存能力,通過(guò)對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞糖原含量的測(cè)定來(lái)確定糖原的合成情況。如圖4 所示,與對(duì)照組相比,INS 顯著增加了肌管細(xì)胞糖原含量(P<0.001);與INS 組相比,C2C12-IR 組肝糖原含量顯著降低(P<0.01);然而,用不同濃度的MIC-1(2,4,8 μmol/L) 處 理C2C12-IR 細(xì) 胞16 h 后,C2C12-IR 細(xì)胞糖原含量顯著增加,且具有明顯的劑量依賴性,糖原含量從C2C12-IR 組的0.089 mg/mg pro 分別增加到0.094 mg/mg pro(P<0.05),0.109 mg/mg pro(P<0.001),0.14 mg/mg pro(P<0.001)。 結(jié)果表明,MIC-1 可通過(guò)促進(jìn)糖原合成提高C2C12-IR 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取利用。

        圖4 MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞糖原含量的影響Fig.4 Effect of MIC-1 on C2C12-IR cells glycogen content

        2.5 MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

        如圖5 所示,與對(duì)照組相比,INS 對(duì)C2C12 肌管細(xì)胞MDA 水平、NO 水平和GSH 活力沒(méi)有影響。 與INS 組相比,C2C12-IR 組MDA 水平(P<0.01)和NO 水平(P<0.05)顯著升高,GSH 活力(P<0.05)顯著下降,表明C2C12-IR 細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)。 然而與C2C12-IR 組相比,MIC-1 以濃度依賴的方式顯著降低了細(xì)胞MDA 和NO 水平,且當(dāng)MIC-1 劑量為8 μmol/L 時(shí),C2C12-IR 細(xì)胞的MDA 水平從2.13 nmol/mg pro 降低到0.63 nmol/mg pro (P<0.01),NO 水平從1.08 μmol/L 降低到0.19 μmol/L (P<0.05),GSH 活力從0.14 μmol/mg pro 增加到0.24 μmol/mg pro(P<0.05)。 結(jié)果表明MIC-1 能改善IR 的氧化損傷。

        圖5 MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig.5 Effect of MIC-1 on oxidative stress of C2C12-IR cells

        2.6 MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

        如圖6 所示,與INS 組相比,C2C12-IR 組PDK1(P<0.05)、p-AKT(P<0.001)和GLUT4(P<0.05)蛋白表達(dá)水平顯著降低;然而與C2C12-IR組相比,MIC-1 劑量為8 μmol/L 時(shí),顯著增加了PDK1(P<0.05)、p-AKT(P<0.05)和GLUT4(P<0.05)的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明MIC-1 對(duì)IR 的改善可能與細(xì)胞中AKT 蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)有關(guān),并且MIC-1 通過(guò)促進(jìn)GLUT4 的表達(dá)提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用,從而降低血糖。

        圖6 MIC-1 對(duì)C2C12-IR 細(xì)胞PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of MIC-1 on the expression of PI3K/AKT signaling pathway related proteins in C2C12-IR cells

        3 討論

        研究發(fā)現(xiàn)辣木各部位的提取物顯示出不同的降血糖作用。 汪芳等[19]發(fā)現(xiàn)辣木葉多糖具有降血糖活性,能顯著增加HepG2 細(xì)胞葡萄糖的消耗量。 吉莉莉[20]發(fā)現(xiàn)辣木葉總黃酮中的異懈皮苷具有降低糖尿病大鼠血糖,抑制胰島素抵抗,改善胰島功能的作用。Ndong 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠食用辣木葉粉末后,血糖明顯降低,表明辣木葉可以改善葡萄糖耐量。同時(shí)研究證明,辣木籽粉及其提取物有一定的降血糖功效,在糖尿病的預(yù)防和治療方面具有巨大研究潛力[22-23]。然而大量的辣木降糖研究均以粗提物為原材料,辣木降血糖的活性成分仍不清楚。

        研究發(fā)現(xiàn)富含異硫氰酸酯的辣木籽提取物通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體iNOS 和NQO1 等基因表達(dá),從而發(fā)揮減輕體重,減少肥胖,改善葡萄糖耐量,減少炎癥基因表達(dá)和增加抗氧化基因表達(dá)的作用[24]。 從新鮮辣木葉制得的富含異硫氰酸鹽的辣木濃縮物(含1%~3%異硫氰酸酯)可顯著降低肝脂肪、糖異生、胰島素、膽固醇和炎癥標(biāo)志物的水平[25]。 因此,本研究對(duì)于辣木異硫氰酸酯是否有降糖作用提出了設(shè)想。 以實(shí)驗(yàn)室提取的高純度MIC-1 為試驗(yàn)材料,通過(guò)建立C2C12-IR 細(xì)胞模型,明確MIC-1 抑制氧化應(yīng)激改善胰島素抵抗的作用,并且其作用機(jī)制可能與PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。

        T2DM 是一種與高血糖相關(guān)的復(fù)雜的代謝紊亂相關(guān)性疾病,高血糖會(huì)導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生大量活性氧、活性氮,在氧化系統(tǒng)中,主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO-)、過(guò)氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等,進(jìn)而在不同程度對(duì)線粒體功能造成損傷,引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[26]。 氧化應(yīng)激狀態(tài)的顯著性特征為氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)水平的升高,ROS化學(xué)性質(zhì)活潑,不易被檢測(cè),MDA 是ROS 發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)生成的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,其水平的高低可以直接反映機(jī)體受ROS 攻擊的程度強(qiáng)弱以及氧化水平的高低[27]。 在眾多的氧化應(yīng)激指標(biāo)中,MDA 含量可以直接反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化速率和強(qiáng)度,GSH 與SOD 可以顯示機(jī)體的抗氧化強(qiáng)度,均是反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的經(jīng)典指標(biāo),因此常用于評(píng)價(jià)機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)[28]。 在本研究中,MIC-1 能降低氧化物MDA、NO 的含量,同時(shí)提高GSH 的活力,結(jié)果表明MIC-1 能改善IR 的氧化損傷。

        IR 是2 型糖尿病的主要特征,大多數(shù)IR 發(fā)生在肝臟、骨骼肌和脂肪組織中[29],骨骼肌是負(fù)責(zé)葡萄糖代謝的主要外周組織。因此,促進(jìn)肌細(xì)胞葡萄糖消耗成為研究降糖的重要指標(biāo)。 肌糖原是機(jī)體中糖原的一種儲(chǔ)存形式,一定程度反映了機(jī)體內(nèi)血糖的平衡情況。 本研究以C2C12 肌管細(xì)胞構(gòu)建胰島素抵抗模型探究MIC-1 改善胰島素抵抗的作用,從而探究MIC-1 的降糖作用。 研究發(fā)現(xiàn)MIC-1 以劑量依賴性方式增加C2C12-IR 細(xì)胞的葡萄糖消耗量。 并且MIC-1 處理C2C12-IR 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞糖原含量增加,反映了MIC-1 促進(jìn)C2C12-IR 細(xì)胞糖的儲(chǔ)存能力。 綜上可知,MIC-1能通過(guò)促進(jìn)C2C12-IR 細(xì)胞葡萄糖消耗量以及糖原的合成,發(fā)揮降血糖作用,并降低氧化應(yīng)激,改善胰島素抵抗。

        在IR 狀態(tài)下,骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取和利用存在障礙,其分子機(jī)制主要是PI3K 信號(hào)通路活性的下降,表現(xiàn)為PI3K 活性及AKT 磷酸化水平明顯下降。PDK1 和AKT 是PI3K 下游的信號(hào)分子[30]。PDK1 被激活后可進(jìn)一步使AKT 被激活,磷酸化的AKT 將GLUT4 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)膜上,從而促進(jìn)葡萄糖吸收[31]。 在本研究中MIC-1 顯著升高了PDK1、p-AKT 和GLUT4 的蛋白表達(dá),刺激PI3K/AKT 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),增強(qiáng)了細(xì)胞周圍的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)水平。

        綜上所述,PA 誘導(dǎo)的IR 中,MIC-1 會(huì)緩解氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷,通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路,增加GLUT4 的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,從而改善IR。 研究結(jié)果可為MIC-1調(diào)控糖代謝作用的深入研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為辣木資源的深加工奠定科學(xué)依據(jù)。

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