鄭奎 婁美娜 綜述 張英謙 審校

（1.河北省兒童醫(yī)院心內(nèi)科/河北省小兒心血管重點實驗室，河北石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學研究生學院，河北石家莊 050017）

擴張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）是兒童心肌病中最常見的類型，占50%~60%。兒童DCM的病因復雜，常導致患兒心力衰竭或心源性猝死，其顯著的特點是進展快和病死率高［1-2］。其中遺傳病因在兒童DCM中占有重要地位，30%~40%的患兒與遺傳相關［1-2］。編碼肌聯(lián)蛋白（titin）的TTN基因截斷突變（TTN-truncating variant，TTNtv）是成人DCM最常見的遺傳突變，在家族性DCM中約占25%，散發(fā)性DCM病例中約占18%［3］。由于成人DCM發(fā)病率高，關于成人DCM的遺傳研究已取得了一定的進展［4］，但關于兒童的DCM遺傳研究比較落后，其治療也多借鑒于成人DCM的治療方案。多項研究報道TTNtv導致的成人DCM預后良好，對治療有良好的反應，但對于兒童患者來說多數(shù)預后不良，而且容易發(fā)生惡性心律失常和心源性猝死［1，5］。當前已有基因治療用于杜氏肌營養(yǎng)不良癥［6］。本文總結了TTN基因突變與兒童DCM發(fā)病的關系、基因型-表型關系及相關治療研究進展，為DCM患兒的預后評估、個體化管理和精準治療，包括未來基因治療的研究，提供參考。

1 肌聯(lián)蛋白與肌節(jié)

肌聯(lián)蛋白由TTN基因編碼，位于2號染色體q31區(qū)段，包含364個外顯子，廣泛的mRNA剪接可產(chǎn)生多種肌聯(lián)蛋白亞型，與心臟相關的亞型主要為N2B（3 MDa）和N2BA（3.2~3.8 MDa）［4］。此外，還包括少量novex-3亞型，以及最近新發(fā)現(xiàn)的C-端Cronos亞型［7-8］。肌節(jié)是橫紋肌收縮的最基本單位。肌聯(lián)蛋白是肌節(jié)的重要組成部分，主要由4個亞基組成，分別對應肌節(jié)的4個結構域：Z盤、I帶、A帶和M線，從Z盤到M線縱向橫跨半個肌節(jié)，對肌節(jié)的組裝、機械感應和信號傳遞發(fā)揮著重要作用，同時決定著肌原纖維的延伸性和被動張力［9］。肌聯(lián)蛋白的末端被T-cap3錨定在Z盤N端區(qū)域，為肌節(jié)的機械傳感發(fā)揮著重要作用［10］。I帶區(qū)域毗鄰Z盤，具有高度彈性特征，提供類似“彈簧樣”功能，主要由免疫球蛋白樣結構域、PEVK區(qū)（富含脯氨酸、谷氨酸、纈氨酸和賴氨酸殘基）和N2B獨特序列（N2B-us）組成［10］。A帶區(qū)域內(nèi)主要由相對穩(wěn)定的纖維連接蛋白3型和免疫球蛋白樣超重復序列組成，主要參與調(diào)節(jié)粗肌絲的長度。A帶區(qū)域毗鄰并嵌入M帶的羧基末端絲氨酸-蘇氨酸激酶結構域，參與許多信號通路的傳導，調(diào)節(jié)肌節(jié)主動收縮力［10-11］。

2 TTNtv可能導致DCM發(fā)病的分子機制

當前國內(nèi)外關于TTNtv導致兒童DCM發(fā)病機制的研究報道較少，大多是關于成人DCM的遺傳研究。有研究報道在成人DCM中18%~25%的患者與TTNtv相關，此外2%~3%的健康人群攜帶TTNtv［3-4，8，11］。不同隊列研究報道兒童 DCM 人群中TTNtv的發(fā)生率有差異，有研究表明DCM患兒中很少發(fā)生TTNtv［12］。而Khan等［13］對106例兒童DCM遺傳病因分析發(fā)現(xiàn)約9%的患兒攜帶TTN基因突變，并發(fā)現(xiàn)DCM患兒的發(fā)病年齡與TTNtv檢出率密切相關，青少年（26%）明顯高于嬰幼兒（6%）。Wang等［1］對我國46例DCM患兒進行遺傳病因研究，顯示約13%的患兒與TTNtv相關。TTNtv導致DCM的確切機制尚未得到明確的證實，其分子發(fā)病機制也一直存在爭議。在具有TTNtv遺傳性家族史的DCM患者中，遵循常染色體顯性遺傳，但同時明顯存在不完全和年齡依賴的外顯率［4，11］。肌聯(lián)蛋白可通過多種機制調(diào)節(jié)其彈性及被動張力，當前認為包括TTN截斷發(fā)生的位置、肌聯(lián)蛋白亞型轉錄、翻譯后修飾（氧化、磷酸化等）、單倍體劑量不足、環(huán)境因素影響等與DCM的發(fā)生、發(fā)展密切相關。此外也有研究認為TTNtv可直接產(chǎn)生異常的肌聯(lián)蛋白，并通過一種“毒肽”機制對肌節(jié)和心肌細胞造成直接損害，但當前認為“毒肽”模型機制尚未在人類心臟研究中得到證實［4，11，14］，下文將進行簡要介紹。

2.1 TTNtv發(fā)生的位置與其致病性相關

DCM最常見的遺傳病因是TTNtv，其多為雜合子變異，包括錯義突變、框移突變、剪切突變、無義突變、重復突變和拷貝數(shù)變異等，這些突變預測可能改變肌聯(lián)蛋白的氨基酸序列［4，15］。此外，有報道顯示純合子或非典型剪接TTN基因突變也可致兒童嚴重的DCM表型［8］。基因型-表型分析研究表明DCM的表型及其嚴重性與TTNtv發(fā)生的位置高度相關［15］。多項研究表明TTNtv多發(fā)生于A帶區(qū)域，少部分TTNtv發(fā)生于I帶、Z盤和M線區(qū)域，并且發(fā)生于A帶或M線區(qū)域的TTNtv患兒常表現(xiàn)為更嚴重的DCM，預后差［14-16］。A帶區(qū)域含有高比例的不對稱外顯子，TTNtv可能會改變翻譯閱讀框，使其更容易產(chǎn)生異常的肌聯(lián)蛋白［16］。有超過1/3的TTNtv可進行選擇性剪接，特別是發(fā)生于I帶區(qū)域的外顯子［16］。選擇性剪切補救機制，可減輕TTNtv產(chǎn)生的影響，因此發(fā)生于I帶區(qū)域的DCM表型相對較輕［16］。Z盤區(qū)域肌聯(lián)蛋白表達減少可能導致Z盤結構破壞和功能受損［17］。研究認為Z盤區(qū)域TTNtv的致病性較低，可能是與Z盤TTNtv外顯子的組成性表達較低相關［18］。Biquand等［19］研究顯示對發(fā)生于M線區(qū)域Mex5外顯子（編碼插入序列7）缺失的小鼠可導致嚴重的DCM表型，其心室進行性擴張，心室肌伴有廣泛的纖維化，同時還伴有興奮-收縮偶聯(lián)蛋白的異常表達。攜帶位于M線區(qū)域的TTNtv患兒常表現(xiàn)為早期危及生命的DCM表型，多數(shù)患兒病程早期即發(fā)生死亡［8，15］。兒童DCM早期發(fā)病或預后不良是否與TTNtv多發(fā)生于A帶、M線區(qū)域或同時合并其他致病基因相關有待進一步研究。

2.2 肌聯(lián)蛋白亞型的轉錄調(diào)控可能與DCM相關

調(diào)控肌聯(lián)蛋白亞型轉錄可能是治療收縮和/或舒張功能障礙性DCM的潛在靶點。在健康成年人的心肌組織中（主要為左心室）肌聯(lián)蛋白N2BA亞型占30%~40%，N2B亞型占60%~70%，同時在正常衰老過程中此比例也保持相對恒定［7-8］。N2B亞型和N2BA亞型的正常比例，決定著肌聯(lián)蛋白的延伸性和被動張力，如N2BA亞型比例增多則肌原纖維被動張力降低，其心室收縮功能障礙；N2B亞型占比增多則肌原纖維變得僵硬，其心室舒張功能降低［4，7-8］。有研究發(fā)現(xiàn)在終末期DCM患者中，其肌聯(lián)蛋白亞型主要為較長、較柔軟的N2BA亞型［11］。廣泛的mRNA剪接可產(chǎn)生不同類型的肌聯(lián)蛋白亞型，N2BA亞型的表達可由剪接因子RNA結合基序蛋白-20（RNA binding motif protein 20，RBM20） 調(diào)控［11］。RBM20是一種RNA剪接因子，參與mRNA成熟的過程，可與剪接位點附近的內(nèi)含子、U1和U2小核核糖蛋白（snRNP）結合位點結合，調(diào)控肌聯(lián)蛋白亞型轉換［11］。RBM20缺失可使肌聯(lián)蛋白N2BA亞型的表達顯著升高，致使肌原纖維主動和被動張力降低，從而導致心室擴張［11］。對于舒張性心力衰竭，有研究表明包括地高辛和洋地黃在內(nèi)的強心苷，可以有效降低RBM20水平，可使肌聯(lián)蛋白更傾向于N2BA亞型表達，以改善其舒張功能［11］。有研究發(fā)現(xiàn)胰島素和三碘甲腺原氨酸都能調(diào)節(jié)RBM20的表達和活性通路［7］。最近有學者對大鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)三碘甲腺原氨酸或胰島素可上調(diào)RBM20表達和激活雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）激酶軸，從而使肌聯(lián)蛋白傾向于N2B亞型表達［11，20］。另一種可以轉錄修飾肌聯(lián)蛋白的分子是RNA結合基序蛋白24。有研究表明，在小鼠動物模型中敲除RNA結合基序蛋白24可導致DCM［11］。該研究也顯示，微RNA能夠通過與mRNA結合，使mRNA靶向降解來調(diào)控肌聯(lián)蛋白的轉錄，并在攜帶TTNtv的DCM小鼠模型中證實了一種微RNA（miR-208b）顯著表達［11］。但miR-208b對肌聯(lián)蛋白亞型調(diào)控的確切機制尚未不明確。

2.3 肌聯(lián)蛋白彈簧元件的翻譯后修飾

除了轉錄修飾外，肌聯(lián)蛋白也可通過翻譯后磷酸化、氧化、乙?；刃揎椄淖兤浼≡w維延伸性和被動張力［4，7］。肌聯(lián)蛋白最常見的翻譯后修飾是磷酸化［7］。有研究發(fā)現(xiàn)攜帶TTNtv的DCM患者，其左心室中的肌鈣蛋白I和肌聯(lián)蛋白結合蛋白-C（myosin binding protein-C，MyBP-C）的磷酸化水平顯著降低，肌聯(lián)蛋白磷酸化水平的降低可加重心室功能進一步惡化，最終導致心力衰竭［17］。基于蛋白質(zhì)組學分析，預測肌聯(lián)蛋白上有數(shù)百個磷酸化位點，但當前認為只有少數(shù)幾個磷酸位點與肌聯(lián)蛋白的結構和功能相關，其大多位于I帶區(qū)域，主要包括PEVK和N2Bus區(qū)域［4，8，10］。I帶區(qū)域內(nèi)的PEVK元件含有豐富的脯氨酸、谷氨酸、纈氨酸和賴氨酸，具有高度的可擴展性。當前認為N2Bus元件也具有許多磷酸位點，由幾種不同的激酶介導，包括蛋白激酶A、蛋白激酶G、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2和鈣調(diào)素激酶Ⅱδ等［8］。差異性磷酸化已被證明可直接改變心肌細胞的長度和張力，激活PEVK元件可增強心肌細胞被動張力有助于心室收縮，避免心室進一步擴張；然而激活N2Bus元件的磷酸化可使心肌纖維變長、被動張力降低，加重心室擴張［8］。Hidalgo等［21］通過激活蛋白激酶C磷酸化PEVK元件，發(fā)現(xiàn)小鼠和豬的心肌細胞被動張力可增加20%~30%。通過調(diào)控肌聯(lián)蛋白上的磷酸位點有望治療DCM，但其具體機制仍需進一步研究。

2.4 單倍體劑量不足

當前關于單倍體劑量不足的機制導致DCM仍存在一定爭論。單倍體劑量不足動物模型顯示TTNtv并不直接損傷肌節(jié)，而是通過增加代謝應激，從而對心肌細胞和心室功能產(chǎn)生慢性毒害作用［22］。TTNtv導致產(chǎn)生異常的mRNA轉錄本，致使無意義mRNA衰減增加，由此TTN等位基因表達減少，基因表達減少可能增加代謝應激，代謝的改變可導致mTOR復合物-1信號通路激活，從而致使異常肌聯(lián)蛋白合成和自噬相關的致病反應，最終導致DCM表型［4，11］。有研究對TTNtv大鼠單倍體劑量不足建模研究，并用RNA-seq研究揭示了TTNtv等位基因介導的無意義mRNA衰減增加表明單倍體劑量不足［22］。除單倍體劑量不足外，有研究還發(fā)現(xiàn)TTNtv導致大鼠心肌耗氧率降低，活性氧水平升高，線粒體蛋白泛素化水平升高，提示TTNtv導致線粒體功能障礙［23-24］。此外還有研究發(fā)現(xiàn)TTNtv導致DCM患者的iPSC心肌細胞對異丙腎上腺素、Ca2+和血管緊張素Ⅱ等反應減弱［11］?？傊?，由TTNtv導致的DCM中可觀察到心肌代謝、線粒體功能和鈣離子處理等異常，這些病理性改變是直接來自TTNtv，還是機體代償性改變帶來的病理變化也有待研究證實。

2.5 TTNtv導致的DCM與環(huán)境因素相關

TTNtv導致DCM的發(fā)病年齡常見于0~40歲，但當與年齡、性別、藥物、酒精、妊娠或獲得性疾病等風險因素相結合時，可加重DCM［11］。發(fā)病年齡越小，其預后多不良，對傳統(tǒng)的治療療效欠佳［1］。化療藥物也可誘發(fā)、加重TTN基因突變相關的兒童DCM［11］。最近在蒽環(huán)類化療藥物誘導的心肌病患者中發(fā)現(xiàn)了TTNtv，同時還觀察到TTNtv可能與化療藥物誘導的嚴重心肌病相關［11，25］。酒精是一種常見的環(huán)境風險因素，與TTNtv導致的DCM預后不良相關，在酗酒伴TTNtv的DCM患者中可以觀察到其左心射血分數(shù)下降得更顯著［26］。同時TTNtv還與圍生期心肌病的風險增加有關［11］。TTNtv的外顯率還與性別相關。有研究顯示男性DCM發(fā)病的中位年齡為28歲，女性為56歲，攜帶TTNtv的女性DCM患者比男性患者預后好［27］。雌激素是否對TTNtv導致的DCM具有保護作用，從而導致了性別相關的差異，有待進一步研究。

3 TTNtv可導致的臨床表型

兒童DCM具有顯著的遺傳異質(zhì)性，患兒同時可攜帶多個基因變異，受環(huán)境因素的影響及發(fā)病年齡依賴的外顯率等特點，可使患兒的臨床表型時有重疊［2，11］。編碼肌聯(lián)蛋白的基因突變與多種骨骼肌病和心肌病相關，其中最常見的表型為DCM，其相關臨床表型見表1［8，11，25］。TTNtv攜帶者的發(fā)病年齡與其臨床表型的嚴重程度密切相關，對于兒童時期發(fā)病的TTNtv患者常表現(xiàn)為危及生命的 DCM表型，預后不良［1，13］。成人TTNtv攜帶者通常會在中年或晚年才表現(xiàn)出DCM相關臨床癥狀，但有證據(jù)表明TTNtv攜帶者在出現(xiàn)DCM相關癥狀前，心臟MRI可檢測到其心功能障礙和/或偏心性心室重構［11］。此外，包括肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）、限制型心肌?。╮estrictive cardiomyopathy，RCM）、致心律失常型右心室心肌?。?arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC）和圍生期心肌病等也有報道［11，25］。在 HCM 中，TTNtv占比約為 1.3%~4%，但當前對RCM、ARVC攜帶TTNtv報道得較少［8］。也有研究報道TTNtv可能與約16%的家族性房顫和約 5% 的早發(fā)性房顫相關［28］。Enriquez等［29］也研究發(fā)現(xiàn)攜帶TTNtv的DCM患者中，約65%的患者發(fā)生過快速性房性心律失常，并且多數(shù)患者早期只表現(xiàn)為快速性房性心律失常，隨著病程進展才出現(xiàn)DCM相關表現(xiàn)；隨訪2年并發(fā)現(xiàn)約53%的患者發(fā)生過室性心動過速復發(fā)，約27%的患者需要心臟移植、機械循環(huán)支持或死亡。特發(fā)性/家族性DCM中攜帶TTNtv可作為預測早期發(fā)生心律失常的獨立危險因素，攜帶TTNtv的DCM患者有增加發(fā)生室性心律失常的風險，同時還應考慮到與年齡依賴相關的外顯率，并建議對未受影響的攜帶者進行長期隨訪［30］。

表1 與TTN基因變異相關的臨床表型/疾病

4 基因治療有望治愈TTNtv相關的DCM

當前兒童DCM的治療方法多為糾正紊亂的繼發(fā)性病理生理改變，包括神經(jīng)體液過度激活和心室重構。對于基因治療，反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，AON）介導的外顯子跳躍療法可能是治愈TTNtv導致DCM的潛在手段。在AON介導的這種治療方法中，單鏈寡核苷酸被設計為結合突變內(nèi)含子-外顯子邊界前mRNA，或阻斷外顯子剪接基因序列，其目標是通過選擇性剪接跳過包含移碼突變的外顯子，從而恢復閱讀框防止翻譯過程中肌聯(lián)蛋白的早期終止［11，31-32］。美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準了一種外顯子跳躍療法用于杜氏肌營養(yǎng)不良癥［6］，希望類似的基因治療策略也可用于治療TTNtv導致的DCM。AON介導的外顯子跳躍療法治療DCM的可行性已經(jīng)在小鼠模型中得到了驗證，該方法可使肌聯(lián)蛋白表達正常，并可挽救TTN基因突變導致DCM表型，但目前尚不清楚這種治療策略是否能夠逆轉已經(jīng)存在的DCM表型［32］。此外還應該特別關注外顯子跳躍治療也可能會發(fā)生脫靶效應［10］。此外，包括mTOR抑制劑雷帕霉素和人誘導多能干細胞來源的心肌細胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte，hIPSC-CM）治療TTNtv相關DCM也有研究報道［11］，但當前認為hIPSC-CM技術存在一定局限性，其產(chǎn)生的心肌細胞相對不成熟，常表達較柔軟的N2BA亞型，其功能效應也有待進一步驗證。總之AON介導的外顯子跳躍療法為治愈DCM帶來了新希望，未來外顯子跳躍療法很有可能成為突破傳統(tǒng)DCM的治療手段。

綜上所述，TTNtv是DCM最常見的遺傳突變，盡管當前對TTNtv導致DCM的發(fā)病機制存在較大爭議，但研究了解TTN基因突變相關兒童DCM的分子發(fā)病機制，有助于這部分患兒的預后評估及精準治療。TTNtv導致兒童DCM的遺傳分子機制與成人是否存在差異，也有待進一步研究。此外，臨床工作中如何精準評估TTNtv的致病性也是當前所要面臨的重大挑戰(zhàn)。隨著基因檢測成本的持續(xù)下降，基因診斷、精準治療將會是未來醫(yī)學發(fā)展的大趨勢。進一步深入研究TTNtv導致DCM和心律失常的遺傳分子機制，可為精準治療TTN基因突變相關的DCM患者帶來新希望。