陳若曦，張益生，李焱，孫孝亞

1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；3.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046； 4.河南省中藥資源與中藥化學重點實驗室，河南 鄭州 450046

蕁麻疹俗稱“風疹塊”，是由于皮膚、黏膜小血管擴張及滲透性增加而出現(xiàn)的一種局限性水腫反應，可在24小時內(nèi)自行消退，但會反復發(fā)生[1]。約半數(shù)的慢性蕁麻疹患者的癥狀持續(xù)2年，20%患者的癥狀持續(xù)10年[2]，為患者帶來巨大痛苦?？菇M胺藥是蕁麻疹的一線治療藥物，但心臟病患者、孕婦及哺乳期婦女需慎用。此外，嗜睡是抗組胺藥的常見并發(fā)癥，極大限制了抗組胺藥在臨床的廣泛使用。哮喘是一種低氣道的慢性異質(zhì)性疾病，其特征是慢性炎癥和氣道反應過度，癥狀有咳嗽、喘息、呼吸困難和胸悶[3]。2010—2012年由中國哮喘聯(lián)盟組織的支氣管哮喘的流行病學和發(fā)病相關(guān)危險因素的流行病學調(diào)查(CARE研究)顯示，中國大陸地區(qū)成人哮喘的患病率為1.24%，據(jù)估計我國大約有3 000萬哮喘患者，而過敏性哮喘是其中一個重要的表型，占成人哮喘50%以上，在兒童哮喘中達80%以上[4]。

玉屏風散最早記載于《丹溪心法》，由黃芪、白術(shù)、防風三味藥組成，有益氣固表止汗，扶正祛邪之效，廣泛使用于蕁麻疹、過敏性哮喘、過敏性鼻炎、汗出異常等疾病的治療中。多項研究表明，玉屏風散治療蕁麻疹及過敏性哮喘具有平穩(wěn)控制癥狀、減少病情復發(fā)、提高患者生活質(zhì)量等特點[5-8]。蕁麻疹和過敏性哮喘分別為皮膚科和呼吸科常見過敏性疾病，《醫(yī)宗金鑒·外科心法》中記載蕁麻疹“由汗出受風，或露臥乘涼，風邪多中表虛之人”?！端貑枴ぬ庩柮髡摗吩唬骸胺纲\風虛邪者陽受之，陽受之則入六府，入六府則身熱，上為喘呼?！笔n麻疹和過敏性哮喘的發(fā)病都是由于表虛感受外襲風邪，均屬于玉屏風散的主治范疇。中醫(yī)認為“肺主皮毛”，其理論源自《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問·五臟生成》云：“肺之合皮也，其榮毛也?！薄端貑枴そ?jīng)脈別論》云：“肺朝百脈，輸精于皮毛。”《金匱翼·咳嗽統(tǒng)論》云：“皮毛者肺之合，皮毛受邪，必內(nèi)合于肺。”這些論述從中醫(yī)角度揭示了肺系疾病和皮膚病之間存在生理與病理的關(guān)系。本文通過構(gòu)建玉屏風散和蕁麻疹、過敏性哮喘之間的藥物-潛在靶點網(wǎng)絡，分析玉屏風散治療蕁麻疹和過敏性哮喘可能的機制，并通過分子對接進行驗證，從分子層面解釋玉屏風散對于蕁麻疹和過敏性哮喘異病同治的機制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點的搜集通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com)檢索玉屏風散組方中藥黃芪、白術(shù)、防風的化學成分，設定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，篩選得到玉屏風散的生物活性成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索活性成分的靶點蛋白，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)對靶點進行標準化命名。

1.2 蕁麻疹及過敏性哮喘疾病靶點的獲取通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//omim.org)進行疾病靶點的檢索，得到蕁麻疹和過敏性哮喘相關(guān)全部靶點，并將兩種疾病的靶點進行匯總?cè)〗患?/p>

1.3 玉屏風散治療蕁麻疹及過敏性哮喘的潛在靶點的獲取及蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建將玉屏風散靶點與疾病交集靶點導入R4.0.0軟件繪制Venn圖，從而得到藥物與疾病靶點的交集，即為玉屏風散治療蕁麻疹及過敏性哮喘的潛在靶點。使用Cytoscape3.8.0繪制“藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”交互網(wǎng)絡圖。利用String數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org)，物種設置為“Homo sapiens”，設置中等置信度“medium confidence=0.4”，得到蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡，并使用Cytoscape 3.9.0對PPI網(wǎng)絡進行優(yōu)化。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析利用R4.0.0軟件，安裝Bioconductor的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview程序包，以p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05為標準，對潛在靶點進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。

1.5 分子對接選擇玉屏風散中度值排名靠前的活性成分與疾病的核心靶點進行分子對接驗證。在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)獲取核心靶點蛋白結(jié)構(gòu)；在PubChem 數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取主要成分化合物結(jié)構(gòu)。使用Autodock軟件進行分子對接，并將對接結(jié)果使用PyMOL進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 玉屏風散主要活性成分及靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索到黃芪活性成分87個，白術(shù)活性成分55個，防風活性成分173個。設置OB≥30%和 DL≥0.18進行篩選后獲得主要活性成分共45個。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到主要活性成分對應的作用靶點723個。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中獲取到標準化命名的靶點共305個。

2.2 蕁麻疹及過敏性哮喘疾病靶點在GeneCard數(shù)據(jù)庫中檢索到蕁麻疹相關(guān)靶點976個，過敏性哮喘相關(guān)靶點7 507個。在OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到過敏性哮喘相關(guān)靶點35個，未檢索到蕁麻疹相關(guān)靶點。將疾病靶點去除重復值后取交集，得到交集靶點386個。

2.3 玉屏風散治療蕁麻疹和過敏性哮喘的潛在靶點及“藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡取玉屏風散靶點及蕁麻疹和過敏性哮喘共同靶點繪制Venn圖，得到玉屏風散與蕁麻疹和過敏性哮喘共同靶點的交集靶點24個，即為玉屏風散治療蕁麻疹和過敏性哮喘的潛在靶點，見圖1。使用Cytoscape 3.8.0軟件繪制“藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”交互網(wǎng)絡圖，見圖2，圖中綠色節(jié)點代表玉屏風散主要活性成分，紫色節(jié)點代表潛在靶點，連線代表相互作用，連線越密集代表相互作用越強。圖中與潛在靶點連線最為密集的活性成分為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、漢黃芩素(wogonin)，由此可看出，玉屏風散中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、漢黃芩素成分在方中起著關(guān)鍵作用，可能是玉屏風散治療蕁麻疹和過敏性哮喘的核心成分。圖中玉屏風散中部分活性成分可對應多個疾病靶點，而部分疾病靶點也可對應多個活性成分，提示玉屏風散治療蕁麻疹及過敏性哮喘具有多成分、多靶點的特點。

圖1 玉屏風散活性成分靶點與蕁麻疹、過敏性哮喘靶點交集Venn圖

圖2 “藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”交互網(wǎng)絡圖

2.4 PPI網(wǎng)絡將24個潛在靶點導入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡共有24個點，107條邊，平均節(jié)點度值(average node degree)8.92。通過R計算出各靶點的degree值，排名前10位的靶點為白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3，CASP3)、缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF1A)、酪氨酸激酶受體2(epidermal growth factor receptor 2，ERBB2)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(insulin like growth factor binding protein 3，IGFBP3)、血管細胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)，提示這些靶點在玉屏風散治療蕁麻疹和過敏性哮喘中具有重要意義。使用Cytoscape3.9.0軟件設置節(jié)點的度值與節(jié)點的顏色深度成正比，顏色越深表明該節(jié)點在整個網(wǎng)絡中發(fā)揮的作用越大，并將節(jié)點依據(jù)度值排列，優(yōu)化后的PPI網(wǎng)絡見圖3。

圖3 Cytoscape優(yōu)化的PPI網(wǎng)絡圖

2.5 GO功能富集分析將PPI網(wǎng)絡中的24個潛在靶點進行GO功能富集分析，以P<0.05，q<0.05 為標準，共獲得81個統(tǒng)計學顯著的結(jié)果，其中38個生物過程條目，43個分子功能條目，無細胞組分條目。將排名前20位的條目繪制成條形圖，見圖4，其中，生物過程有整合素結(jié)合(integrin binding)、谷胱甘肽結(jié)合(glutathione binding)、寡肽結(jié)合(oligopeptide binding)等；分子功能有乙酰膽堿受體活性(acetylcholine receptor activity)、G蛋白耦聯(lián)血清素受體活性(G protein-coupled serotonin receptor activity)、血清素受體活性(serotonin receptor activity)、G蛋白耦聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(G protein-coupled neurotransmitter receptor activity)。提示玉屏風散通過調(diào)控多靶點、多種生物過程對蕁麻疹和過敏性哮喘的治療產(chǎn)生影響。

圖4 GO功能富集分析

2.6 KEGG信號通路富集分析將PPI網(wǎng)絡中的24個潛在靶點數(shù)據(jù)進行KEGG信號通路富集分析，以P<0.05，q<0.05為標準共獲得93個統(tǒng)計學顯著的結(jié)果，將排名前20位的通路繪制成氣泡圖，見圖5，結(jié)果顯示，玉屏風散治療蕁麻疹和過敏性哮喘可通過多種信號通路、疾病通路及代謝通路發(fā)揮作用，包括癌癥中蛋白聚糖通路、糖尿病并發(fā)癥中的糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycosylation end products-receptor of advanced glycosylation end products，AGE-RAGE)信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt)信號通路等。

圖5 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

2.7 分子對接結(jié)果研究表明，黃芪中的主要成分黃芪甲苷可改善小鼠氣道炎癥、抑制氣道高反應、緩解哮喘進展[9-10]；防風中的升麻素具有顯著的抗過敏作用及抗特應性皮炎作用[11-12]。在Pubchem數(shù)據(jù)庫中未查詢到升麻素的3D結(jié)構(gòu)，故將黃芪甲苷和玉屏風散中連線數(shù)排名前3位的化學成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇與度值排名前3位的潛在靶點IL-6、VEGFA、EGFR進行分子對接，結(jié)果顯示，玉屏風散主要成分與潛在核心靶點具有較強的結(jié)合能，見表1。使用PyMOL將對接結(jié)果進行可視化處理，其中黃芪甲苷與關(guān)鍵靶點的對接模式圖見圖6。

注：A：黃芪甲苷與IL-6；B：黃芪甲苷與VEGFA；C：黃芪甲苷與EGFR

表1 主要活性化合物與核心靶點分子對接結(jié)果 (kcal·mol-1)

3 討論

蕁麻疹的發(fā)病機制目前尚未明確，其同時具有自身免疫性和變態(tài)反應性疾病特征，核心環(huán)節(jié)是肥大細胞釋放組胺和其他炎癥因子，進一步導致皮膚血管擴張[13]。過敏性哮喘是支氣管哮喘的一個重要表型，是一種由過敏原引起和觸發(fā)的一類哮喘，主要由Th2免疫反應驅(qū)動，發(fā)病涉及特應質(zhì)、過敏反應或變態(tài)反應[4]。在臨床治療蕁麻疹和過敏性哮喘中聯(lián)合使用玉屏風散可減少疾病復發(fā)，提高治愈率。網(wǎng)絡藥理學將中藥作用網(wǎng)絡與疾病生物網(wǎng)絡整合在一起，分析藥物在此網(wǎng)絡中與特定節(jié)點的相互作用關(guān)系，從而理解藥物和機體的相互作用，科學預測中藥治療疾病的有效機制[14]。

本研究通過挖掘玉屏風散與蕁麻疹和過敏性哮喘的交集靶點發(fā)現(xiàn)，玉屏風散中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、漢黃芩素等成分可對應多個疾病交集靶點。槲皮素、山柰酚、漢黃芩素均為黃酮類化合物，具有抗炎作用。研究證實，槲皮素可顯著抑制白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)等炎癥因子的生成從而發(fā)揮抗炎作用，且抗炎作用與劑量呈正相關(guān)關(guān)系[15-17]。山柰酚能夠抑制脂多糖及ATP誘導的心肌成纖維細胞中PI3K和AKT蛋白的磷酸化，從而減輕炎癥因子造成的損傷[18]，還可降低銀屑病小鼠皮損中IL-17A、IL-6、TNF-α等促炎因子水平，從而減輕皮膚損傷及炎癥[19]。漢黃芩素可通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt/ mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/m TOR)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和NF-κB信號通路而激活樹突狀細胞，并介導細胞因子TNF-α和IL-6的釋放以產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用[20]，還可通過誘導中性粒細胞凋亡和抑制氣道平滑肌細胞的遷移，從而改善中性粒細胞性哮喘氣道炎癥及重塑[21]。β-谷甾醇是植物中甾醇類成分之一，其生理活性豐富多樣，包括通過下調(diào) IL-1β、IL-6和TNF-α水平，改善炎癥反應[22]。

“藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡和PPI網(wǎng)絡分析顯示，玉屏風散治療蕁麻疹及過敏性哮喘主要作用于IL-6、VEGFA、EGFR、CASP3、HIF1A等靶點。IL-6可刺激VEGF的釋放，產(chǎn)生強烈的血管通透效應，加劇炎癥的產(chǎn)生。已有研究證實，慢性蕁麻疹患者血清中IL-6水平升高[23]。此外，IL-6也可引起異常的免疫應答，進而引發(fā)呼吸道變態(tài)反應性炎癥，在呼吸道變態(tài)反應性疾病的免疫病因?qū)W中起重要作用[24]。VEGFA是VEGF成員之一，作為促血管生成因子在促進內(nèi)皮細胞的存活、遷移、增殖以及增強血管通透性中發(fā)揮作用[25]。VEGF被認為是調(diào)節(jié)哮喘氣道血管生長的主要因子[26]，而血管通透性升高、炎癥介質(zhì)釋放是蕁麻疹重要的病理過程，因此推測玉屏風散可通過調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放、改善血管通透性進而改善過敏性哮喘及蕁麻疹的癥狀。EGFR是一種表皮細胞保護因素，EGFR降低可導致IL-6等促炎因子釋放引起炎癥反應，介導角質(zhì)細胞凋亡及組織損傷[27]。

GO富集分析共得到81個生物過程，結(jié)果顯示玉屏風散主要是通過對乙酰膽堿受體活性、G蛋白耦聯(lián)血清素受體活性、血清素受體活性、G蛋白耦聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、整合素結(jié)合等的調(diào)控發(fā)揮對蕁麻疹和過敏性哮喘的治療作用。KEGG富集共得到93條信號通路，其中癌癥中蛋白聚糖通路、PI3K-Akt信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、人類巨細胞病毒感染通路等是玉屏風散治療蕁麻疹和過敏性哮喘的主要信號通路。PI3K-Akt信號通路是研究最完整的細胞信號通路之一，參與調(diào)控細胞的代謝、增殖、分化和凋亡等生物過程，并在腫瘤、自身免疫性疾病、纖維增生性疾病等中都存在異常表達[28]。PI3K-Akt可以激活NF-κB通路，誘導 IL-6等促炎因子、趨化因子、黏附分子及炎癥級聯(lián)反應相關(guān)酶的表達，進而趨化炎癥細胞浸潤，導致炎癥反應的發(fā)生[29]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt信號通路可抑制氧化應激反應的過度激活，進而減輕細胞凋亡和血管損傷等，以促進創(chuàng)面的愈合[30]，還可廣泛參與哮喘的炎癥、變態(tài)反應、氣道重塑等病理過程[31]。藥理學研究也證實，槲皮素和漢黃芩素均具有抑制PI3K-Akt信號通路的作用[32-33]。GO和KEGG富集分析表明玉屏風散治療蕁麻疹和過敏性哮喘的機制多重且復雜，尚需進一步實驗以明確各途徑在疾病中的調(diào)控作用。

活性成分與核心靶點之間的結(jié)合能越低，表明兩者之間有較好的結(jié)合力，普遍認為結(jié)合能小于0 kcal·mol-1時受體分子與配體分子可以自主結(jié)合，本研究中各主要成分與核心靶點之間的結(jié)合能均小于0 kcal·mol-1，結(jié)合位點均有穩(wěn)定的氫鍵形成，其中IL-6與山柰酚、VEGFA與山柰酚、VEGFA與β-谷甾醇、CASP3與β-谷甾醇的結(jié)合能小于-5 kcal·mol-1，表明玉屏風散的主要活性成分能與蕁麻疹和過敏性哮喘的核心靶點穩(wěn)定結(jié)合，從而起到治療疾病的作用。

綜上所述，玉屏風散可通過相同的多個成分、靶點、通路治療蕁麻疹和過敏性哮喘，發(fā)揮異病同治作用，為后續(xù)中藥的異病同治研究提供理論基礎(chǔ)。但本文僅局限于網(wǎng)絡藥理學與分子對接的生物信息學研究，中藥復方的量效關(guān)系及玉屏風散的作用機制仍需進一步實驗驗證。下一步研究擬以蕁麻疹及過敏性哮喘小鼠模型為研究對象，并采用玉屏風散進行干預，通過檢測蕁麻疹小鼠腹腔肥大細胞及過敏性哮喘小鼠氣道分泌物中IL-6、VEGFA、EGRF等因子的變化，進一步驗證玉屏風散對于蕁麻疹及過敏性哮喘“異病同治”的作用機制。