鄭振霄，朱 凱，戴志遠*

（1 浙江工商大學 海洋食品研究院 杭州 310012 2 浙江工商大學 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310012）3 浙江工商大學 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州 310012）

南極磷蝦（Euphausia superba）是生活在南極海域的一種甲殼類浮游生物。據(jù)統(tǒng)計，南極磷蝦的資源儲存量約為3.80 億t，并且每年的繁殖量也非常巨大，在3.42～5.36 億t 之間。 目前，南極磷蝦的捕撈量約為20 萬t/年，僅為其限制性捕撈量的1/3，這表明全球南極磷蝦資源開發(fā)潛力巨大[1-2]。南極磷蝦主要被加工成餌料，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)，然而，因養(yǎng)殖量有限且養(yǎng)殖餌料資源豐富，故南極磷蝦資源的利用率并不高[3]。 近年來，隨著人們對南極磷蝦營養(yǎng)價值的認可，南極磷蝦功能食品成為開發(fā)利用其資源的重要途徑。 南極磷蝦中富含磷脂結(jié)合型n-3PUFA，與魚油中的甘油酯型的n-3PUFA 相比，更容易被人體吸收，因此南極磷蝦油成為南極磷蝦資源高效利用的一種潛力產(chǎn)品[4]。

炎癥，即平時所說的“發(fā)炎”，是生物組織受到某種刺激，如外傷、感染等損傷因子的刺激，所發(fā)生的一種以防御反應為主的基本病理過程。 研究表明，海洋脂質(zhì)對炎癥具有抑制作用[5]。付元慶[6]以脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7 細胞為炎癥的體外模型，研究了厚殼貽貝脂質(zhì)提取物對炎癥的抑制作用，結(jié)果表明：厚殼貽貝脂質(zhì)提取物可以顯著抑制一氧化氮（NO）的釋放，調(diào)節(jié)促炎/抗炎因子平衡，并最終通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的活化，抑制炎癥級聯(lián)反應。孫翰[7]采用硫酸葡聚糖鈉誘導的C57BL/6 小鼠為炎癥模型，研究魚油對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)炎癥反應的抑制作用，結(jié)果表明：魚油可以通過抑制花生四烯酸代謝通路，抑制促炎因子IL-1β 的表達，進而抑制炎癥反應。 目前，對于南極磷蝦油的研究主要集中在其制備工藝及抗氧化，關(guān)于南極磷蝦油抗炎的研究較為少見。本文以LPS 誘導的RAW264.7 細胞為炎癥模型，研究南極磷蝦油的抗炎功效，并從基因水平分析南極磷蝦油對炎癥因子及關(guān)鍵酶的調(diào)控作用，初步探索南極磷蝦油抗炎的作用機理，旨在為南極磷蝦資源的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨噬細胞RAW264.7，中國科學院上海細胞庫；南極磷蝦油，實驗室自制，制備方法參考俞喜娜等[8]的方法；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基，海克隆生物化學制品（北京）有限公司；青霉素-鏈霉素溶液、胰酶、LPS，北京索萊寶科技有限公司；95%乙醇 （分析純），杭州雙林化工試劑廠；異丙醇（分析純）、氯仿（分析純），國藥集團（上海）有限公司。

1.2 主要設備與儀器

恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱（E163302）、臺式低溫高速離心機（Micro17R），美國Thermo Fisher Scientific 公司；恒溫水浴鍋（DKS-12），上海森信實驗儀器有限公司；凈化生物超凈工作臺（YJ-840），蘇州凈化設備有限公司；倒置顯微鏡（AE2000），麥克奧迪實業(yè)集團中國有限公司；PCR 儀（T100）、熒光定量PCR 儀（CFX96），美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦油相關(guān)指標測定 采用1260Infinity 蒸發(fā)光高效液相色譜儀測定南極磷蝦油中磷脂的含量[9]，采用LC-20AT 紫外高效液相色譜儀[10]對磷蝦油中的蝦青素進行測定，磷蝦油中維生素A 和生育酚含量的測定參考Plozza 等[11]的方法，膽固醇的含量參考食品安全國家標準食品中膽固醇的測定方法（GB 5009.128-2016）[12]測得，采用氣相色譜法[13]測定南極磷蝦油中的脂肪酸組成。

1.3.2 細胞的培養(yǎng)及分組 取適量胎牛血清與DMEM 高糖培養(yǎng)基混勻，而后加入適量青鏈霉素混合液，配制成細胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 μg/mL 的鏈霉素）。RAW264.7 細胞培養(yǎng)在含10 mL 細胞培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)皿（直徑為5 cm）中，并置于細胞培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2），每2 d 傳代1 次。 取適量南極磷蝦油溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，配制成1 mg/mL 的母液，之后取適量母液，加到細胞培養(yǎng)液中制得含80（KO1），120（KO2），160（KO3）μg/mL 南極磷蝦油的細胞培養(yǎng)液。

試驗分組：LPS 刺激組，細胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 的細胞培養(yǎng)液中24 h；空白對照組，細胞培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)液中24 h；KO1 組，細胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 和80 μg/mL 南極磷蝦油的細胞培養(yǎng)液中24 h；KO2 組，細胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 和120 μg/mL 南極磷蝦油的細胞培養(yǎng)液中24 h；KO3 組，細胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 和160 μg/mL 南極磷蝦油的細胞培養(yǎng)液中24 h；LPS 和南極磷蝦油的濃度由前期細胞活力試驗確定。

1.3.3 炎癥相關(guān)因子的測定 采用倒置顯微鏡（MoticAE2000）對細胞進行形態(tài)學觀察（20×）；細胞吞噬能力的測定： 采用中性紅法檢測細胞吞噬能力[14]；髓過氧化物酶（MPO）活力的測定：按照MPO 試劑盒 （南京建成，A044） 的說明書進行操作；NO 的測定：按照一氧化氮（NO）測定試劑盒（南京建成，A12-1-2）的說明書進行操作；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）分泌量的測定：按照試劑盒（碧云天，PT512）的說明書進行操作；白細胞介素-1β（IL-1β） 分泌量的測定： 按照試劑盒 （碧云天，PI301）的說明書進行操作；白細胞介素-6（IL-6）分泌量的測定：按照試劑盒（碧云天，PI326）的說明書進行操作；誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、TNF-α、IL-1β、IL-6 基因的相對表達量采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法進行測定，序列由上海生物生工股份有限公司負責合成，序列信息如表1 所示，具體反應條件參考Zheng 等[15]的方法。

表1 引物序列詳細信息Table 1 Primer sequence details

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標準偏差”的形式，顯著性分析采用SPSS21.0 分析，圖片采用origin9.0和Photoshop CC2015.5 進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦油脂肪酸組成及微量物質(zhì)的含量分析

南極磷蝦油中的脂肪酸組成（>1%）及微量物質(zhì)的含量分析如表1 所示。總體上看，南極磷蝦油中的EPA（C20：5）占比最高為22.78%，棕櫚酸（C16：0）的占比次之為21.01%，DHA（C22：6）的占比排在第3 位，為13.71%。 從分類上來看，南極磷蝦油中的多不飽和脂肪酸（PUFA）的占比最高，為36.49%，飽和脂肪酸（SFA）的占比次之，為28.66%，單不飽和脂肪酸（MUFA）的占比最低，為19.15%。 對于PUFA 占比，起到較大貢獻的是EPA 和DHA 這兩種n-3PUFA，其它脂肪酸的貢獻相對較少；對于SFA 占比，起到較大貢獻的是棕櫚酸（C16：0），其次是C14：0，其它脂肪酸貢獻相對較少；對于MUFA 而言，起到最大貢獻的是油酸（C18：1），其次為棕櫚油酸（C16：1）。值得一提的是，南極磷蝦油中的EPA 和DHA 的占比之和高達36.49%，這樣的占比處在很高的水平，高于鳀魚油 （15.88%）、 金槍魚油（16.78%）和沙丁魚油（25.58%）[16]等常見魚油制品原料中的占比。EPA 和DHA 是兩種具有多種生物活性的n-3PUFA，研究表明DHA 和EPA 在促進大腦發(fā)育，降血脂，抗炎等方面都發(fā)揮了較好的作用，且美國FDA 于2019年批準了以n-3PUFA 為主要成分的處方藥，說明EPA 和DHA 在藥品領(lǐng)域也有巨大的應用潛力[17]。 人體不能夠合成EHA和DHA，人體所需的DHA 和EPA 通常是靠攝入海洋魚類而獲得，海洋魚類中的EPA 和DHA 的源頭在于海洋浮游生物，南極磷蝦是以海洋浮游生物為食，相較于魚類，南極磷蝦在EPA 和DHA的傳遞鏈上更靠近源頭，因此EPA 和DHA 在南極磷蝦中的累積量更高[18]。

磷脂，也稱磷脂類、磷脂質(zhì)，是指含有磷酸的脂類，屬于復合脂，是生物膜的主要成分，具有重要的生理功能，南極磷蝦油中磷脂含量為52.97 g/100 g，遠高于金槍魚油（0.94 g/100 g）、金槍魚魚腦（10.00 g/100 g）、大黃魚卵（12.02 g/100 g）中的磷脂含量[19-21]。蝦青素是一種常見于海洋水產(chǎn)生物中的類胡蘿卜素，由于最先是從蝦中提取得到，故命名為蝦青素。蝦青素具有強大的抗氧化能力，可以通過清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化反應和低密度脂蛋白氧化。 南極磷蝦油中蝦青素的含量為8.21 mg/kg，與虹鱒中的含量（8.31 mg/kg）相似，高于大西洋鮭（7.12 mg/kg）[22]。此外，南極磷蝦油中還含有一定量的生育酚、維生素A 和膽固醇，這些物質(zhì)的存在也會對其功能產(chǎn)生一定影響。

表2 南極磷蝦油組分分析Table 2 Composition analysis of Antarctic krill oil

2.2 細胞形態(tài)變化

干預結(jié)束后，將細胞從培養(yǎng)箱中取出，放置在倒置顯微鏡下，仔細觀察細胞的形態(tài)變化（圖1）。正常的RAW264.7 呈圓形或橢圓形，細胞之間緊密接觸成簇貼壁生長，LPS 刺激后，RAW264.7 細胞出現(xiàn)分化，出現(xiàn)大面積分支，細胞的形態(tài)演變?yōu)樗鬆?，細胞膨大且出現(xiàn)觸角，細胞間的距離變大。南極磷蝦油干預組中，細胞的分支程度明顯減弱，細胞的梭變程度也明顯好轉(zhuǎn)，這說明南極磷蝦油可以有效緩解LPS 導致細胞的炎癥分化，具有抗炎作用，并且KO1 組的效果不如KO2 組和KO3組，KO2 組和KO3 組的效果相似。

圖1 細胞形態(tài)變化Fig.1 The morphologic changes of cells

2.3 細胞吞噬能力的變化

細胞吞噬作用是指生物體內(nèi)的某些特定細胞識別異物并將其吞入和消滅的功能，是生物的基本防衛(wèi)機制。細胞的吞噬過程可分成3 個步驟，首先吞噬細胞聚集在入侵異物周圍，然后，吞噬細胞對異物的識別，最后，吞噬細胞將異物包圍吞入細胞內(nèi)，通過溶酶體等物質(zhì)將異物消滅[23]。 因此，吞噬能力是衡量巨噬細胞內(nèi)炎癥反應程度的重要指標。 不同處理組細胞吞噬能力的變化如圖2a 所示，空白對照組細胞的吞噬能力為0.12，LPS 刺激后，細胞的吞噬能力顯著升高，達到0.49，說明LPS 刺激后細胞內(nèi)發(fā)生了嚴重的炎癥反應，迫使細胞啟動吞噬作用以清除異物，南極磷蝦油處理組的細胞吞噬能力出現(xiàn)了不同程度的下降，其中，KO1 組細胞吞噬能力為0.43，KO2 和KO3 組的細胞吞噬能力無顯著差別，分別為0.25 和0.23。

2.4 MPO 的變化

MPO 是中性粒細胞中含量較高的一種酶，凡是存在中性粒細胞浸潤的組織，都會伴隨MPO 活性的升高，因此MPO 被用來間接反映中性粒細胞浸潤，也被廣泛用于衡量炎癥反應的程度[24]。 不同處理組細胞中MPO 的活力如圖2b 所示，空白對照組細胞中MPO 的活力最低為1.78 U/L，LPS 刺激組細胞中的MPO 活力最高為6.95 U/L，南極磷蝦干預可以顯著降低細胞MPO 的活力，KO1 組、KO2 組和KO3 組MPO 活力分別為5.45，2.36，2.12 U/L，可以看出南極磷蝦油對細胞內(nèi)MPO 活力的抑制作用隨濃度升高而增強，并且當濃度超過KO2 后，抑制作用并沒有出現(xiàn)顯著增加。

2.5 NO 的變化

NO 是一種重要的氣態(tài)細胞信號分子和細胞毒性因子，NO 由NO 合酶（NOS）催化L-精氨酸而產(chǎn)生，其中誘導型NO 合酶（iNOS）分布在與炎癥相關(guān)的巨噬細胞內(nèi)。 正常情況下，細胞內(nèi)NO 的產(chǎn)量很少，當發(fā)生炎癥反應時，iNOS 被激活，細胞內(nèi)合成大量NO，過量的NO 會導致DNA 損傷，線粒體呼吸抑制，此外NO 還有可能與超氧陰離子結(jié)合生成氧化性很強的過氧亞硝基陰離子，引發(fā)細胞內(nèi)炎癥級聯(lián)瀑布反應，推動炎癥發(fā)展[25]。 不同處理組細胞上清液中NO 的產(chǎn)量如圖2c 所示，空白對照組中NO 的產(chǎn)量最少，僅為4 μmol/L，LPS 刺激后，細胞中NO 的產(chǎn)量出現(xiàn)了顯著增加，達到23 μmol/L，南極磷蝦油干預可以顯著抑制細胞內(nèi)NO的產(chǎn)生，其中KO1 組的干預效果顯著差于KO2 組和KO3 組，而KO2 組和KO3 組之間的差異不顯著。

圖2 細胞吞噬能力、MPO 活力和NO 產(chǎn)量的變化Fig.5 The changes of cell phagocytosis ability，MPO activity and NO production

2.6 炎癥因子的變化

當炎癥爆發(fā)時，大量的血液和白細胞聚集在炎癥發(fā)生部位，細胞中的炎癥信號通路如NF-κB、Jak/Stat 被激活并釋放多種促炎細胞因子，其中TNF-α、IL-1β 和IL-6 是促炎細胞因子中的重要代表，它們的分泌水平可以反映炎癥反應的程度，為進一步評價南極磷蝦油的抗炎效果，進一步考察了南極磷蝦油對炎癥因子分泌量的影響，結(jié)果如圖3a～3c 所示。 空白對照組中炎癥因子的分泌量均最低，TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌量分別為53，18，31 ng/L，LPS 刺激組中炎癥因子的分布量最高，分別為468，165，212 ng/L。 南極磷蝦油處理組中炎癥因子的分泌量均有所下降，其中KO2 組和KO3 組對炎癥因子分泌量的抑制作用更為顯著，對于炎癥因子來講，南極磷蝦油對TNF-α 的抑制作用顯著強于IL-1β 和IL-6。TNF-α 是炎癥反應過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內(nèi)皮細胞通透性增加，調(diào)節(jié)其它組織代謝活性，并促使其它細胞因子的合成和釋放，TNF-α 水平升高與自身免疫性疾病關(guān)系密切[26]。 不同處理組細胞中炎癥因子的表達量如圖3d～3f 所示，可以看出南極磷蝦油抑制了LPS 引發(fā)炎癥因子基因的表達量的升高，其中南極磷蝦油對TNF-α 的抑制作用更為顯著，這與炎癥因子分泌量的結(jié)構(gòu)相一致。

圖3 炎癥因子分泌量及基因表達量的變化Fig.3 The secretion and gene expression changes of inflammatory factor

2.7 關(guān)鍵酶（iNOS 和COX-2）基因表達量的變化

在諸多與炎癥相關(guān)的疾病中，iNOS 被認為是一種關(guān)鍵的限速酶，在類風濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化等疾病的病變過程中起著舉足輕重的作用。iNOS 的主要功能是誘導產(chǎn)生過量的NO，NO 可以直接參與與炎癥相關(guān)的生理活動，促進炎癥的發(fā)展。 COX-2 與iNOS 一樣，在正常的組織中幾乎不表達，一旦細胞受到炎癥刺激時，便會大量表達，由于COX-2 可以快速應答一系列促炎介質(zhì)和細胞因子，被認為是表征炎癥反應的重要指標[27]。 不同處理組細胞中iNOS 和COX-2 基因的表達量如圖4 所示。 LPS 刺激組細胞中iNOS 和COX-2 的表達量均為最高，空白組細胞中的表達量處于較低水平，不同濃度南極磷蝦油處理后細胞中iNOS和COX-2 的表達量均顯著低于LPS 組，且表達量隨著南極磷蝦油濃度的增加而減少，這說明，南極磷蝦油可以顯著抑制細胞中iNOS 和COX-2 的表達，且這種作用隨著濃度的增加而增強。

圖4 iNOS 和COX-2 基因表達的變化Fig.4 The gene expression changes of iNOS and COX-2

3 討論

炎癥反應作為一種基礎(chǔ)性生理過程，是自身抵御異物入侵的保護屏障，然而當炎癥反應過度時，長時間的炎癥反應會損傷組織，誘發(fā)炎癥性疾病，如心血管疾病、肥胖、炎癥性腸炎等。 長期以來，膳食補充魚油制品已經(jīng)被用于諸多炎癥疾病的管控，原因是魚油中富含具有抗炎作用的n-3PUFA。 近年來，隨著人們對南極磷蝦資源認識的不斷深入，南極磷蝦油在抗炎方面也展現(xiàn)了巨大的潛力，首先，由于南極磷蝦更接近n-3PUFA 傳遞食物鏈的初始端，南極磷蝦油中n-3PUFA 的含量高于普通魚油，其次，南極磷蝦油中富含磷脂，磷脂型n-3PUFA 與細胞膜的融合性優(yōu)于魚油中的甘三酯型的n-3PUFA，再次，南極磷蝦油中還含有蝦青素、生育酚等生物活性物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)氧化應激反應。

巨噬細胞在炎癥反應過程中扮演了重要的角色，當細胞受到炎癥刺激時，巨噬細胞會通過細胞內(nèi)信號分子傳導，使自身形態(tài)發(fā)生改變，包圍在刺激物周圍，并通過吞噬作用將其清除，炎癥反應越強烈，巨噬細胞的吞噬能力就越強，因此檢測細胞的吞噬能力能反映炎癥反應的強弱。 在本研究中LPS 刺激可以顯著提高細胞的吞噬能力，南極磷蝦油干預后細胞的吞噬能力均有所下降，而低濃度南極磷蝦油干預的效果不顯著，中、高濃度南極磷蝦油展現(xiàn)了較好的干預效果。 中性粒細胞浸潤是炎癥反應中的另一個重要特征，表現(xiàn)為炎癥細胞聚集在炎癥灶周圍，MPO 是中性粒細胞功能被激活的標志，其水平及活性變化代表嗜中性多形核白細胞功能和狀態(tài)的改變，在本試驗中，南極磷蝦油顯著抑制了LPS 導致的細胞內(nèi)MPO 活性的升高，這表示南極磷蝦油可以抑制中性粒細胞的炎癥性浸潤。

炎癥因子是細胞在受到炎癥刺激后產(chǎn)生的一系列小分子生物活性物質(zhì)，常見的炎癥因子主要有TNF-α、IL-1、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，這些炎癥因子可以通過促進細胞的分化，誘導靶細胞程序性死亡等途徑參與炎癥反應[28]。 本研究的結(jié)果表明，南極磷蝦油可以抑制炎癥因子基因表達，減少促炎因子的分泌，抑制炎癥反應的發(fā)展，并且南極磷蝦油對TNF-α 的抑制作用更為顯著。 iNOS 和COX-2 是炎癥反應過程中的關(guān)鍵誘導酶，它們在炎癥反應中的主要作用是合成炎癥介質(zhì)NO、前列腺素和白細胞三烯，這些物質(zhì)都是很強的促炎介質(zhì)，即使在低濃度下也會引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，在本研究中，南極磷蝦油對iNOS 和COX-2 的表達均起到了一定的抑制作用，并且高濃度南極磷蝦油的抑制作用更為顯著。

4 結(jié)論與展望

本文以LPS 誘導的RAW264.7 細胞為炎癥模型，采用不同濃度的南極磷蝦油對其進行干預，通過細胞的形態(tài)、 細胞吞噬能力、 髓過氧化物酶活力、促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）等指標分析了南極磷蝦油的抗炎能力，并通過炎癥因子及炎癥關(guān)鍵酶（iNOS 和COX-2）基因的表達初步研究了其抗炎的機理，研究表明，南極磷蝦油可以通過抑制炎癥關(guān)鍵酶和炎癥因子基因的表達，降低促炎細胞因子的分泌，發(fā)揮抗炎作用，并且當南極磷蝦油的濃度高于KO2 組時，便展現(xiàn)了較好的抗炎效果，本研究進一步拓展了南極磷蝦油的生物學效應，并為南極磷蝦的資源開發(fā)提供了參考，今后的研究將會從南極磷蝦油組分與其抗炎作用之間的關(guān)聯(lián)展開，進一步明確南極磷蝦油的抗炎機制。